司春嬰，王 賀，孫文博，劉俊呈，陳玉善，解金紅，關(guān)懷敏＊＊

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 鄭州 450000；2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心 鄭州 450000）

《中國(guó)心血管病報(bào)告2018》[1]數(shù)據(jù)顯示，目前我國(guó)冠心病死亡率仍呈上升趨勢(shì)，防治仍然刻不容緩。經(jīng)皮冠脈介入治療（percutaneous transluminal coronary intervention，PCI）是目前冠心病首要治療方式，但術(shù)后仍有10%-30% 支架內(nèi)再狹窄（in-stent re-stenosis，IRS）發(fā)生率，導(dǎo)致手術(shù)失敗。其原因多與血栓形成、炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮受損、中膜平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖、內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化遷移、支架斷裂或貼壁不良等[2-3]。其中冠脈血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的過(guò)度增殖、異常遷移和凋亡受阻引起大量細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）合成和血管壁脂質(zhì)沉積是冠心病PCI 術(shù)后IRS 的首要原因[4]。因此，抑制VSMC 過(guò)度增殖、遷移，促進(jìn)其凋亡，是預(yù)防IRS 的關(guān)鍵所在。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)IRS 的防治主要有支架治療、基因治療、血管內(nèi)放射治療和口服藥物治療等幾個(gè)方面，但治療效果不盡如人意，仍有部分病人反復(fù)發(fā)生IRS，使得現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)IRS的防治遇到瓶頸。中醫(yī)藥認(rèn)為，PCI術(shù)后IRS仍屬“胸痹”“真心痛”范疇，“本虛標(biāo)實(shí)”仍為其基本病機(jī)，“痰瘀”仍為其主要證型，“化痰活血”為其主要治則。因此，本研究通過(guò)建立Hcy 誘導(dǎo)兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的離體模型，觀察“化痰活血”代表藥物丹蔞片對(duì)兔主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及其凋亡的作用，并探討其可能的分子生物學(xué)機(jī)制，從而為臨床防治冠心病PCI 術(shù)后IRS 提供理論依據(jù)及新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源及藥品試劑

本實(shí)驗(yàn)用大兔原代主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（RASMC），購(gòu)置于武漢原生原代（PriCells）生物醫(yī)藥科技有限公司（貨號(hào)：RAB-CELL-0011）。本研究所用藥品為吉林康乃爾藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的丹蔞片原粉和阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn)的瑞舒伐他汀鈣片（商品名：可定；批號(hào)：124862）。研究所需Cell Titer-GloTM購(gòu)于美國(guó)Promega公司（批號(hào)：G7570），同型半胱氨酸（Hcy）購(gòu)于Sigma 公司（批號(hào)：69453，純度≥98%），p-Akt 抗體、p-ERK 抗體、β-actin 抗體及二抗均購(gòu)于Cell Signaling Technology公司，研究用FBS、DMEM培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)于美 國(guó)GIBCO 公 司，Transwell 共 培 養(yǎng) 體 系（Corning公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

RASMC 由Pricell 公司提供，倒置相差顯微鏡觀察，培養(yǎng)的細(xì)胞多數(shù)呈長(zhǎng)梭形，核大，DAPI染色細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)綠色，可見(jiàn)明顯的肌絲纖維。經(jīng)IHC 鑒定，胞漿內(nèi)α-SMA 陽(yáng)性表達(dá)率超過(guò)98%，可確定為RASMC。細(xì)胞培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)為37℃、5%CO2濃度，于該環(huán)境下孵育RASMC，每日生長(zhǎng)情況于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察并及時(shí)換液，待RASMC 生長(zhǎng)至70%-80%培養(yǎng)瓶底時(shí)進(jìn)行傳代，取第3-6 代細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 含藥血清制備

雄性健康新西蘭大白兔12只（購(gòu)置于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)SCXK 魯20130001），體重3.0±0.5 kg，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分4 組：空白組、丹蔞片組、瑞舒伐他汀（可定）組和丹蔞片聯(lián)合瑞舒伐他?。ɑ旌希┙M，每組3只。按人臨床用藥等效劑量，以體表面積換算公式進(jìn)行換算，后三組分別灌胃丹蔞片原粉、可定及丹蔞片原粉聯(lián)合可定，空白組灌胃等體積生理鹽水，每天灌胃1次，連續(xù)5天，各組于末次灌胃3小時(shí)后腹主動(dòng)脈采血，離心并滅活后置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)胞分組及藥物干預(yù)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RASMC 細(xì)胞胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液，分別調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，1×105/mL 和2 × 105/mL，分別種于96 孔板（每孔200 μL）、Transwell 上室（每孔200μL）和6 孔板（每孔1 mL）中，繼續(xù)培養(yǎng)12 h 待所有細(xì)胞完全貼壁，無(wú)血清同步化24 h 后，將細(xì)胞分為空白組、Hcy 組、丹蔞片組、瑞舒伐他?。啥ǎ┙M、丹蔞片聯(lián)合瑞舒伐他?。ɑ旌希┙M。除空白組外，其余各組均加入濃度為10-4mol/L Hcy；同時(shí)，后三組分別加入相應(yīng)含藥血清，培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞。

1.2.4 Cell Titer-Glo法測(cè)細(xì)胞增殖

從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出96孔板，吸取各組上層細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入工作液50 μL，震蕩1-2 min 使細(xì)胞完全裂解。于室溫避光放置10 min，待光信號(hào)穩(wěn)定后，上機(jī)讀取并記錄光信號(hào)強(qiáng)度。

1.2.5 Transwell法測(cè)細(xì)胞遷移

取孔徑8 μm 的24 孔共培養(yǎng)遷移小室，按上述分組向各組小室加入200μL無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基，于細(xì)胞溫箱中濕化2 h，棄上層培養(yǎng)基。胰酶消化后完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整密度至1×105/mL，于小室上層加入單細(xì)胞懸液200μL/孔?？瞻捉M小室下層加正常兔血清培養(yǎng)基600μL，Hcy 組小室下層加含Hcy10-4mol/L 的等體積正常兔血清培養(yǎng)基，其余各組在Hcy10-4mol/L 基礎(chǔ)上加等體積相應(yīng)含藥血清。于溫箱中培養(yǎng)24 h，取上室棄上清，棉簽擦去上室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，保留下側(cè)細(xì)胞，PBS 潤(rùn)洗3 次，于4%多聚甲醛中固定細(xì)胞20 min，PBS 潤(rùn)洗3 次，0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，再用PBS 洗滌3 次后倒置顯微鏡下隨機(jī)取5 個(gè)視野觀察計(jì)數(shù)，取其平均值。

1.2.6 流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞凋亡率

各組細(xì)胞用PBS 洗滌，胰蛋白酶消化后轉(zhuǎn)移至離心管，加培養(yǎng)液，混勻，1000 r/min離心，棄上清，加PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為106/mL，取0.5 mL 細(xì)胞懸液，1000 r/min 離心4 min，棄上清，加0.5 mL Binding Bufer，重懸細(xì)胞，加1μL 熒光標(biāo)記的Annexin V 試劑，混勻，室溫下避光孵育20 min，加入PI 5 μL，混勻后4℃下避光孵育5 min，加入Binding Bufer 500μL，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 Western blot測(cè)信號(hào)通路蛋白表達(dá)

提取各組處理后細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，以β-actin 作為內(nèi)參，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，將膜用TBS 緩沖鹽水從下向上浸濕后，移至含有5%脫脂奶粉的封閉液器皿中，室溫脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h 后，加入1∶5 000 比例稀釋的一抗，37℃孵育12 h，平盤(pán)中加入TBST 放在脫色搖床上洗3 次，每次10 min。同樣，步驟加入二抗，避光、室溫、緩搖床孵育50 min，洗滌后用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影，使用Image J分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較時(shí)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊則以one-way ANOVA 的LSD 法檢驗(yàn)；若方差不齊用Dunnet’T3 法檢驗(yàn)。兩組間比較采用成組t 檢驗(yàn)。以P<0.01或P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組RASMC細(xì)胞增殖結(jié)果比較

與空白組比較，Hcy 組細(xì)胞明顯增殖（P < 0.01）；與Hcy 組比較，三個(gè)用藥組細(xì)胞增殖顯著下降（P <0.01），且混合組細(xì)胞增殖明顯低于丹蔞片組和可定組（P < 0.01）；較丹蔞片組，可定組增殖雖有所減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見(jiàn)表1、圖1）。

2.2 各組RASMC細(xì)胞遷移結(jié)果比較

與空白組比較，Hcy 組RASMC 遷移數(shù)明顯增加（P <0.01）；與Hcy 組比較，三個(gè)用藥組細(xì)胞遷移數(shù)顯著減少（P < 0.01），且混合組細(xì)胞遷移數(shù)明顯低于丹蔞片組和可定組（P<0.01）；與丹蔞片組比較，可定組細(xì)胞遷移數(shù)明顯減少（P<0.01）（見(jiàn)圖2、圖3）。

表1 各組RASMC細(xì)胞增殖活力比較（±s）

表1 各組RASMC細(xì)胞增殖活力比較（±s）

注：*與空白組比較，P < 0.01；#與Hcy 組比較，P < 0.01；▽與混合組比較，P<0.01

組別空白組Hcy組丹蔞片組可定組混合組發(fā)光強(qiáng)度（RLU）1249415.67±61902.3 1684822.00±59114.14*668649.33±73205.79#▽557238.33±18008.98#▽306976.33±38836.49#

圖1 各組RASMC細(xì)胞增殖活力比較

2.3 各組RASMC細(xì)胞凋亡率比較

細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：與空白組比較，Hcy組細(xì)胞凋亡明顯減少（P <0.01）；與Hcy 組比較，三個(gè)用藥組細(xì)胞凋亡明顯增加（P < 0.01），且混合組細(xì)胞凋亡顯著高于丹蔞片組和可定組（P<0.01）；與丹蔞片組比較，可定組細(xì)胞凋亡明顯增加（P<0.05）（見(jiàn)表2、圖4）。

2.4 各組RASMC細(xì)胞信號(hào)通路蛋白表達(dá)量比較

結(jié)果顯示：①各組非磷酸化Akt 蛋白和非磷酸化ERK 蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯變化（P > 0.05）；②p-Akt：與空白組比較，Hcy 組p-Akt 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P <0.01）；與Hcy組比較，三個(gè)用藥組p-Akt蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01），且混合組p-Akt顯著低于丹蔞片組和可定組（P < 0.01）；與丹蔞片組比較，可定組p-Akt 表達(dá)進(jìn)一步減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；③p-ERK：與空白組比較，Hcy 組p-ERK 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01）；與Hcy 組比較，三個(gè)用藥組p-ERK 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P < 0.01），且混合組p-ERK 顯著低于丹蔞片組和可定組（P<0.01）；與丹蔞片組比較，可定組p-ERK 表達(dá)雖有所下調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見(jiàn)圖5）。

圖2 各組RASMC Transwell小室遷移（×200）

圖3 各組RASMC遷移數(shù)目比較

表2 各組VSMC細(xì)胞凋亡率比較（±s）

表2 各組VSMC細(xì)胞凋亡率比較（±s）

注：*與空白組比，P<0.01；#與Hcy 組比較，P<0.01；▽與混合組比較，P<0.01；?與丹蔞片組比，P<0.05

凋亡率/%13.64±0.33 10.57±0.50*15.08±0.15#▽16.99±0.29#▽?19.96±0.28#組別空白組Hcy組丹蔞片組可定組混合組

3 討論

PCI是目前冠心病主流治療手段，然而PCI術(shù)后仍有10%-30%IRS 發(fā)生率，這與中膜VSMC 過(guò)度增殖及遷移、血栓形成、炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮受損、內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化遷移、支架斷裂或貼壁不良等多種機(jī)制有關(guān)[2-3]，其中VSMC 的異常遷移、過(guò)度增殖和凋亡抑制所引起的大量ECM 合成和血管壁脂質(zhì)沉積是包括PCI 術(shù)后再狹窄在內(nèi)的所有阻塞性血管疾病首要原因[4-5]。PCI術(shù)后，支架作為異物，其置入處血管存在持續(xù)炎癥反應(yīng)，刺激平滑肌細(xì)胞由收縮型向分泌型表型轉(zhuǎn)化，后者進(jìn)一步釋放大量IL-6、TNF-α等炎癥因子及VEGF、SDF-1等細(xì)胞因子，引起VSMC 的過(guò)渡增殖、向內(nèi)膜遷移，合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)并吞噬脂質(zhì)形成肌源性泡沫細(xì)胞，加重局部炎癥反應(yīng)，促進(jìn)支架內(nèi)新生動(dòng)脈粥樣硬化（in stent neoatherosclerosis，ISNA）的發(fā)生，加速I(mǎi)RS 的發(fā)生和進(jìn)展。因此，抑制VSMC 過(guò)度增殖、遷移，誘導(dǎo)其凋亡，是預(yù)防IRS的關(guān)鍵所在。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)IRS的防治主要為支架治療、基因治療、血管內(nèi)放射治療和口服藥物治療等幾個(gè)方面，但治療效果不盡如人意，仍有部分病人反復(fù)發(fā)生IRS，使得現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)IRS 的防治遇到瓶頸。中醫(yī)藥理論認(rèn)為，PCI 術(shù)后IRS仍屬“胸痹”“真心痛”范疇，“本虛標(biāo)實(shí)”為其基本病機(jī)，PCI治療雖有“破血”功效，但支架作為異物加重血管炎癥反應(yīng)，血管機(jī)械損傷進(jìn)一步加重，導(dǎo)致“瘀血阻滯，血脈不通，因此“痰瘀”仍為其主要證型，“化痰活血”為其主要治則[6]。

圖4 各組RASMC凋亡率比較

高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，Hhcy）是AS 新的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，同時(shí)也是急性冠脈綜合癥（ACS）的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[7-10]，作為一種反應(yīng)性血管損傷氨基酸，Hcy 可促進(jìn)AS 及血栓形成[11]。研究發(fā)現(xiàn)，在冠心病PCI 術(shù)后，Hcy 水平較術(shù)前無(wú)明顯變化，術(shù)前Hcy 水平的高低決定PCI 術(shù)后早期并發(fā)癥的發(fā)生率[12-13]。因此，PCI 治療僅改變局部血液供應(yīng)，Hhcy 導(dǎo)致的全身和支架局部高炎癥反應(yīng)狀態(tài)并未得到糾正。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，經(jīng)Hcy 誘導(dǎo)后，RASMC 過(guò)渡增殖、遷移，同時(shí)細(xì)胞凋亡率下降，凋亡受阻，這與前人研究結(jié)果相一致。

既往研究表明，Akt和ERK 信號(hào)通路在AS 病變中發(fā)揮了重要的作用，Akt 有絲/蘇氨酸激酶活性，可被PI3K 激 活 生 成 磷 酸 化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt），后者貫續(xù)激活其下游分子發(fā)揮生物學(xué)作用。PI3K/Akt 信號(hào)通路廣泛參與包括AS 在內(nèi)的多種心血管疾病形成過(guò)程，通過(guò)調(diào)控VSMC增殖和遷移、血管新生、炎癥反應(yīng)等過(guò)程，促進(jìn)AS 發(fā)生、發(fā)展[14]。ERK/MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛存在于多種細(xì)胞內(nèi),磷酸化激活后的p-ERK 調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移等生物學(xué)行為[15]。通過(guò)本研究證實(shí)，在Hcy 誘導(dǎo)的RASMC 過(guò)渡增殖和遷移模型中，p-Akt 及p-ERK 蛋白表達(dá)量顯著增加，提示p-Akt及p-ERK 可能在Hcy 誘導(dǎo)RASMC增殖、遷移時(shí)發(fā)揮重要作用。

丹蔞片是“化痰活血”代表藥物，由薤白、瓜蔞皮、葛根、丹參、川芎、赤芍、澤瀉、黃芪、郁金等構(gòu)成，目前研究表明，其有降脂、抗炎、保護(hù)內(nèi)皮功能、消退AS 斑塊等作用[16-20]，但這些研究多集中在探討丹蔞片對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)節(jié)和對(duì)血脂水平調(diào)節(jié)等方面，而對(duì)血管平滑肌細(xì)胞作用的研究較少，恰正如前所述后者是干預(yù)IRS的核心靶點(diǎn)。因此，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，丹蔞片能夠明顯抑制Hcy 誘導(dǎo)RASMC 增殖和遷移，增加RASMC凋亡率，下調(diào)p-Akt和p-ERK信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平，且與瑞舒伐他汀聯(lián)合應(yīng)用后，其作用進(jìn)一步增強(qiáng)，提示丹蔞片具有抗RASMC 細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)其凋亡的作用，該作用可能是通過(guò)下調(diào)p-Akt 和p-ERK 信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的。本研究不足之處在于未加入Akt 與ERK 信號(hào)通路阻斷劑，需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中添加信號(hào)通路特異性阻斷劑進(jìn)一步驗(yàn)證丹蔞片抗血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)其凋亡的作用機(jī)制。

圖5 Western Blot檢測(cè)信號(hào)通路蛋白表達(dá)