姜心禪，陳曉波，郭宇丹

(1.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，廣州 510000；2.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510000；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510000)

近年來，子宮腺肌病(adenomyosis，AM)的發(fā)病率逐年增高，患者的平均年齡降低，育齡期女性比例顯著增加[1]，臨床多以子宮彌漫性增大、不孕、痛經(jīng)或不規(guī)則陰道出血等原因就診[2]。目前除全子宮切除外，尚無根治的方法[3]，這對育齡期女性的身心健康造成了嚴(yán)重影響。前期研究表明，加味芍藥甘草湯通過調(diào)控P53/LIF/STAT3信號通路，能夠抑制子宮腺肌細(xì)胞增生[4]。本研究則在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討加味芍藥甘草湯治療AM的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選擇2018年7月至2018年12月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受全子宮切除術(shù)的子宮腺肌病患者3例(年齡42～54歲)，術(shù)前3個月未服用激素。手術(shù)室無菌獲取子宮腺肌癥病灶組織約2 cm3，置于冰浴PBS緩沖液中，所取病例均在術(shù)后30 min內(nèi)通過病理檢查確診。本次研究已獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、高糖培養(yǎng)基(DMEM)、Ⅰ型膠原酶、2.5 g/L胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；米非司酮片購自北京紫竹藥業(yè)有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、中藥飲片(芍藥、甘草、當(dāng)歸、三七和延胡索)購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥房；免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒，購自博士德生物技術(shù)有限公司；鼠抗波形蛋白單克隆抗體、鼠抗人廣譜角蛋白單克隆抗體、鼠抗人平滑肌肌動蛋白單克隆抗體，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；4%多聚甲醛溶液，購自LEAGENE公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自上海貝博生物有限公司；TS-8型轉(zhuǎn)移脫色搖床，購自江蘇省海門其林貝爾儀器制造有限公司；β-catenin兔單克隆抗體、p-EGFR(Tyr1068)兔單克隆抗體，購自CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶，購自GAPDH，SantaCruz公司；BCA法蛋白含量檢測試劑盒，購自南京凱基生物發(fā)展有限公司；RIPA裂解液，購自杭州碧云天生物科技有限公司；JEM-1200EX透射電鏡,購自日本JOEL公司；UCT超薄切片機(jī)，購自德國LEICA公司；轉(zhuǎn)移電泳槽，購自上海天能科技有限公司；蛋白電泳儀和垂直電泳槽，購自美國Biorad公司。

1.3 實驗藥物的配制

中藥高濃度組和中藥低濃度組：加味芍藥甘草湯(芍藥15 g，甘草6 g，延胡索15 g，當(dāng)歸10 g，三七10 g)水提液用無血清的DMEM分別配制成高濃度40 mg/ml和低濃度20 mg/ml的含藥培養(yǎng)液[4]；西藥組：用DMSO溶解25 mg米非司酮片，以無血清的DMEM配成 1×10-5mol/L 的貯備液；空白組：高糖DMEM培養(yǎng)基。

2 方法

2.1 子宮腺肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代

在無菌操作臺上用眼科剪取標(biāo)本中心部位，剪成1 mm3置于25 cm2培養(yǎng)瓶，加0.1 %I型膠原酶適量，置于37 ℃溫箱消化5～6 h。終止反應(yīng)時加10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，過濾后1000 rpm離心8 min棄上清，重復(fù)3次；用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成5×105個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，5 ml/瓶，37 ℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)。

當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部90 %左右時，需要進(jìn)行細(xì)胞傳代。吸出培養(yǎng)液并以PBS洗凈，將加入1 ml的0.25 %胰蛋白酶培養(yǎng)瓶放入37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中3 min。在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)決定終止消化的時間。加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液后吹打細(xì)胞，800 rpm離心6 min。棄上清后加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成1×105個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，接種于新培養(yǎng)瓶中。

2.2 細(xì)胞的免疫組化鑒定

第一次傳代細(xì)胞消化制成5×105個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，接種在12孔板中的爬片上，于37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后加入含10 %胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，以PBS沖洗3次，4 %多聚甲酸固定30 min；0.5 %Triton X-100孵育20 min，PBS清洗3次；3 %H2O2去離子水室溫孵育15 min，PBS清洗3次；滴加5 %BSA液以封閉，室溫放置30 min，加入相應(yīng)的一抗(平滑肌蛋白抗體、波形蛋白抗體、角蛋白抗體)后，4 ℃過夜；加生物素化二抗，于37 ℃中30 min，PBS清洗；滴加鏈霉素化親和素試劑，置于37 ℃中30 min，PBS清洗；DAB顯色：加入試劑后在鏡下觀察，控制顯色程度；滴加蒸餾水終止染色，洗凈后蘇木素復(fù)染10 min，滴加蒸餾水使反應(yīng)終止；取出爬片脫水、透明、封片、讀片、拍片，用PBS代替一抗作為陰性對照。

2.3 透射電鏡觀察加味芍藥甘草湯對細(xì)胞凋亡的影響

各組細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)后制成細(xì)胞懸液，加入等體積2.5%戊二醛固定液，2000 r/min離心10 min棄上清。加入胎牛血清和戊二醛入離心管，2000 r/min離心10 min棄上清。以2.5%戊二醛固定30 min后，PBS緩沖液清洗3 min×3 次，加1 g/L四氧化鋨固定30 min棄固定液，PBS緩沖液清洗3 min×3 次，乙醇梯度脫水后包埋，聚合72 h切片、染色，透射電鏡下觀察并拍片。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測加味芍藥甘草湯對細(xì)胞凋亡的影響

將細(xì)胞消化離心后種入6孔板里，放至5 %CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，至其融合度約90 %舍棄原培養(yǎng)液，加無血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，放至5 %CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中24 h，使細(xì)胞生長同步化。加入各組藥物后再培養(yǎng)24 h取出，用預(yù)冷的PBS洗1次棄上清；加適量0.25%的胰蛋白酶3 min(鏡下觀察其形態(tài)變化)，加2倍體積的含10 %胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，終止反應(yīng)；輕輕吹打貼壁細(xì)胞，1000 g離心5 min制成細(xì)胞懸液。加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻后，于4 ℃避光條件下孵育15 min。加入10 μL 碘化丙啶后輕輕混勻，于4 ℃避光條件下孵育5 min，1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

2.5 劃痕實驗檢測加味芍藥甘草湯對細(xì)胞遷移能力的影響

在6孔板中接種各組細(xì)胞，待融合度約為90 %時棄培養(yǎng)液，用PBS洗2次，加入無血清的DMEM饑餓處理24 h。棄培養(yǎng)液用10 μL槍頭劃痕，PBS洗2次后于倒置顯微鏡下攝片。等間距得在劃痕邊緣取6點測量寬度，取其平均值，記為0 h時劃痕寬度；每空中加入相應(yīng)藥物作用24 h后，再以相同的觀察點測量寬度。劃痕愈合率(%)=(0 h寬度-24 h寬度)/0 h寬度×100%。

2.6 Western blot檢測加味芍藥甘草湯對細(xì)胞中β-catenin、EGFR和p-EGFR蛋白的表達(dá)

收集細(xì)胞用冷PBS清洗2遍后，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解，12000 g 4 ℃離心15 min，取上清液測定蛋白含量，-80 ℃保存。蛋白用沸水煮5 min，SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，用電轉(zhuǎn)移法使蛋白轉(zhuǎn)移至PDVF膜上，5 %的脫脂牛奶封閉2 h后孵育對應(yīng)的2種一抗，4 ℃搖床過夜。PBST清洗后孵育二抗，室溫下輕搖2 h。ECL法發(fā)光，用Image QuantLAS4000(GE Healthcare)測定灰度值。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 原代培養(yǎng)細(xì)胞鑒定

經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法(角蛋白、波形蛋白、平滑肌肌動蛋白)鑒定(如圖 1)，所培養(yǎng)的3例原代細(xì)胞均為子宮腺肌細(xì)胞。

注：A.角蛋白;B.波形蛋白;C.平滑肌肌動蛋白(圖中箭頭指出的棕褐色部分均為相應(yīng)蛋白表達(dá)位置)圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定子宮腺肌細(xì)胞比較

3.2 AM細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化

注：A.中藥高濃度組(染色質(zhì)塊狀邊集并出現(xiàn)凋亡小體和大量空泡)；B.中藥低濃度組(染色質(zhì)散落于核膜下，有空泡樣改變)；C.西藥組(核仁稍縮小，染色質(zhì)部分凝聚);D.空白組(細(xì)胞未見凋亡改變)圖2 各組藥物干預(yù)24 h后子宮腺肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較

圖2示，各組藥物作用24 h后，中藥高濃度組細(xì)胞胞體變小，胞質(zhì)濃縮，胞內(nèi)核仁縮小，線粒體出現(xiàn)大量空泡，染色質(zhì)呈塊狀凝聚并散落分布等改變，有明顯的凋亡表現(xiàn)；中藥低濃度組細(xì)胞核仁縮小，染色質(zhì)邊聚于核膜下，部分線粒體空泡樣變；西藥組細(xì)胞核仁稍有縮小，部分染色質(zhì)凝聚，線粒體有空泡樣變趨勢；空白組細(xì)胞核中常染色質(zhì)多，胞漿中可見正常的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，無細(xì)胞凋亡變化。

3.3 細(xì)胞凋亡率測定

中藥高、低濃度組細(xì)胞的凋亡率明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。中藥高濃度組或中藥低濃度組與西藥組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.4 AM細(xì)胞遷移能力的改變

各組藥物作用24 h后，西藥組、空白組細(xì)胞不同程度地向中間遷移，而中藥高濃度組細(xì)胞間隙反而增大。遷移率如表2所示，高濃度和低濃度的加味芍藥甘草湯均能抑制AM細(xì)胞的遷移，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與西藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 加味芍藥甘草湯對子宮腺肌細(xì)胞凋亡率影響比較

表2 加味芍藥甘草湯對子宮腺肌細(xì)胞遷移率影響比較

注：A.中藥高濃度組;B.中藥低濃度組;C.西藥組;D.空白組圖3 AM細(xì)胞凋亡流式圖

3.5 AM細(xì)胞中β-catenin、EGFR和p-EGFR蛋白的表達(dá)量

圖4示，中藥高濃度組和中藥低濃度組細(xì)胞中β-catenin、EGFR和p-EGFR蛋白的表達(dá)均低于西藥組和空白組，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 加味芍藥甘草湯對子宮腺肌細(xì)胞中β-catenin、EGFR和p-EGFR蛋白表達(dá)的影響

注：a.中藥高濃度組;b.中藥低濃度組;c.西藥組;d.空白組圖4 AM細(xì)胞中β-catenin、EGFR和p-EGFR蛋白表達(dá)

4 討論

子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制尚不確定[6]，唯一根治的方法只有全子宮切除術(shù)，然而術(shù)后患者將喪失生育能力，目前接受度很低[3]。中醫(yī)藥治療本病可以保留患者的生育能力，同時能夠緩解引導(dǎo)不規(guī)則出血、痛經(jīng)等不適，有效地降低西藥和手術(shù)治療的副作用，具有不可替代的優(yōu)勢[5]。

子宮腺肌病屬于中醫(yī)學(xué)“癥瘕”范疇，多是由于瘀血蓄積于胞宮、阻滯氣血沖任所致，故臨床多表現(xiàn)為下腹部腫塊、行經(jīng)腹痛、經(jīng)期延長和不孕等。針對瘀血阻滯、不通則痛的病機(jī)，臨床當(dāng)以活血化瘀為主，輔以行氣止痛。加味芍藥甘草湯正是以活血行氣、化瘀止痛為法，由緩急止痛的經(jīng)方芍藥甘草湯化裁而來，并結(jié)合前期臨床療效觀察、中藥水煎劑HPLC指紋圖譜分析、細(xì)胞實驗和動物實驗優(yōu)化組方[7-9]，篩選出白芍、炙甘草、當(dāng)歸、三七、延胡索5味藥組成本方。研究顯示，加味芍藥甘草湯水提液能夠下調(diào)芳香化酶，阻斷病灶局部E2正反饋循環(huán)，并通過抑制c-Fos/c-Jun、P53/LIF/STAT3、RAS/MAPK/ERK等信號通路,降低子宮腺肌病病灶細(xì)胞的異常增殖,阻礙子宮腺肌病的發(fā)展[4,10-11]。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境的平衡和穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡，然而腫瘤細(xì)胞的顯著特性之一就是異常增殖。因此許多抗腫瘤藥物都會從促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡或抑制腫瘤細(xì)胞增殖的角度進(jìn)行研究。本研究顯示，經(jīng)加味芍藥甘草湯處理后，子宮腺肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)核仁縮小、染色質(zhì)邊聚、凋亡小體形成等凋亡樣改變，有效促進(jìn)了子宮腺肌細(xì)胞凋亡，同時抑制細(xì)胞遷移。

細(xì)胞行為學(xué)的變化與蛋白的表達(dá)息息相關(guān)，通過前期文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體EGFR(epidermal growth factor receptor，EGFR)是調(diào)控細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子，參與多條信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化和侵襲等過程，在腫瘤形成過程中具有重要意義[6]。同時β-catenin與EGFR關(guān)系極為密切，在EGFR的作用下，β-catenin聚集于核內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖；另一方面，β-catenin直接靶向EGFR并激活下游信號通路，兩者之間存在相互作用[12]。此外，β-catenin在子宮腺肌病上皮細(xì)胞中表達(dá)升高，異常激活的β-catenin誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮間質(zhì)化，促進(jìn)子宮腺肌病的發(fā)生[13]，通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路，有效控制子宮腺肌細(xì)胞增生[14]。同時考慮到EGFR只有磷酸化形成p-EGFR后才能真正發(fā)揮調(diào)控信號通路的作用，所以檢測經(jīng)中藥處理后細(xì)胞內(nèi)β-catenin、EGFR和p-EGFR蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果顯示，加味芍藥甘草湯對于降低EGFR、p-EGFR和β-catenin的表達(dá)是有顯著性差異的，提示在EGFR和p-EGFR表達(dá)降低后，抑制β-catenin在核內(nèi)的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；同時β-catenin表達(dá)水平降低后，減弱對EGFR的靶向激活作用，也加速細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究進(jìn)一步闡釋了加味芍藥甘草湯治療子宮腺肌病的作用機(jī)制，為臨床治療本病提供了新思路與實驗基礎(chǔ)。