蘇迪, 鮑恩俁, 王進(jìn)

(貴州師范大學(xué)喀斯特研究院, 國家喀斯特石漠化防治工程技術(shù)研究中心, 貴陽 550001)

喀斯特地貌覆蓋全球20%左右的無冰陸地面積[1]，貴州省喀斯特地區(qū)是我國西南喀斯特地貌中的核心區(qū)域，是我國乃至全世界連片面積最大、發(fā)育最完全的喀斯特片區(qū)之一[2]?？λ固厣鷳B(tài)系統(tǒng)脆弱，生態(tài)容易被破壞，出現(xiàn)土壤 “石漠化”現(xiàn)象。再加上喀斯特生境基巖多為石灰?guī)r類，因此，喀斯特地區(qū)巖石容易裸露，土壤具有較高的鈣含量。為適應(yīng)喀斯特地區(qū)這一典型的鈣生性環(huán)境，形成了一系列具有適應(yīng)高鈣性、巖生性的喀斯特植物[3]。鈣是植物生長的必需元素之一，同時(shí)是重要的第二信使，對植物生理功能有重要影響[4]。近年來，國內(nèi)外在植物鈣生適應(yīng)方面取得了一定研究進(jìn)展[5-6]，但還存在很多空白。鈣生環(huán)境是喀斯特地貌中一個(gè)極其重要的生境，因此研究植物適應(yīng)鈣生土壤，是研究喀斯特生態(tài)系統(tǒng)中的重要一環(huán)，對于植被修復(fù)喀斯特石漠化具有十分重要的意義。報(bào)春苣苔屬(Primulina)是我國喀斯特植物的一個(gè)重要類群, 該屬植物的地理分布具有高度的土壤專一性，絕大多數(shù)物種僅分布在石灰?guī)r基巖土壤[7]。因此，報(bào)春苣苔屬植物是喀斯特地區(qū)高鈣環(huán)境適應(yīng)機(jī)制研究的理想材料之一。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要部分，對于土壤物質(zhì)循環(huán)起到重要作用[8]。植物-土壤微生物交互作用是陸地生態(tài)系統(tǒng)中極其重要的研究內(nèi)容，涉及碳固定、營養(yǎng)元素循環(huán)和溫室氣體排放等生態(tài)問題[9-11]。土壤根際微生物與植物根系相互作用密切，它參與根際生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和循環(huán)，對植物的生長發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)性具有重要作用[12-13]。不同植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)存在極大差異[14]，甚至同種植物不同基因型的根際微生物群落之間也存在差異[15]。植物根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的特異性，它是植物-微生物根際互作機(jī)制的重要研究內(nèi)容之一。因此，研究不同植物的根際微生物對于解析植物-微生物交叉互作機(jī)制是極其重要的，有利于解析植物的高度專一性地理分布機(jī)理。

適鈣植物是喀斯特地區(qū)重要的自然資源，是喀斯特生態(tài)系統(tǒng)中極其重要的植被資源，研究喀斯特適鈣植物根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)變化是適鈣植物-微生物根際互作適應(yīng)機(jī)制的重要基礎(chǔ)之一，對喀斯特土壤生態(tài)系統(tǒng)的研究具有重要意義。本研究通過高通量測序報(bào)春苣苔根際微生物的16S rRNA V4和ITS1區(qū)序列，解析了報(bào)春苣苔根際微生物群落結(jié)構(gòu)，分析了土壤鈣對適鈣植物根際微生物群落的影響，以期為解析喀斯特適鈣植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)、研究根際微生物對喀斯特植物適鈣機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 土壤采樣

本研究采集報(bào)春苣苔(PrimulinatabacumHance)的根際土壤樣品。將植株從土壤中采出，然后收集抖動(dòng)掉落的土壤。就近采集1 m外的非植物根際外周土壤樣品。采集土壤樣品無菌袋分裝，4 ℃運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室后，-80 ℃凍存。分別采集非植物根際外周土壤(bulk soil，BS)和根際土壤(rhizosphere soil，RSS)樣品各6個(gè)。

1.2 高通量測序及分類注釋

使用MOBIO Powersoil?DNA isolation kit試劑盒，按說明書操作提取土壤樣品宏基因組DNA。以宏基因組DNA為模板，擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V4和真菌ITS1區(qū)在Illumina平臺(tái)測序。引物序列：16S rRNA V4-F (5′-GTGCCAGCM-GCCGCGGTAA-3′)、V4-R (5′-GGACTACHVGG-GTWTCTAAT-3′)和ITS1-F(5′-CTTGGTCATTT-AGAGGAAGTAA-3′)、ITS1-R(5′-GCTGCGTTC-TTCATCGATGC-3′)。根據(jù)測序數(shù)據(jù)量、GC含量、序列平均質(zhì)量等用Fastqc軟件對下機(jī)序列進(jìn)行質(zhì)控[16]。質(zhì)控后數(shù)據(jù)用QIIME軟件進(jìn)行分析[17]，使用其內(nèi)部編程去除序列兩端的引物及barcode序列，去除含嵌合體及短序列，獲得有效序列。用Uparse軟件按>97%序列聚類的原則合并OTUs(operational taxonomic units)[18]。用RDP classifier基于Greengene數(shù)據(jù)庫(http://greengenes.secondgenome. com/)對16S rRNA 細(xì)菌OTUs進(jìn)行分類注釋[19-20]；同時(shí)用blast方法基于Unit數(shù)據(jù)庫(https://unite.ut.ee/)進(jìn)行ITS1真菌OTUs注釋分析[21-22]。

1.3 土壤鈣含量測定

土壤可溶性鈣含量參照李酉開[23]的方法測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用QIIME軟件分析微生物群落多樣性指數(shù)；用R的vegan、ggplot2、psych等軟件包分析，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算及作圖。利用T檢驗(yàn)算法比較兩組土壤微生物群落的差異性。采用蒙特卡羅置換檢驗(yàn)分析土壤微生物群落與土壤鈣含量與土壤微生物群落之間的相關(guān)性，利用斯皮爾曼等級相關(guān)系數(shù)分析土壤鈣和土壤細(xì)菌菌群豐度之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控后獲得有效分析數(shù)據(jù)，對測序結(jié)果進(jìn)行測序數(shù)據(jù)量、有效數(shù)據(jù)效率、Q30等統(tǒng)計(jì)，評估測序結(jié)果質(zhì)量，結(jié)果見表1。在細(xì)菌水平，測序數(shù)據(jù)的有效數(shù)據(jù)率在90%以上，Q30達(dá)到98%以上。真菌的測序數(shù)據(jù)有效率稍低于細(xì)菌，達(dá)到80%以上，Q30也達(dá)到98%以上。數(shù)據(jù)分析說明，測序中建庫質(zhì)量較好，且不存在其他污染，獲得較好的測序結(jié)果，測序質(zhì)量可以滿足后期的分析需要。從樣品中隨機(jī)抽取一定測序數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)對應(yīng)OTUs數(shù)目，繪制對應(yīng)的稀釋曲線(圖1)。結(jié)果表明，樣本的測序數(shù)據(jù)量合理，基本覆蓋了樣品中的物種，測序質(zhì)量能滿足后續(xù)的物種分析，能較全面地反映報(bào)春苣苔根際土壤微生物群落多樣性。

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve

表1 測序質(zhì)量統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Statistical analysis of sequencing quality

2.2 報(bào)春苣苔根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)

2.2.1門水平微生物群落結(jié)構(gòu)差異 利用Uparse軟件對有效數(shù)據(jù)按>97%序列相似性進(jìn)行聚類OTUs，統(tǒng)計(jì)OTUs結(jié)果見圖2。細(xì)菌共有6 234個(gè)OTUs，其中，1 301個(gè)OTUs只存在于報(bào)春苣苔根際土壤內(nèi)，而1 357個(gè)OTUs只存在于外周土壤。真菌共有1 762個(gè)OTUs，323個(gè)OUTs只存在于報(bào)春苣苔根際土壤內(nèi)，而543個(gè)OTUs只存在于外周土壤。根據(jù)Greengene和Unit數(shù)據(jù)庫分別對細(xì)菌和真菌OTUs進(jìn)行分類注釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌分布于41個(gè)門569屬，真菌分布于6門276個(gè)屬。41個(gè)細(xì)菌門內(nèi)，6個(gè)門內(nèi)的細(xì)菌菌群相對豐度存在顯著性差異；而在真菌中，在門分類組成上無顯著性差異。分析主要門的微生物組成可知(圖2)，在報(bào)春苣苔根際土壤細(xì)菌中的優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria，27.45%±4.24%)、放線菌門(Actinobacteria，22.16%±4.42%)、酸桿菌門(Acidobacteria，15.05%±2.24%)，它們在根際土壤細(xì)菌群落占64%以上。而在非根際(外周)土壤中,優(yōu)勢菌門為變形菌門(Proteobacteria，43.23%±8.24%)、放線菌門(Actinobacteria，26.40%±7.82%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，10.30%±4.54%)，它們占非根際土壤細(xì)菌的79%以上。無論是根際還是非根際土壤中，變形菌門和放線菌門都是主要優(yōu)勢菌門，但是在報(bào)春苣苔根際土壤細(xì)菌群落中，它們的優(yōu)勢明顯下調(diào)，其他門內(nèi)細(xì)菌群落豐度升高。而在根際土壤細(xì)菌中，酸桿菌門內(nèi)菌群豐度顯著上升，成為優(yōu)勢菌門；相對的芽單胞菌門卻受到抑制，豐度顯著下降。而根際/非根際土壤真菌群落在門組成上卻沒有顯著性差異，優(yōu)勢菌門都表現(xiàn)為：子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和接合菌門(Zygomycota)，它們占所有菌群的99%以上。

注：*表示差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: * indicates significant difference at P<0.05 level.圖2 門水平上微生物結(jié)構(gòu)差異分析Fig.2 Analysis of microbial structure differences at phylum level

2.2.2屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)差異 報(bào)春苣苔的根際和非根際土壤微生物群落是非常豐富的，包含569個(gè)屬的細(xì)菌及276個(gè)屬的真菌(圖3)。分析各屬的細(xì)菌和真菌發(fā)現(xiàn)，有59個(gè)屬的細(xì)菌和48個(gè)屬的真菌只存在于報(bào)春苣苔根際土壤，而90個(gè)屬的細(xì)菌和68個(gè)屬的真菌只存在于非根際土壤中。在報(bào)春苣苔根際/非根際土壤細(xì)菌中，56個(gè)屬的細(xì)菌豐度存在顯著性差異，且細(xì)菌豐度1%以上的屬中有8個(gè)，分別是顯著升高的小梨形菌屬(Pirellula)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、變桿菌屬(Variibacter)等；顯著下降的鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、克洛氏菌屬(Crossiella)。而真菌中卻沒有差異顯著的屬。報(bào)春苣苔根際土壤微生物在屬的水平含量比較高的細(xì)菌包括Lactobacillus、H16、Gaiella、RB41屬；真菌包括傘狀霉屬(Umbelopsis)、被孢霉屬(Mortierella)。同時(shí)結(jié)果還表明，注釋到屬水平時(shí)，非根際土壤內(nèi)的微生物分類注釋水平較高，且在細(xì)菌中非根際注釋水平顯著高于根際的；并且細(xì)菌的注釋水平遠(yuǎn)高于真菌的。這可能與目前對于細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)的研究遠(yuǎn)多于真菌，以及非植物根際土壤的研究遠(yuǎn)多與植物根際土壤的研究現(xiàn)狀有關(guān)。因此，在土壤真菌群落及植物根際微生物群落等領(lǐng)域還有大量需要研究的空白。

從圖3可以看出，報(bào)春苣苔根際土壤微生物群落和非根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異是顯著的，根際土壤和非根際土壤之間對于微生物的生長環(huán)境是有差異的。推測認(rèn)為，報(bào)春苣苔的根系生長對于微生物群落結(jié)構(gòu)的影響明顯。報(bào)春苣苔的根系生長有利于酸桿菌門細(xì)菌的生長，抑制芽單胞菌門和變形菌門內(nèi)細(xì)菌。同時(shí)報(bào)春苣苔根際生長對于土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響顯著高于真菌群落結(jié)構(gòu)。

注：*表示差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: * indicates significant difference at P<0.05 level.圖3 屬水平上微生物群落結(jié)構(gòu)差異分析Fig.3 Analysis of microbial community structure difference at genus level

2.3 報(bào)春苣苔根際/非根際土壤微生物群落多樣性的差異

基于OTUs的水平，利用多樣性指數(shù)進(jìn)一步分析比較報(bào)春苣苔根際/非根際微生物群落多樣性的差異，α-多樣性結(jié)果見表2。從表2中可以看出，報(bào)春苣苔根際/非根際微生物群落中的菌群覆蓋率是沒有顯著性差異的，測序結(jié)果很好且無差異地反映了微生物群落。報(bào)春苣苔根際/非根際細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)存在顯著性差異，且報(bào)春苣苔根際細(xì)菌的α-多樣性顯著高于非根際；說明報(bào)春苣苔根際細(xì)菌菌群種類數(shù)量高于非根際土壤，報(bào)春苣苔的根系生長有利于細(xì)菌群落多樣性的升高。同時(shí)，報(bào)春苣苔根際/非根際真菌群落的PD_whole_tree指數(shù)存在顯著差異性，報(bào)春苣苔根際真菌群落的群體進(jìn)化距離小于非根際的，說明非根際真菌群落進(jìn)化更高。而報(bào)春苣苔根際/非根際細(xì)菌群落α-多樣性指數(shù)顯著高于真菌群落的，說明土壤細(xì)菌群落種類數(shù)量均遠(yuǎn)多于真菌群落。同時(shí)，土壤真菌群落的群體進(jìn)化高于細(xì)菌群落的，說明真菌的群落進(jìn)化分離程度高于細(xì)菌群落。

表2 α-多樣性分析Table 2 α-diversity analysis

總體來看，報(bào)春苣苔根際土壤微生物多樣性高于非根際土壤，這可能是由于植物生長分泌的可溶性根系分泌物影響微生物的生長進(jìn)化，促進(jìn)根際微生物群落的變化。報(bào)春苣苔根際對土壤微生物群落的影響是巨大的。

2.4 土壤鈣對根際微生物群落的影響

喀斯特地區(qū)土壤鈣含量高，報(bào)春苣苔是喀斯特地區(qū)適鈣植物之一。為了討論土壤微生物與報(bào)春苣苔根際適應(yīng)高鈣的作用，本研究采用蒙特卡羅置換檢驗(yàn)分析土壤微生物群落與土壤鈣含量與土壤微生物群落之間的相關(guān)性，結(jié)果表明，土壤鈣含量和物種分布的相關(guān)性不顯著(P=0.539)；進(jìn)一步利用斯皮爾曼等級相關(guān)系數(shù)分析各個(gè)門細(xì)菌豐度與土壤鈣含量之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有Hydrogenedentes門細(xì)菌與土壤鈣含量顯著正相關(guān)(r=0.85,P=0.031)，這說明土壤鈣含量對于報(bào)春苣苔根際/非根際微生物群落的影響非常有限，報(bào)春苣苔根際微生物群落和報(bào)春苣苔根系生長具有更為緊密的關(guān)系。

3 討論

根際微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性與植物根系分泌物和其他植物有機(jī)物質(zhì)有關(guān)[24-25]，且根系分泌物會(huì)導(dǎo)致某些類群的微生物大量繁殖，同時(shí)抑制其他微生物的生長[26]。根際微生物和植物種類、植物成分、土壤類型、土壤含水量等因素都有關(guān)系[27-30]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，有的植物有利于富集根際微生物提高根際微生物群落多樣性，例如美人蕉[31]；而有的植物根際土壤微生物群落多樣性低于非根際土壤，例如水稻[32]。同時(shí)還有研究表明，根際微生物的多樣性高于或低于非根際微生物，這和季節(jié)有關(guān)[33-34]。本研究發(fā)現(xiàn)，適鈣植物報(bào)春苣苔的根際有利于細(xì)菌的富集，細(xì)菌群落多樣性顯著高于非根際土壤微生物。且報(bào)春苣苔富集微生物的同時(shí)，還會(huì)富集有益細(xì)菌，例如小梨形菌屬(Pirellula)，它對氮循環(huán)具有十分重要的作用[35]。

不同植物的根際微生物群落之間差異很大。目前研究發(fā)現(xiàn)，玉米的根際土壤和表層土壤的優(yōu)勢細(xì)菌群落為變形菌門、Anaerolineae和酸桿菌門[36]；草莓的根際細(xì)菌優(yōu)勢菌群為變形菌門、擬桿菌門[37]；煙草根際細(xì)菌優(yōu)勢菌群為變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門[38]；施肥百合根際細(xì)菌優(yōu)勢菌群為變形菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門，真菌優(yōu)勢菌群為子囊菌門[39]；枸杞子根際優(yōu)勢真菌為子囊菌門和接合菌門[30]。本研究首次揭示了適鈣植物報(bào)春苣苔的根際細(xì)菌優(yōu)勢群落為變形菌門、酸桿菌門和放線菌門，真菌的優(yōu)勢群落為子囊菌門、擔(dān)子菌門和接合菌門。變形菌門和子囊菌門是所有植物根際土壤微生物中共存的優(yōu)勢菌門，說明在微生物群落差異的大背景下，植物根際微生物中還會(huì)有一定的共性存在，這為研究植物根際-微生物之間共性的互作機(jī)制影響提供了支撐，也表明要對適鈣植物根際-微生物群落互作機(jī)理的研究需要更多的數(shù)據(jù)，本研究僅僅才是開始。