孫向明，宋 輝，胡 揚(yáng)，溫靜，薛 屹，鄒 翔＊＊

（1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院 哈爾濱 150076；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物工程技術(shù)研究中心 哈爾濱 150076）

中藥吳茱萸具有散寒止痛、疏肝下氣、溫中燥濕的功效，通常被用于治療厥陰頭痛、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、寒濕腳氣、高血壓等疾病，其主要化學(xué)成分有生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)等[1-4]，生物堿類(lèi)是主要的有效成分，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等生物活性[5-7]。在歷代本草中，吳茱萸被列為中品，記載有毒或有小毒。據(jù)報(bào)道，有人因大劑量服用吳茱萸出現(xiàn)頭痛、胸悶、視物模糊、劇烈腹痛等癥狀[8]。已有學(xué)者指出，肝臟是其毒性靶器官之一[9]。目前，吳茱萸的肝毒性已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[10-11]，相關(guān)的研究陸續(xù)展開(kāi)。動(dòng)物研究表明，吳茱萸的水提物、醇提物和揮發(fā)油均可引起肝毒性，并呈一定的“量-時(shí)-毒”關(guān)系，其中揮發(fā)油的肝毒性作用機(jī)制可能與氧化損傷有關(guān)[9,12-14]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證明吳茱萸的50%乙醇提取物具有肝毒性，并采用UPLC-Q-TOF MS 技術(shù)對(duì)吳茱萸的50%乙醇提取物化學(xué)成分及血中移行成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征[15]，通過(guò)譜效相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)以吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿為代表的喹諾酮類(lèi)生物堿是其潛在的肝毒性成分[16]。而吳茱萸中喹諾酮類(lèi)生物堿同時(shí)也具有抗菌消炎等作用，既是有毒成分也是有效成分。為了臨床合理的應(yīng)用吳茱萸及適當(dāng)?shù)亩拘灶A(yù)警，本研究在前期研究成果的基礎(chǔ)上，采用UPLC-TQD-MS/MS 技術(shù)，針對(duì)已篩選出的兩種吳茱萸肝毒性成分（吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿）進(jìn)行大鼠口服吳茱萸肝毒性部位后的代謝動(dòng)力學(xué)研究，旨在分析毒性劑量下，兩種肝毒性成分的體內(nèi)作用規(guī)律，表征吳茱萸肝毒性成分的動(dòng)力學(xué)特征，為指導(dǎo)吳茱萸的臨床合理、安全使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜與Xevo TQD 三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Waters 公司產(chǎn)品；GENIUS N118LA 氮?dú)獍l(fā)生器：英國(guó)PEAK 公司產(chǎn)品；Allegra 64R 低溫高速離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾有限公司產(chǎn)品。

吳茱萸藥材：購(gòu)自哈爾濱三棵樹(shù)藥材市場(chǎng)，由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院曲中原教授鑒定為吳茱萸Evodia rutaecarpa (Juss.)Benth；吳茱萸新堿、二氫吳茱萸新堿對(duì)照品（上海依赫生物科技有限公司，純度＞98%，批號(hào)YH-201604）；內(nèi)標(biāo)地西泮（上海依赫生物科技有限公司，純度> 98%，批號(hào)YH-201605）；甲醇（德國(guó)賽默飛世爾公司，質(zhì)譜純，批號(hào)：20160311）；乙腈（德國(guó)賽默飛世爾公司，質(zhì)譜純，批號(hào)20160410）；純凈水（屈臣氏，批號(hào)20161205）；甲酸（色譜純，上?？其J實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)20160509）。

SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠體重（220 ± 20）g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，許可證號(hào)：SCXK-（黑）2013-001。

2 方法

2.1 灌胃藥液的制備

采用參考文獻(xiàn)[16]“1.2.1”項(xiàng)下方法制備大鼠的灌胃藥液。

2.2 給藥方案和血漿樣品的采集

取雄性大鼠8 只，給藥前稱(chēng)重，按照25 g·kg-1·d-1（以生藥計(jì)）的劑量灌胃給藥，灌胃體積為25 mL·kg-1，每天一次，連續(xù)給藥14 d。最后一次給藥前禁食不禁水12 h，于 給 藥 后5 min、10 min、20 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h由大鼠眼眶靜脈叢取血約0.3 mL 至肝素化的1.5 mL EP 管中，5000 r·min-1離心10 min，分離上層血漿，于-20℃冰箱中保存待測(cè)。

2.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC? BEH C18（1.7 μm,2.1 × 100 mm）；保護(hù)柱：ACQUITY UPLC? BEH C18（1.7μm,2.1×5 mm）；柱溫：40℃；流動(dòng)相：乙腈-0.2%甲酸水溶液（75∶25）；流速：0.25 mL/min；進(jìn)樣量：5μL。

表1 待測(cè)成分的定量離子對(duì)和參數(shù)設(shè)置

2.4 質(zhì)譜條件

離子化模式：大氣壓電噴霧正離子模式（ESI+）；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：55 V；源溫度：350℃；霧化氣溫度：50℃；霧化氣流速：650 L/h；錐孔氣流速：50 L/h；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）掃描，待測(cè)成分的定量離子對(duì)及參數(shù)設(shè)置，見(jiàn)表1。

2.5 溶液的配制

2.5.1 系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱(chēng)取吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿標(biāo)準(zhǔn)品適量，80%甲醇稀釋成濃度為5μg/mL 的儲(chǔ)備液備用，分別精密吸取吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿儲(chǔ)備液適量，用80%甲醇定量稀釋成濃度為1 ng/mL、20 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，置冰箱4 ℃冷藏，備用。

2.5.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密吸取吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿儲(chǔ)備液適量，用80%甲醇定量稀釋成濃度分別為1 ng/mL、5 ng/mL、200 ng/mL、2000 ng/mL 的定量下限、低、中和高濃度質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液，置冰箱4℃冷藏，備用。

2.5.3 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱(chēng)取地西泮適量，加適量甲醇溶解并稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛葹?00 ng/mL 的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，置冰箱4℃冷藏，備用。

2.6 血漿樣品預(yù)處理方法的考察

分別采用乙酸乙酯萃取法[17]、二氯甲烷萃取法、甲醇沉淀蛋白法進(jìn)行血漿樣品的預(yù)處理，比較不同預(yù)處理方法對(duì)吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿提取回收率的影響。

（1）取10μL混標(biāo)（500 ng/mL），40℃下氮?dú)獯蹈扇軇?，精密加入空白血漿100 μL，制得含混標(biāo)50 ng/mL的血漿樣本，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合30 s，分別加入乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇各660μL，渦旋混合3 min，14000 r·min-1低溫高速離心10 min，分別取乙酸乙酯和甲醇的上清液，取二氯甲烷的下層清液在40℃下氮?dú)獯蹈?。測(cè)定前向殘?jiān)屑尤?00μL 80%甲醇復(fù)溶，渦旋1 min，14000 r·min-1低溫高速離心20 min，取上清進(jìn)樣分析。記錄待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積，計(jì)算二者峰面積之比，記為A。

（2）取10μL 內(nèi)標(biāo)液，40 ℃下氮?dú)庀麓蹈杉状迹芗尤?00 μL 空白血漿，渦旋混合30 s，分別加入乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇各660 μL，渦旋混合3 min，14000 r·min-1低溫高速離心10 min，分別取乙酸乙酯和甲醇的上清液，取二氯甲烷的下層清液在40 ℃下氮?dú)獯蹈?。再向殘?jiān)屑尤?00 μL 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（50 ng/mL），渦旋混勻1 min，14000 r·min-1低溫高速離心20 min，取上清進(jìn)樣分析，記錄待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積，計(jì)算二者峰面積之比，記為B。以A/B 計(jì)算提取回收率。

2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

2.7.1 方法專(zhuān)屬性試驗(yàn)

精密移取大鼠空白血漿100μL，按“2.6”（1）項(xiàng)下篩選得到的血漿預(yù)處理方法操作（不加混標(biāo)和內(nèi)標(biāo)溶液），得空白血漿樣品的色譜圖；以篩選得到的血漿預(yù)處理方法按照“2.6”（1）項(xiàng)下的操作步驟操作，得模擬血漿樣品色譜圖；取大鼠灌胃給藥0.5 h 后的血漿樣品，加入內(nèi)標(biāo)溶液10μL，其余步驟按“2.6”（1）項(xiàng)下篩選得到的方法操作，得給藥后血漿樣品色譜圖。對(duì)比上述色譜圖，觀察內(nèi)源性物質(zhì)和代謝物是否干擾血漿中吳茱萸新堿、二氫吳茱萸新堿、地西泮的測(cè)定。

2.7.2 線(xiàn)性關(guān)系考察與定量下限

精密移取系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，40 ℃下氮?dú)獯蹈扇軇芗尤氪笫罂瞻籽獫{100 μL，制成相當(dāng)于吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿0.1 ng/mL、2 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、250 ng/mL的模擬血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合30 s，其余按“2.6”（1）項(xiàng)下篩選得到的方法操作，進(jìn)行UPLC-MS/MS 分析，記錄待測(cè)成分及內(nèi)標(biāo)的峰面積，每一個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分析三個(gè)樣本。以待測(cè)成分濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)X，待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，采用加權(quán)（w = 1/x2）最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得到回歸方程。以樣品峰與基線(xiàn)的信噪比S/N = 10 時(shí)的樣品濃度為定量下限（LOQ）。

2.7.3 準(zhǔn)確度與精密度考察

精密移取質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，40℃下氮?dú)獯蹈扇軇?，精密加?00 μL 大鼠空白血漿，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合30 s，其余按“2.6”（1）項(xiàng)下篩選得到的方法操作，得定量下限、低、中和高濃度質(zhì)控樣品，濃度分別為0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、20 ng/mL、200 ng/mL。每一濃度樣品平行制備6 份并進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算日內(nèi)與日間的準(zhǔn)確度、精密度。

2.7.4 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率

精密吸取低、中、高濃度的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，分別加入內(nèi)標(biāo)液10μL，以80%甲醇稀釋至100μL，混勻后進(jìn)樣分析，記錄待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積，二者峰面積比計(jì)為Al；取100 μL 大鼠空白血漿，按“2.6”（1）項(xiàng)下篩選得到的方法加入內(nèi)標(biāo)之后的步驟處理，測(cè)定前加入內(nèi)標(biāo)液10μL和低、中、高濃度的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，以80%甲醇稀釋至100μL，混勻后進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度測(cè)定6份樣品，記錄待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積，計(jì)算二者峰面積之比計(jì)為A2，以A2/A1計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

取低、中、高濃度的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液各6 份，每份10μL，加入10μL 內(nèi)標(biāo)液，氮?dú)獯蹈扇軇?，分別加入空白血漿100μL，按“2.6”（1）項(xiàng)下篩選得到的方法加入內(nèi)標(biāo)之后的步驟處理，進(jìn)樣分析，測(cè)定待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積，二者峰面積比計(jì)為A3，以A3/A2計(jì)算回收率。

2.7.5 穩(wěn)定性考察

室溫穩(wěn)定性考察：分別取大鼠空白血漿100 μL，分別加入內(nèi)標(biāo)液10μL和低、中、高濃度的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液10μL，按“2.6”（1）項(xiàng)下篩選得到的方法加入內(nèi)標(biāo)之后的步驟處理，室溫放置6 h，每一濃度進(jìn)行6 樣本分析，考察血漿樣品室溫放置6 h的穩(wěn)定性。

冷凍穩(wěn)定性考察：取低、中、高三個(gè)濃度質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度平行制備6 份，-20℃凍存7 d，考察血漿樣品凍存7 d的穩(wěn)定性。

三次凍融穩(wěn)定性考察：取低、中、高三個(gè)濃度的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一濃度平行制備6 份，-20℃存放24 h，取出至室溫放置使自然解凍，當(dāng)溶解完全后，取樣進(jìn)行分析，然后再把樣品放回冷凍狀態(tài)保持24 h 以上，如此解凍-冷凍重復(fù)循環(huán)三次，考察血漿樣品反復(fù)凍融三次后的穩(wěn)定性。

表2 不同預(yù)處理方法提取回收率結(jié)果（±s，n = 3）

表2 不同預(yù)處理方法提取回收率結(jié)果（±s，n = 3）

處理方法乙酸乙酯萃取法二氯甲烷萃取法甲醇沉淀蛋白法提取回收率/%吳茱萸新堿91.78±4.32 79.63±5.87 58.81±7.24二氫吳茱萸新堿92.43±3.15 75.92±4.06 62.59±6.59

2.8 樣品的測(cè)定及數(shù)據(jù)分析

將采集的大鼠血漿樣品按“2.6”項(xiàng)下篩選出的血漿樣品的預(yù)處理方法處理后，進(jìn)行UPLC-MS/MS 分析測(cè)定。采用PK Solver 2.0 軟件非房室模型法進(jìn)行分析，并進(jìn)行相應(yīng)參數(shù)的估算。

3 結(jié)果

3.1 血漿樣品預(yù)處理方法的考察

實(shí)驗(yàn)比較了乙酸乙酯萃取法、二氯甲烷萃取法、甲醇沉淀蛋白法對(duì)血漿樣品的預(yù)處理情況。三種方法對(duì)吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿提取回收率結(jié)果見(jiàn)表2。

研究結(jié)果表明，采用乙酸乙酯為萃取溶劑時(shí)，吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿的回收率均在90%以上，顯著高于二氯甲烷萃取法和甲醇沉淀蛋白法，故選取乙酸乙酯萃取法作為本實(shí)驗(yàn)中血漿樣品的預(yù)處理方法。

3.2 分析方法學(xué)考察

3.2.1 方法專(zhuān)屬性

在上述試驗(yàn)條件下，可見(jiàn)各待測(cè)成分離子化后產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，在2.379 min 時(shí)可見(jiàn)吳茱萸新堿的m/z 340.26 峰，在3.459 min 時(shí)可見(jiàn)二氫吳茱萸新堿的m/z 342.27 峰，在1.316 min 時(shí)可見(jiàn)內(nèi)標(biāo)地西泮的m/z 285.08 峰，各成分的質(zhì)譜圖和化學(xué)結(jié)構(gòu)，如圖1所示。圖2 進(jìn)一步比較了空白血漿樣品、加入標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)的模擬血漿樣品以及給藥0.5 h 后的血漿樣品中吳茱萸新堿（WZYXJ）二氫吳茱萸新堿（EQWZYXJ）、地西泮（DXP）的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）離子色譜圖。

結(jié)果表明：在實(shí)驗(yàn)所采用的色譜和質(zhì)譜條件下，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和代謝產(chǎn)物對(duì)吳茱萸新堿、二氫吳茱萸新堿、地西泮的測(cè)定無(wú)干擾，方法專(zhuān)屬性良好。

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與定量限

測(cè)定血漿中吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程、相關(guān)系數(shù)r以及定量下限見(jiàn)表3。

研究結(jié)果表明：血漿中兩種成分在0.1 ～250 ng/mL 的濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r 都大于0.99，符合2015 版藥典關(guān)于生物樣品測(cè)定的要求。吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿定量下限在0.1 ng/mL 可被有效檢測(cè)。

3.2.3 準(zhǔn)確度與精密度考察

按“2.7.3”項(xiàng)下操作，定量下限、低、中和高濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果見(jiàn)表4。

結(jié)果顯示：兩種成分的日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度均在標(biāo)示值的± 15%之內(nèi)，精密度的RSD 值均小于15%，表明方法準(zhǔn)確度和儀器精密度良好，方法穩(wěn)定可行。

3.2.4 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率

吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿的基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率，如表5、表6所示，兩種成分的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率均在80%～120%之間。

結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)所采用的方法提取回收率較高，并且沒(méi)有明顯的基質(zhì)效應(yīng)，符合生物樣品的分析要求。

3.2.5 穩(wěn)定性考察

低、中、高三個(gè)濃度（0.5 ng/mL、20 ng/mL、200 ng/mL）的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同條件下的穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)表7。

結(jié)果顯示，將血漿樣品室溫放置6 h，-20℃冷凍7 d，三次凍融操作后吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿實(shí)測(cè)濃度的RSD 值均小于10%，表明兩種成分在上述環(huán)境下的穩(wěn)定性良好，應(yīng)盡量減少凍融次數(shù)。

3.3 樣品的測(cè)定及數(shù)據(jù)分析

采用已建立的UPLC-TQD-MS/MS 方法，測(cè)定各采血時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，得到兩種成分在大鼠血漿中的藥時(shí)曲線(xiàn)（見(jiàn)圖3）和主要的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)（見(jiàn)表8）。

結(jié)果表明：給大鼠灌胃吳茱萸50%乙醇提取物后，吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿在體內(nèi)被迅速吸收，血漿中的平均達(dá)峰時(shí)間分別為0.54±0.10 h、0.58±0.13 h，平均峰濃度分別為36.38±9.89 ng/mL、22.07±8.34 ng/mL，藥時(shí)曲線(xiàn)下面積分別為119.8±29.8 ng/mL、67.25±21.12 ng/mL·h，平均滯留時(shí)間為4.68±0.98 h、4.80 ± 1.02 h，表 觀 分 布 容 積 分 別 為0.313 L/kg、0.682 L/kg。二者的清除率分別為0.078 L/h/kg、0.136 L/h/kg，半 衰 期 分 別 為2.80 ± 0.61 h 和3.49 ±0.74 h，經(jīng)過(guò)約4個(gè)半衰期，血中殘留量大幅降低，說(shuō)明在體內(nèi)蓄積不明顯。

圖1 吳茱萸新堿（a）、二氫吳茱萸新堿（b）和地西泮（c）的質(zhì)譜圖及化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

4 討論

有關(guān)吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿藥代動(dòng)力學(xué)的研究報(bào)道較少，毒代動(dòng)力學(xué)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。1991年日本的Kano Y 等[18]在文獻(xiàn)中稱(chēng)，靜脈注射吳茱萸新堿后，其藥代動(dòng)力學(xué)呈單室模型。劑量在75 mg/kg時(shí)，吳茱萸新堿在血漿中可線(xiàn)性消除。吳茱萸新堿的總血漿清除率、分布容積和半衰期分別為60 mL/min/kg、3.2 L/kg 和0.6 h。在本研究中，為完全的考察在致肝毒性劑量下，吳茱萸中的兩種潛在肝毒性成分吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿的藥動(dòng)學(xué)特征，連續(xù)給大鼠灌胃吳茱萸50%乙醇提取物14 d 后，監(jiān)測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿中吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿的含量，采用PK Solver 軟件計(jì)算兩種成分的代謝動(dòng)力學(xué)統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)。結(jié)果表明，吳茱萸新堿的各參數(shù)與文獻(xiàn)中靜脈注射吳茱萸新堿單體的參數(shù)差距較大，提示不同給藥方式及給藥劑量，該成分的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。

一般情況下，藥物的達(dá)峰時(shí)間越短，吸收速度越快，則其峰濃度越高，毒性也越大。從藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)看，兩個(gè)目標(biāo)化合物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較接近，吸收均較快，在給藥后的30 min左右達(dá)到最大血藥濃度，平均峰濃度分別為36.38±9.89 ng/mL、22.07±8.34 ng/mL，相對(duì)于給藥劑量而言并不低，符合對(duì)吳茱萸為小毒中藥的描述。二者的半衰期比較接近，在2.80 ～3.49 h范圍內(nèi)，說(shuō)明兩個(gè)成分的整體藥代謝動(dòng)力學(xué)行為相近，初步反映了吳茱萸肝毒性成分在大鼠體內(nèi)的作用過(guò)程。表觀分布容積和血漿清除率可評(píng)價(jià)重復(fù)給藥其毒性在機(jī)體內(nèi)是否有蓄積性，表觀分布容積越小，血漿清除率越高，說(shuō)明藥物排泄越快，在體內(nèi)滯留時(shí)間越短。吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿的表觀分布容積分別為0.313 L/kg、0.682 L/kg，清除率分別為0.078 L/h/kg、0.136 L/h/kg，可以認(rèn)為在其14 d 的給藥期內(nèi)，大鼠血液中并無(wú)明顯的蓄積情況發(fā)生。

圖2 空白血漿樣品（a）、模擬血漿樣品（b）和給予吳茱萸肝毒性部位0.5 h后的血漿樣品（c）MRM離子色譜圖

表3 兩種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)r及定量下限

表4 QC樣品的準(zhǔn)確度、精密度測(cè)定結(jié)果（n = 6）

表5 吳茱萸新堿的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率（n = 6）

表6 二氫吳茱萸新堿的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率（n = 6）

表7 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果（±s，n = 6）

表7 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果（±s，n = 6）

條件室溫6 h冷凍7 d凍融循環(huán)3次濃度/（ng?mL-1）0.5 20 200 0.5 20 200 0.5 20 200吳茱萸新堿實(shí)測(cè)濃度（ng?mL-1）0.49±0.03 19.87±0.48 197.96±1.88 0.50±0.02 19.85±0.64 199.23±2.45 0.47±0.03 19.16±1.50 197.93±3.05 RSD/%6.12 2.42 0.95 4.01 3.22 1.23 6.38 7.83 1.54二氫吳茱萸新堿實(shí)測(cè)濃度（ng?mL-1）0.49±0.02 19.80±0.65 198.02±2.43 0.48±0.02 19.49±0.62 199.45±1.31 0.47±0.02 18.97±1.82 196.34±5.11 RSD/%4.07 3.28 1.23 5.00 3.18 0.66 4.26 9.59 2.60

圖3 口服吳茱萸肝毒性部位后大鼠體內(nèi)的吳茱萸新堿、二氫吳茱萸新堿藥時(shí)曲線(xiàn)（±s，n=8）

表8 吳茱萸新堿、二氫吳茱萸新堿的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)±s，n = 8）

表8 吳茱萸新堿、二氫吳茱萸新堿的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)±s，n = 8）

參數(shù)t1/2（h）Tmax（h）Cmax（ng/mL）AUC 0-t（ng/mL·h）AUC 0-∞（ng/mL·h）MRT(0-∞)（h）Vz/F（L/kg）Clz/F（L/h/kg）吳茱萸新堿2.80±0.61 0.54±0.10 36.38±9.89 119.8±29.8 128.2±27.6 4.68±0.98 0.313 0.078二氫吳茱萸新堿3.49±0.74 0.58±0.13 22.07±8.34 67.25±21.12 73.73±23.79 4.80±1.02 0.682 0.136

5 結(jié)論

本課題組研究了大鼠口服吳茱萸致肝毒性后，兩種喹諾酮類(lèi)生物堿吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿在大鼠體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)行為。首次建立了一個(gè)快速、準(zhǔn)確、靈敏的UPLC-TQD/MS 分析方法，用以同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中的吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及代謝物對(duì)這兩種成分及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定無(wú)干擾，且分析方法快速、靈敏，適用于血液生物樣品中吳茱萸新堿和二氫吳茱萸新堿的測(cè)定。目標(biāo)成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)提示其具有一定的毒性，但并未在體內(nèi)發(fā)生蓄積。