王薇, 李泳, 王偉, 邊雪, 李熙英

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 吉林 延吉133000)

辣椒炭疽病是辣椒的主要病害之一，主要危害葉片和成熟的果實(shí)，造成落葉和果實(shí)腐爛，對(duì)辣椒生產(chǎn)威脅很大。目前，辣椒炭疽病的防治主要采用化學(xué)防治，但化學(xué)防治常導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、人畜中毒、農(nóng)田生態(tài)平衡被破壞等一系列社會(huì)問(wèn)題。因此尋找一種對(duì)環(huán)境友好的防治方法迫在眉睫。

Y-S-Y12菌株是楊樹(shù)枝條中分離到的內(nèi)生菌解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。金海強(qiáng)等[1]研究表明，Y-S-Y12菌株及其發(fā)酵濃縮液具有較廣的抑菌譜，Y-S-Y12菌株對(duì)人參銹腐病菌的抑菌率為95.01%，其發(fā)酵濃縮液對(duì)人參銹腐病菌的抑菌率為69.41%， 田間防病效果達(dá)到75.79%，同時(shí)有促進(jìn)人參生長(zhǎng)作用。

生物質(zhì)熱解液是農(nóng)業(yè)廢棄物(玉米芯、秸稈、枯枝等)通過(guò)干餾得到的煙氣經(jīng)冷凝獲得的粗產(chǎn)物，進(jìn)一步精煉提純得到pH較低的淡黃色酸性透明溶液，主要成分有酸類、酚類、醛類和酮類等，還有鉀、鈣、鋅、鎂等微量元素。生物質(zhì)熱解液在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用主要包括促進(jìn)植物生長(zhǎng)[2-4]和防治植物病蟲(chóng)害發(fā)生[5-7]等方面。目前，生物質(zhì)熱解液與化學(xué)農(nóng)藥混用方面有較多研究。韓如月等[8]研究表明，稀釋10倍的木醋液與稀釋1 000倍的農(nóng)藥惡霉靈按9∶1 復(fù)配，對(duì)大豆菌核病菌抑菌率最高，達(dá)到60%。沈國(guó)娟等[9]發(fā)現(xiàn)，生物質(zhì)熱解液與銀法利混用對(duì)辣椒疫病有增效防病和減少農(nóng)藥使用的效果。也有研究表明，生物質(zhì)熱解液與多菌靈混用，對(duì)水稻紋枯病有增效防病和減少農(nóng)藥使用的作用[10]。楊彪[11]用木醋液與戊唑醇以不同比例混配對(duì)蘋果斑點(diǎn)落葉病菌均表現(xiàn)出較好的抑制作用，其中木醋液與戊唑醇以 1∶1.4、1∶2 和 1∶11 比例混配時(shí)，增效系數(shù)SR 值分別達(dá)到14.01、13.78 和 14.88，表現(xiàn)為明顯的協(xié)同增效作用。魏琦等[12]研究表明，竹醋液分別與咪鮮胺和戊唑醇按5∶1的比例混配后均對(duì)蘋果炭疽病的抑菌具有增效作用。

以上研究均為生物質(zhì)熱解液與化學(xué)農(nóng)藥混用方面的研究，對(duì)于病菌拮抗菌發(fā)酵濃縮液與生物質(zhì)熱解液混配對(duì)植物病害防治方面的研究，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液和生物質(zhì)熱解液混配，篩選出最佳混配比例后，研究最佳比例混配溶液對(duì)辣椒炭疽病的防治效果及作用機(jī)理，為生物質(zhì)熱解液在辣椒炭疽病的無(wú)公害防治應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar medium, PDA)：100 mL蒸餾水、2 g瓊脂、2 g去皮馬鈴薯、2 g葡萄糖；金氏B固體培養(yǎng)基(King’s B medium, KB)：100 mL 蒸餾水、2 g 蛋白胨、1.5 g瓊脂、0.15 g磷酸氫二鉀、0. 15 g硫酸鎂、1.5 mL丙三醇，pH 7.2。

1.1.2供試菌種 病原菌為辣椒炭疽病菌(Pepper anthracnose)，供試拮抗菌為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) Y-S-Y12菌株，均由延邊大學(xué)植物病理研究室提供。

1.1.3生物質(zhì)熱解液 由廣州迪森集團(tuán)提供，以木屑為原料，中溫快速熱解法制造的生物油，生物油與水按體積比1∶1混合，在0.1 MPa的真空度下蒸餾，收集100～120 ℃時(shí)的蒸餾液。

1.1.4辣椒種子 景尖椒3號(hào)，購(gòu)買于延吉種子公司。

1.2 研究方法

1.2.1不同濃度的生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌試驗(yàn) 將生物質(zhì)熱解液原液加入到PDA培養(yǎng)基中，配制為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、10.0 mL·L-1共7個(gè)濃度的生物質(zhì)熱解液PDA培養(yǎng)基。用打孔器在新長(zhǎng)滿的辣椒炭疽病原菌的平板上打出直徑為7.0 mm的病菌菌餅，在含生物質(zhì)熱解液PDA平板中央放置一片菌餅，以無(wú)生物質(zhì)熱解液的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理5次重復(fù)，放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，用十字交叉法測(cè)病菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。以熱解液濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑菌率值為縱坐標(biāo)，得到毒力回歸方程，由毒力回歸方程計(jì)算得出熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的EC50值和EC90值。

1.2.2不同濃度Y-S-Y12菌株發(fā)酵液對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌試驗(yàn) 將Y-S-Y12菌株接種于裝有100 mL KB培養(yǎng)液的錐形瓶中，28 ℃、120 r·min-1震蕩培養(yǎng)48 h，作為種子菌。按照1%的接種量，在盛有100 mL KB培養(yǎng)液的錐形瓶中加入種子菌，28 ℃、120 r·min-1震蕩培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液4 000 r·min-1離心15 min，上清液再次用濾紙過(guò)濾，上清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至10 mL，高壓滅菌后即為發(fā)酵濃縮液原液。將Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液原液配制為濃度1.0、2.5 、3.0、5.0和10 mL·L-1的菌株發(fā)酵液PDA培養(yǎng)基。抑菌試驗(yàn)方法及抑菌率計(jì)算同1.2.1。

1.2.3Y-S-Y12菌株發(fā)酵液與生物質(zhì)熱解液混配的最佳配比篩選 將EC50值濃度的Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液與生物質(zhì)熱解液以0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0的比例混配，測(cè)定不同混配比例溶液的抑菌率。抑菌試驗(yàn)方法及抑菌率計(jì)算同1.2.1。計(jì)算預(yù)期抑菌率及毒力比率，計(jì)算菌落連續(xù)生長(zhǎng)第3、4、5 d的毒力比率。

預(yù)期抑菌率=(單劑A的EC50劑量實(shí)際抑菌率×配比百分率)+(單劑B的EC50劑量實(shí)際抑菌率×配比百分率)

若毒力比率明顯大于1，為增效作用；若毒力比率明顯小于1，為拮抗作用；毒力比率為1，則為相加作用。

1.2.4Y-S-Y12菌株發(fā)酵液與生物質(zhì)熱解液1∶9混劑的毒力測(cè)定 篩選發(fā)現(xiàn)Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液與生物質(zhì)熱解液以1∶9混合處理的效果最佳，將Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液與生物質(zhì)熱解液的1∶9混劑(簡(jiǎn)稱1∶9混劑)配制為濃度0.2、0.5、1、2.5、5、8和10 mL·L-1的PDA培養(yǎng)基。根據(jù)1.2.1的方法建立混劑的毒力回歸方程并計(jì)算EC50值和EC90值。所得結(jié)果參考Sun等[13]計(jì)算共毒系數(shù)(CTC)。

混配劑的理論毒力指數(shù)(TTI)=單劑A的相對(duì)毒力指數(shù)×單劑A的混配百分比+單劑B的相對(duì)毒力指數(shù)×單劑B的混配百分比

若共毒系數(shù)明顯大于100，表示增效作用；明顯小于100，表示拮抗作用；接近100，表示相加作用。

1.2.5Y-S-Y12菌株發(fā)酵液與生物質(zhì)熱解液及1∶9混劑對(duì)辣椒果實(shí)炭疽病的防病試驗(yàn) 選擇大小基本一致、無(wú)損壞的新鮮紅辣椒，用自來(lái)水反復(fù)沖洗，自然晾干后用70%酒精進(jìn)行表面消毒，晾干備用。在果蒂處和中間部位分別用接種針刺3個(gè)傷口，設(shè)置3組處理，接藥劑24 h后接辣椒炭疽病菌(A)、同時(shí)接藥劑和病菌(B)、接辣椒炭疽病菌24 h后接藥劑(C)。

接菌時(shí)傷口滴辣椒炭疽病菌菌懸液15 μL，接藥劑時(shí)傷口處滴濃度為EC90的生物質(zhì)熱解液、Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液及1∶9混劑各20 μL，每個(gè)處理10個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次，以只接病菌無(wú)藥劑處理為對(duì)照，以只接無(wú)菌水為空白對(duì)照。待晾干后用保鮮膜密封保濕置于28 ℃恒溫箱中，每天觀察記錄，出現(xiàn)病斑后統(tǒng)計(jì)辣椒發(fā)病時(shí)的病斑直徑、發(fā)病率，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

病果分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按陳娟芳等[14]的方法稍作修改，病斑直徑用十字交叉法測(cè)量。0級(jí)：無(wú)病斑；1級(jí)：0.1 cm≤病斑直徑≤0.4 cm；3級(jí)：0.4 cm<病斑直徑≤0.7 cm；5級(jí)：0.7 cm<病斑直徑≤1.1 cm，病斑上無(wú)霉層或有少量霉層；7級(jí)：1.1 cm<病斑直徑≤1.5 cm，病斑上霉層較多；9級(jí)：病斑直徑>1.5 cm，病斑上有大量霉層。

病情指數(shù)=

1.2.6Y-S-Y12菌株發(fā)酵液與生物質(zhì)熱解液及1∶9混劑處理后辣椒炭疽病菌生理指標(biāo)測(cè)定 取PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)8 d的辣椒炭疽病菌菌絲，進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定。電導(dǎo)率測(cè)定采用吳方麗[15]的方法；細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲的測(cè)定參照徐俊光[16]；總糖含量的測(cè)定采用蒽酮試劑法[17]；用考馬斯亮藍(lán)G-250法[18]測(cè)定蛋白質(zhì)含量；采用福林酚法[19]測(cè)定蛋白酶活性；幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定參考Boller等[20]；β-1,3-葡聚糖酶活性測(cè)定采用余永廷等[21]的方法。

1.2.7平板抑菌試驗(yàn) EC90濃度的生物質(zhì)熱解液、Y-S-Y12菌株發(fā)酵液及1∶9混劑分別與辣椒炭疽病菌進(jìn)行平板抑菌試驗(yàn)，試驗(yàn)方法同1.2.1。培養(yǎng)5 d后，取病菌生長(zhǎng)受抑制部位的菌絲，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8Y-S-Y12菌株發(fā)酵液與生物質(zhì)熱解液及1∶9混劑處理后辣椒葉片抗氧化酶活性測(cè)定 春季，將辣椒苗進(jìn)行田間移栽，株行距為25 cm×40 cm，每株定植2棵，移栽后進(jìn)行正常田間管理。當(dāng)辣椒植株開(kāi)花時(shí)，噴濃度均為EC90的生物質(zhì)熱解液、Y-S-Y12菌株發(fā)酵液、1∶9混劑，每隔7 d噴施一次，共噴3次，每株每次噴施50 mL。每個(gè)處理10株，重復(fù)3次。測(cè)定處理后21 d的辣椒葉片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)和過(guò)氧化氫酶(hydrogen peroxidase，CAT)活性。POD活性用愈創(chuàng)木酚法[22]進(jìn)行測(cè)定，SOD活性用NBT法[18]進(jìn)行測(cè)定，CAT活性參照王學(xué)奎[18]紫外吸收法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行整理和分析，應(yīng)用SAPSS 17.0采用Duncan多重比較法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌作用

由圖1可知，不同濃度的生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌均有抑菌作用，其抑菌率隨著濃度的升高有明顯增加的趨勢(shì)。當(dāng)生物質(zhì)熱解液的濃度為10 mL·L-1時(shí)，對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌率為100%。根據(jù)圖1數(shù)據(jù)建立生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的毒理方程，為y=0.899 3x+4.198 3，r為0.996 6，大于0.95，說(shuō)明毒力回歸方程的擬合性較好，有較大的可信度。根據(jù)毒力回歸方程求得生物質(zhì)熱解液的EC50值為2.44 mL·L-1，EC90值為10.14 mL·L-1。說(shuō)明生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的EC50和EC90濃度為分別為2.44和10.14 mL·L-1。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: Different small letters indicate statistically significant difference between different treatments at P<0.05 level.圖1 生物質(zhì)熱解液對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌作用Fig.1 Bacteriostasis of biomass pyrolysis solution on pepper anthracnose

2.2 Y-S-Y12菌株發(fā)酵液對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌作用

由圖2可知，不同濃度的Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液對(duì)辣椒炭疽病菌均有抑菌作用，其抑菌率隨著濃度的升高有明顯增加的趨勢(shì)。當(dāng)Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液的濃度為10 mL·L-1時(shí)，對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌率為77.79%。根據(jù)圖2數(shù)據(jù)建立Y-S-Y12菌株發(fā)酵液對(duì)辣椒炭疽病菌的毒理方程，為y=0.595 7x+4.209 0，r為0.953 0，大于0.95，說(shuō)明毒力回歸方程的擬合性較好。根據(jù)毒力回歸方程求得Y-S-Y12菌株發(fā)酵液對(duì)辣椒炭疽病菌的EC50和EC90濃度為分別為3.77和32.43 mL·L-1。可見(jiàn)，Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌作用，低于生物質(zhì)熱解液原液。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: Different small letters indicate statistically significant difference between different treatments at P<0.05 level.圖2 Y-S-Y12菌株發(fā)酵液對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌作用Fig.2 Bacteriostasis of Y-S-Y12 fermentation on pepper anthracnose

2.3 Y-S-Y12菌株發(fā)酵液與生物質(zhì)熱解液的最佳混配比例篩選

不同Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液與生物質(zhì)熱解液混配比例的抑菌結(jié)果見(jiàn)表1，可見(jiàn)，不同配比中，隨著Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液比例的增加，毒力比率整體呈下降趨勢(shì)。當(dāng)混配比例為1∶9和3∶7時(shí)連續(xù)3 d的毒力比率均大于1；當(dāng)混配比例為2∶8時(shí)，第4、5 d的毒力比率大于1。其中，配比為1∶9時(shí)毒力比率最大，說(shuō)明1∶9混劑的抑菌增效作用最明顯。

表1 Y-S-Y12菌株發(fā)酵液與生物質(zhì)熱解液不同配比溶液的抑菌作用Table 1 Bacteriostasis of mixtures with different ratios of Y-S-Y12 strain fermentation to biomass pyrolysis solution

2.4 不同濃度的1∶9混劑對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌作用

由圖3可見(jiàn)，不同濃度的1∶9混劑對(duì)辣椒炭疽病菌均有抑菌作用，其抑菌率隨著混劑濃度的升高有明顯的增加趨勢(shì)。當(dāng)混劑濃度為8 mL·L-1時(shí)，對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌作用最強(qiáng)，達(dá)到91.52%，且與5 mL·L-1混劑的效果無(wú)顯著差異。

根據(jù)圖3數(shù)據(jù)建立1∶9混劑對(duì)辣椒炭疽病菌的毒力回歸方程，為y= 0.995 8x+ 4.449 4，r為 0.981 9，說(shuō)明毒力回歸方程擬合較好。根據(jù)毒力回歸方程求得，1∶9混劑的EC50濃度為1.74 mL·L-1，EC90濃度為6.30 mL·L-1。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Note: Different small letters indicate statistically significant difference between different treatments at P<0.05 level.圖3 不同濃度的1∶9混劑對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌作用Fig.3 Bacteriostasis of different concentration solution with 1∶9 ratio of Y-S-Y12 strain fermentation to biomass pyrolysis solution on pepper anthracnose

可見(jiàn)，Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液、生物質(zhì)熱解液、及1∶9混劑的EC50值和EC90值中，Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液的EC50值最大，為混劑的2.17倍；其次為生物質(zhì)熱解液，其EC50為混劑的1.40倍；混劑的EC50值和EC90值最小。說(shuō)明1∶9混劑對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌作用最強(qiáng)，其次為生物質(zhì)熱解液，Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液對(duì)辣椒炭疽病菌的抑菌作用最弱。

根據(jù)以上兩種單劑的EC50值和混劑的EC50值，計(jì)算的共毒系數(shù)為123.98，明顯大于100。進(jìn)一步說(shuō)明，1∶9混劑具有明顯的增效作用。

2.5 不同藥液不同處理對(duì)辣椒果實(shí)炭疽病的防病作用

Y-S-Y12菌株發(fā)酵液、生物質(zhì)熱解液及1∶9混劑3種溶液不同處理的防病結(jié)果(表2)顯示，不管哪種藥液，預(yù)防性的先處理24 h后再接菌處理(C)的病情指數(shù)最低，防治效果最高，其次是同時(shí)接菌和處理(B)，而先接菌24 h后處理(A)的病情指數(shù)較高，但仍低于對(duì)照。Y-S-Y12菌株發(fā)酵液、生物質(zhì)熱解液及1∶9混劑的對(duì)辣椒果實(shí)炭疽病的防病處理中，A、B、C處理時(shí)，均為1∶9混劑的病情指數(shù)最低，防治效果最高，C處理達(dá)到79.26%，其次為Y-S-Y12菌株發(fā)酵液，而生物質(zhì)熱解液的防治效果最低。

表2 不同藥液不同處理對(duì)辣椒果實(shí)炭疽病的防病作用Table 2 Prevention of different treatments with Y-S-Y12 strain fermentation, biomass pyrolysis solution and their mixture with 1∶9 ratio on pepper anthracnose of pepper fruit

2.6 不同藥液處理對(duì)辣椒炭疽病菌生理指標(biāo)的影響

由表3可知，不同處理的辣椒炭疽病菌菌絲電導(dǎo)率值、蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲濃度均顯著高于對(duì)照。其中1∶9混劑處理過(guò)的辣椒炭疽病菌菌絲的電導(dǎo)率值最高，達(dá)到對(duì)照的2.05倍；其次為生物質(zhì)熱解液處理，達(dá)到對(duì)照的1.53倍。1∶9混劑和生物質(zhì)熱解液處理過(guò)的辣椒炭疽病菌的蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲濃度最高，蛋白質(zhì)外滲濃度分別為對(duì)照的1.98和1.91倍；核酸外滲濃度分別為對(duì)照的1.76和1.68倍。說(shuō)明1∶9混劑對(duì)辣椒炭疽病菌菌絲細(xì)胞膜的破壞性最強(qiáng)。

測(cè)定炭疽菌病菌的總糖含量和蛋白質(zhì)含量可以看出病菌菌絲細(xì)胞膜是否被破壞，幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶等病原真菌細(xì)胞壁降解酶是植病生防檢測(cè)的重要因素。由表3可知，不同處理的辣椒炭疽病菌菌絲的總糖含量和蛋白質(zhì)含量顯著低于對(duì)照，其中1∶9混劑處理的總糖含量和蛋白質(zhì)含量最低，分別是對(duì)照的54.45%和89.39%；其次為兩種單劑處理的總糖含量和蛋白質(zhì)含量。不同處理的辣椒炭疽病菌菌絲的蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性顯著高于對(duì)照，其中1∶9混劑處理的蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性最高，分別是對(duì)照的3.37、3.17和1.67倍。

表3 不同藥劑對(duì)辣椒炭疽病菌生理指標(biāo)的影響Table 3 Effects of Y-S-Y12 strain fermentation, biomass pyrolysis solution and their mixture with ratio of 1∶9 on physiological indexes of pepper anthracnose

2.7 不同藥液處理對(duì)辣椒炭疽病菌菌絲形態(tài)的影響

由圖4可知，在正常PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的辣椒炭疽病菌菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，分叉、分隔明顯；而經(jīng)生物質(zhì)熱解液處理的菌絲彎曲變形；經(jīng)Y-S-Y12菌株發(fā)酵液處理的菌絲膨大，分支減少；經(jīng)1∶9混劑處理的菌絲部分呈不規(guī)則膨大、溶菌、分叉處膨大、菌絲變短。

注：A：對(duì)照；B：生物質(zhì)熱解液；C：Y-S-Y12菌株發(fā)酵液；D：1∶9混劑。紅色箭頭表示菌絲稍微彎曲，黃色箭頭指菌絲膨大，藍(lán)色箭頭指溶菌。Note: A: CK; B: Biomass pyrolysis solution; C: Y-S-Y12 fermentation; D: Mixture with ratio of 1∶9. Red arrow indicates hypha slightly curved, yellow arrow indicates hyphal expansion, and blue arrow indicates hypha dissolved.圖4 不同處理的辣椒炭疽病菌的菌絲形態(tài)Fig.4 Morphology of pepper anthracnose in different treatments

2.8 不同藥液處理對(duì)辣椒葉片POD、SOD、CAT酶活性的影響

由表4可知，不同處理的辣椒葉片中SOD、POD和CAT酶活性均顯著高于對(duì)照。其中1∶9混劑處理的SOD、POD和CAT酶活性最高，分別為對(duì)照的1.26、2.26和2.70倍。生物質(zhì)熱解液處理的SOD、POD和CAT酶活性分別為對(duì)照的1.02、1.93和1.53倍；Y-S-Y12菌株發(fā)酵液處理的SOD、POD和CAT酶活性分別為對(duì)照的1.10、1.57和2.28倍。

表4 不同處理對(duì)辣椒葉片POD、CAT、SOD酶活性的影響Table 4 Effects of different treatments on activities of POD, CAT, and SOD in pepper leaves

3 討論

本研究中，與木醋液理化性質(zhì)相似的生物質(zhì)熱解液在不同濃度下對(duì)辣椒炭疽病均有明顯的抑制作用，且隨著濃度的升高抑菌效果有明顯的增加趨勢(shì)，當(dāng)生物質(zhì)熱解液的濃度為10 mL·L-1時(shí)抑菌效果最好，達(dá)到100%；辣椒果實(shí)炭疽病的防病試驗(yàn)中先用生物質(zhì)熱解液處理24 h后接病菌的防效達(dá)到52.30%。說(shuō)明生物質(zhì)熱解液在辣椒炭疽病無(wú)公害防治中有一定的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液和生物質(zhì)熱解液1∶9配比的EC50值明顯小于Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液和生物質(zhì)熱解液?jiǎn)蝿〦C50值，其共毒系數(shù)為123.98，明顯大于100，說(shuō)明Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液和生物質(zhì)熱解液1∶9混配具有明顯的增效作用。辣椒果實(shí)炭疽病的防病試驗(yàn)表明，先用Y-S-Y12 菌株發(fā)酵濃縮液與生物質(zhì)熱解液1∶9混劑處理24 h后接病菌的防效達(dá)到79.62%，進(jìn)一步證明Y-S-Y12 菌株發(fā)酵濃縮液與生物質(zhì)熱解液1∶9混劑對(duì)辣椒炭疽病有明顯增效防病作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，Y-S-Y12菌株發(fā)酵液、生物質(zhì)熱解液以及1∶9混劑處理的辣椒炭疽病菌菌絲中的幾丁質(zhì)酶活性、β-1,3-葡聚糖酶活性和蛋白酶活性均顯著高于對(duì)照，其中1∶9混劑處理的蛋白酶活性、幾丁質(zhì)酶活性和β-1,3-葡聚糖酶活性最高，分別是對(duì)照的3.37、3.17和1.67倍。說(shuō)明藥液處理后菌體的保護(hù)屏障被打破，使其內(nèi)部電解質(zhì)、蛋白質(zhì)以及核酸等外泄至培養(yǎng)液中，進(jìn)而使培養(yǎng)液的電導(dǎo)率、蛋白質(zhì)和核酸含量上升。張慧茹等[23]研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)內(nèi)生真菌JY25 發(fā)酵液可以使致病大腸桿菌的電導(dǎo)率增加，使細(xì)胞膜受到明顯破壞。木霉在和抗生菌寄生中，可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶，分解植物細(xì)胞壁，或分泌葡萄糖苷酶等胞外酶來(lái)破壞寄主細(xì)胞壁[24-26]。這些研究均與本研究結(jié)果一致。同時(shí)，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液和生物質(zhì)熱解液混劑處理的辣椒炭疽病菌菌絲部分呈不規(guī)則膨大、溶菌、輕微彎曲、分隔不明顯、分叉處膨大、菌絲變短，這進(jìn)一步證明菌體生長(zhǎng)受到威脅。

SOD酶、POD酶、CAT酶是植物體內(nèi)重要的保護(hù)酶，與植物體抗病性相關(guān)。本研究結(jié)果表明，Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液、生物質(zhì)熱解液以及1∶9混劑處理的辣椒葉片SOD酶、POD酶、CAT酶活性均明顯高于對(duì)照，其中1∶9混劑處理的SOD、POD和CAT酶活性最高，比對(duì)照分別提高了1.26、2.26和2.70倍。這與前人[27-31]的研究基本一致。說(shuō)明Y-S-Y12菌株發(fā)酵液和生物質(zhì)熱解液以及它們的混劑處理可以誘導(dǎo)辣椒植株抗病性提高。

噴施Y-S-Y12菌株發(fā)酵濃縮液和生物質(zhì)熱解液1∶9混劑不僅可以直接作用于病原菌，使其細(xì)胞膜和細(xì)胞壁受到破壞，抑制其生長(zhǎng)，還能夠提高辣椒植株體內(nèi)保護(hù)酶的活性，提高植物的抗病性，內(nèi)因和外因的共同作用使得噴施1∶9混劑后的植物體病害明顯降低，從而有效抑制了辣椒炭疽病的危害。