徐志 邢朝暉 徐淑芠 趙臣

鼻咽鱗狀細(xì)胞癌是常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病迅速，轉(zhuǎn)移率高的特點，目前治療鼻咽鱗狀細(xì)胞癌的主要手段是手術(shù)，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，且早期癥狀不明顯，患者在就診時往往處于晚期[1]，治愈力低，因此尋找新的靶點成為醫(yī)學(xué)工作者不斷探尋的課題。有文獻(xiàn)報道鼻咽鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和癌基因的活化表達(dá)相關(guān)，因此揭示鼻咽癌相關(guān)的基因和調(diào)控機制，對控制鼻咽癌轉(zhuǎn)移具有重要的意義[2]。癌細(xì)胞的侵襲能力與細(xì)胞內(nèi)miRNA密切相關(guān)，miR-497在多種癌細(xì)胞中如肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌中活性受抑制[3-7]，原因可能miR-497通過某些特定的通路起到抑癌基因的作用。PlexinA4作為重要的信號通路，參與到癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移過程，有報道稱喉鱗狀癌細(xì)胞中miR-497與PlexinA4的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，而沉默PlexinA4基因，喉鱗狀癌細(xì)胞的侵襲率顯著降低[8]。而miR-497和PlexinA4在鼻咽癌鱗狀細(xì)胞中的表達(dá)及與細(xì)胞侵襲能力的研究筆者所見鮮有報道，因此本實驗通過研究miR-497與PlexinA4與在鼻咽癌鱗狀細(xì)胞侵襲能力之間的關(guān)系，從而為治療鼻咽癌提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2017年1月至2018年12月于我院就診且經(jīng)病理學(xué)確診的鼻咽鱗狀細(xì)胞癌患者60例的癌組織及相應(yīng)癌旁組織，其中男30例，女30例；年齡40～75歲，平均年齡(54.01±6.21)歲；按美國腫瘤研究聯(lián)合第七版分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期20例，Ⅲ期30例，Ⅳ期10例；淋巴結(jié)分期N0+N1患者38例，N0+N1患者22例。術(shù)前患者均未進行放化療?；颊呒捌浼覍俸炇鹬橥鈺１茄树[狀細(xì)胞HEP-2采購自ATCC細(xì)胞庫。

1.2 試劑與儀器 miR-497 mimics和陰性對照(貨號B05009)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司代為合成；qRT-PCR檢測試劑盒、Trizol總RNA 提取試劑盒、Bulge-Loop miRNA、 購自廣東銳博生物科技技術(shù)股份有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自Hyclone 公司、Promega Dual-Luciferase ReporterAssay System試劑盒、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；青、鏈霉素購自華北制藥有限公司、SYBR Premix Extaq system 購自寶生物工程(大連)有限公司、TRIzol細(xì)胞培養(yǎng)箱采購自上海三騰儀器有限公司。各種抗體：PTEN 兔抗 (WB)、PTEN 兔抗 (IHC)、Occludin 兔抗購自美國 santacruz 公司、二抗(IHC)、Actin 鼠抗購自Fermentas 公司。實時熒光定量PCR儀購自應(yīng)用生物系統(tǒng)公司、恒溫培養(yǎng)箱購自上海譜元儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測PlexinA蛋白表達(dá):將收集的組織樣本固定包埋并切片，用二甲苯和梯度乙醇脫蠟后置于檸檬酸鹽緩沖液中進行修復(fù)，以充分暴露抗原決定簇。然后用3%的過氧化氫室溫下浸泡10 min，封閉，分別加稀釋好的一抗4℃過夜孵育，次日沖洗干凈，分別加入適量生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min，清洗。加適量DAB作用2～5 min后用去離子水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染1.5～2 min，清洗后于梯度乙醇中脫水，二甲苯浸泡并干燥后用中性樹膠封片，鏡檢觀察并記錄實驗結(jié)果。由兩位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師對病理切片進行盲評。每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(×400)在光鏡下觀察，用陽性細(xì)胞染色強度和陽性細(xì)胞比例來判定染色結(jié)果。染色強度評分：無顯色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以染色細(xì)胞的陽性比例評分<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。上述2項積分相乘，積分0分為陰性(-)，≥1分為陽性。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng):液氮中取出人鼻咽癌鱗狀細(xì)胞株HEP-2，37℃水浴溶解，加入含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，離心去上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)，融合度到80%，采用0.25%的胰蛋白酶消化，采用完全培養(yǎng)基傳代。傳代次數(shù)一致且細(xì)胞處于對數(shù)期用于后續(xù)研究。

1.3.3 實時定量PCR檢測miR-497及PlexinA4mRNA的表達(dá):取200 mg癌組織及癌旁組織磨碎，Trizol液與組織處理液混合作用10 min，12 000 r/min離心10 min，去除上層清液，加入Trizol與氯仿震蕩混勻，12 000 r/min 離心20 min，加入異丙醇，用移液器吹打均勻，12 000 r/min離心后，棄去上層清液，留下層絮狀沉淀，加入Trizol與乙醇的混合液，離心棄上清。提取的RNA用DEPC水溶解，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄總的cDNA。按照SYBR方法進行實時定量PCR，并以U6為內(nèi)參。結(jié)果用2-ΔΔCT表示，設(shè)計試驗重復(fù)。檢測各組基因的表達(dá)量。引物miR-497 上游5’-CAGGGTCCGATTCA-3’下游5’-TAGCCGCACACTGTGGT-3’,PlexinA4上游5’-TCTCAGTACAACGTGC-3’上游5’-TAGCACTGGATCGAT-3’。

1.3.4 miR-497過表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建:調(diào)整鼻咽鱗狀細(xì)胞HEP-2濃度為1×106個/ml，取2 ml接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，采用Lipofectamine2000將濃度均為100 nmol/L的miR-497 mimics和陰性對照轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，以空脂質(zhì)體作為對照。

1.3.5 蛋白免疫印跡檢測PlexinA4蛋白的表達(dá):取轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液，裂解30 min，離心，條件為12 000 r/min，4℃ 10 min，收集上清。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白樣品和Loading buffer混合，100涉世度水域變性5 min，然后加入至制備好的SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25 μl，濃縮膠時調(diào)整電壓為60 V，分離膠電壓為120 V，結(jié)束后取出凝膠，4℃轉(zhuǎn)膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入一抗，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h。加入ECL顯影，采用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH作為內(nèi)參，分析蛋白水平。

1.3.6 雙熒光素酶報告基因檢測:利用PCR方法構(gòu)建PlexinA4-wt(野生型PlexinA4-2-3’UTR序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒)及PlexinA4-mut(突變型PlexinA4-2- 3’UTR序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒)，將1.3.1中HEP-2癌細(xì)胞復(fù)蘇，DMEM培養(yǎng)液將癌細(xì)胞稀釋到1×105/ml，接種到細(xì)胞培養(yǎng)板上，把PlexinA4-wt質(zhì)粒、PlexinA4-mut質(zhì)粒、miR-497模擬物和陰性對照轉(zhuǎn)染分別轉(zhuǎn)染至相應(yīng)的HEP-2癌細(xì)胞中，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h。檢測各組處理熒光素酶活性。

1.3.7 細(xì)胞侵襲實驗:8 μl的Matrigel覆蓋于transwell小室底部，消化液將試驗組及對照組細(xì)胞消化，細(xì)胞計數(shù)，吸取1×105個細(xì)胞加入到上室，下室加入細(xì)胞培養(yǎng)液，將小室置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出后用無水甲醇固定，用1%的結(jié)晶紫染色30 min，PBS沖洗多余染料，放于高倍鏡視野計數(shù)穿透細(xì)胞數(shù)。

1.3.8 細(xì)胞遷移實驗:取處于對數(shù)期的HEP-2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105接種于6孔板，用一次性接種環(huán)畫出無細(xì)胞區(qū)，采用磷酸緩沖液吸取劃痕后脫落的細(xì)胞并進行拍照，實驗分為3組：對照組、空白對照組、miR-497過表達(dá)組。培養(yǎng)24 h后進行拍照，觀察細(xì)胞遷移能力。

2 結(jié)果

2.1 miR-497及PlexinA4在鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示PlexinA4在鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率為86.67%(52/60)明顯高于癌旁組織中的陽性表達(dá)率33.33%(20/60)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=35.556，P=0.000)。qRT-PCR結(jié)果也顯示鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中的PlexinA4 mRNA的表達(dá)量顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-497的表達(dá)量顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1、2，表1、2。

2.2 miR-497過表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建 qRT-PCR結(jié)果顯示空白對照組和陰性對照組miR-497的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，過表達(dá)組中miR-497的表達(dá)量明顯高于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示成功構(gòu)建miR-497過表達(dá)細(xì)胞系。見圖3，表3。

圖1 PlexinA在鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)×400)

圖2 miR-497及PlexinA4 mRNA在鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

表1 PlexinA在鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織中的表達(dá) n=60,例(%)

類別miR-497 相對表達(dá)量PlexinA4 mRNA相對表達(dá)量鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織2.43±0.5410.29±1.24癌旁組織 13.07±1.763.21±0.34t值44.76842.653P值0.0000.000

圖3 RT-PCR檢測miR-497在鼻咽癌細(xì)胞HEP-2中的表達(dá)

表3 RT-PCR檢測miR-497在鼻咽癌細(xì)胞HEP-2中的表達(dá)

2.3 miR-497過表達(dá)對PlexinA4蛋白的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示miR-497過表達(dá)組中PlexinA4的表達(dá)明顯低于空白對照組與陰性對照組(P<0.01)，空白對照組和陰性對照組中PlexinA4的表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示miR-497能夠下調(diào)PlexinA4的表達(dá)。見圖4，表4。

圖4 miR-497過表達(dá)對PlexinA4蛋白的影響

表4 miR-497過表達(dá)對PlexinA4蛋白的影響

2.4 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果 雙熒光素酶報告基因檢測轉(zhuǎn)染miR-497后，PlexinA4-wt(野生型PlexinA4-2-3’UTR序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒)熒光活性的相對表達(dá)量受到顯著抑制(P<0.01)，PlexinA4-mut(突變型PlexinA4-2-3’UTR序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒)熒光活性的相對表達(dá)量沒有變化(P>0.05)。說明miR-497與PlexinA4具有靶向關(guān)系。見圖5，表5。

2.5 miR-497對HEP-2侵襲能力的影響 miR-497過表達(dá)組穿透細(xì)胞數(shù)明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，而空白對照組和陰性對照組穿透細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示miR-497能夠抑制HEP-2的侵襲能力。見圖6，表6。

2.6 miR-497對HEP-2遷移能力的影響 miR-497過表達(dá)組HEP-2遷移率明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而空白對照組和陰性對照組遷移率無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示miR-497能夠抑制HEP-2的遷移能力。見圖7，表7。

圖5 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果

項目熒光素酶活性相對表達(dá)量WtmutCon 0.86±0.090.91±0.15miR-4970.29±0.080.90±0.12t值8.1990.090P值0.0000.932

圖6 miR-497對HEP-2侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色×200)

表6 miR-497對HEP-2侵襲能力的影響 n=3,個,

3 討論

鼻咽癌因其發(fā)病位置比較隱蔽，不容易檢查，且早期癥狀復(fù)雜，缺少明顯的特征，所以往往被忽視，導(dǎo)致診斷和治療延誤。miRNA是通過堿基不完全互補的方式結(jié)合于靶基因上，從而影響腫瘤細(xì)胞的凋亡、遷徙與轉(zhuǎn)移，并引發(fā)周圍細(xì)胞的壞死與凋亡[9]。miR-497位于人類染色體17p13.1上，張蔚等[10]發(fā)現(xiàn)miR-497在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)受抑制，miR-497可以通過下調(diào)靶基因HPV-16 E6/E7影響癌細(xì)胞侵襲。王娟娟[11]采用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-497在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織。管曉翠等[12]研究表明在星形細(xì)胞瘤患者癌組織和血清中，miR-497的表達(dá)量下降。本研究采用RT-PCR檢測其在鼻咽癌組織和癌旁組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌組織中表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，提示miR-497在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。

圖7 miR-497對HEP-2遷移能力的影響

表7 miR-497對HEP-2遷移能力的影響

為了進一步觀察miR-497在鼻咽癌中的作用，本研究構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)miR-497的細(xì)胞系，結(jié)果顯示miR-497能夠明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞HEP-2的侵襲能力和遷移能力。PlexinA4作為神經(jīng)受體叢素的一員，能夠通過觸發(fā)Plexins相關(guān)的受體型和非受體型發(fā)揮生物功能，譬如調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和遷移等[13]，有文獻(xiàn)報道稱PlexinA4在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)，通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)PlexinA4表達(dá)后，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，S期細(xì)胞數(shù)量明顯減少[14]。本研究通過免疫組化檢測鼻咽鱗狀癌和癌旁組織中PlexinA4的表達(dá)，結(jié)果顯示PlexinA4在鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率為86.67%(52/60)，明顯高于癌旁組織中的陽性表達(dá)率33.33%(20/60)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=35.556，P=0.000)。qRT-PCR結(jié)果也顯示鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中的PlexinA4 mRNA的表達(dá)量顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，提示PlexinA4能夠促進鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)miR-497和PlexinA4 mRNA在喉鱗癌中的表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，且統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示miR-497、PlexinA4 與喉鱗癌的分化程度密切相關(guān)[15]，為了進一步觀察miR-497和PlexinA4的關(guān)系，本研究采用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫對miR-497的靶基因進行預(yù)測，并采用雙熒光素酶實驗檢測熒光素酶活性比值變化，結(jié)果顯示miR-497能夠明顯抑制靶基因PlexinA4在鼻咽癌細(xì)胞HEP-2中的翻譯水平。

綜上所述，miR-497在鼻咽鱗癌中高表達(dá)，高表達(dá)miR-497能夠抑制鼻咽鱗癌細(xì)胞系PlexinA4 基因減少及蛋白表達(dá)，并通過降低PlexinA4 的表達(dá)量來影響細(xì)胞轉(zhuǎn)移。可以將miR-497/PlexinA4作為研究的新方向，為新型的生物藥品提供理論基礎(chǔ)。