劉 劍 李南林

(肇慶市林業(yè)局森林病蟲害防治檢疫站，廣東 肇慶 526040)

我國作為世界上竹林面積最大、竹類資源最為豐富的國家，竹材資源的利用始終受到木質(zhì)素降解的影響，導(dǎo)致竹類資源一直難以實(shí)現(xiàn)綜合利用[1-3]。竹材木質(zhì)素因木質(zhì)素化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，常同纖維等物質(zhì)結(jié)合緊密，難于降解[4]。因此，竹材木質(zhì)素的降解一直受到研究者的關(guān)注，而天然竹材木質(zhì)素的降解是在自然條件下，通過多種微生物共同作用完成的，而微生物對(duì)竹材木質(zhì)素的降解不僅有降解率高的優(yōu)點(diǎn)，而且還能實(shí)現(xiàn)竹材資源的再利用，篩選具有良好降解能力的木質(zhì)素降解菌一直是研究者關(guān)注的問題[5-6]。文章以天然竹林中腐爛的竹材為材料，通過篩選得到一株具有竹材木質(zhì)素降解能力的菌株，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，為解決竹材木質(zhì)素降解及竹纖維提取等竹資源應(yīng)用方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

分離樣品采集于廣東省肇慶市廣寧縣市屬葵垌國有林場(chǎng)天然竹林中腐爛的竹材。

1.2 培養(yǎng)基

真菌培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱：PDA 培養(yǎng)基）；PDA 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入愈創(chuàng)木酚（0.5 g/L）和苯胺藍(lán)（0.1 g/L）制作PDA-愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基和PDA-苯胺藍(lán)培養(yǎng)基；液態(tài)產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L）：葡萄糖 20 g/L，酒石酸銨0.2 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.1 g/L，硫胺素(VB1)0.1 g/L，CuSO47H2O 0.007 g/L，MnSO40.035 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L，COCl2·6H2O 0.001 g/L，吐溫-80 1.0 g/L[7]。

1.3 方法

1.3.1 篩選竹材木質(zhì)素降解菌 通過平板稀釋法、平板劃線法對(duì)竹材木質(zhì)素降解菌進(jìn)行分離純化，將分離純化的菌株通過PDA-愈創(chuàng)木酚變色及PDA-苯胺藍(lán)退色反應(yīng)進(jìn)行初篩，將初篩得到的菌株進(jìn)行酶活力復(fù)篩，主要測(cè)定3 種木質(zhì)素降解酶活力，其中漆酶（Lac）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[8]；木質(zhì)素過氧化物酶（Lip）活性測(cè)定采用黎蘆醇法[9]；錳過氧化物酶（Mnp）活性測(cè)定采用微量法[10]。

1.3.2 菌株的鑒定

（1）菌落的形態(tài)觀察鑒定

將FG-22 菌株在PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)平板上菌落形態(tài)和菌絲進(jìn)行觀察并根據(jù)魏景超著真菌分類學(xué)手冊(cè)《真菌鑒定手冊(cè)》[11]進(jìn)行鑒定分類。

（2）菌株的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)FG-22 菌株的基因組總DNA 提取方法采用CTAB 法[12];以ITS1（5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’）和ITS4（5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’）為引物對(duì)提取的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[13], PCR 擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[14]，并將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物委托鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行基因測(cè)序；通過將所測(cè)得的18SrDNA 序列與NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行相似性比較分析，再通過MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析，構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 木質(zhì)素降解菌株的篩選分離

利用腐爛的竹材，根據(jù)不同的菌落形態(tài)通過平板劃線法分離純化得到74 株真菌菌株。

2.2 木質(zhì)素降解菌的初篩

2.2.1 PDA-愈創(chuàng)木酚平板顯色的篩選結(jié)果 將2.1 篩選分離得到的74 株真菌接種到PDA-愈創(chuàng)木酚平板培養(yǎng)基上進(jìn)行顯色反應(yīng)，其中19 株菌株產(chǎn)生明顯的顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)結(jié)果詳見表1。顯色反應(yīng)見圖1。

表1 PDA-愈創(chuàng)木酚平板顯色初篩19 個(gè)菌株的顯色結(jié)果Tab.1 Primary screening of 19 strains by PDA-Guaiacol plate chromatography

注：- 表示不顯色；±代表開始顯色；+、+ +、+ + +、+ + + +顯色圈逐漸增大Note: - indicates no color rendering; ± indicates start of color rendering; +, + +, + + +, + + + + color developing circles increase gradually

通過表1 可以得出，19 個(gè)菌株都可在PDA-愈創(chuàng)木酚平板培養(yǎng)基上產(chǎn)生顯色反應(yīng)，顏色隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增強(qiáng)。而不同的菌株在顯色時(shí)間和顯色圈大小有差異，F(xiàn)G-08、FG-19、FG-22、FG-45、FG-63和FG-69 等6 個(gè)菌株顯色反應(yīng)較快，并且顯色圈較大。由此可判斷出FG-08、FG-19、FG-22、FG-45、FG-63 和FG-69 這6 株菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)漆酶（Lac）能力。

2.2.2 PDA-苯胺藍(lán)平板退色的篩選結(jié)果 根據(jù)PDA-愈創(chuàng)木酚平板顯色反應(yīng)結(jié)果，將在PDA-愈創(chuàng)木酚平板顯色的19 種菌株接種在PDA-苯胺藍(lán)中進(jìn)行退色反應(yīng)。

表2 菌株的PDA-苯胺藍(lán)平板退色反應(yīng)結(jié)果Tab.2 Discoloration of fungi by PDA-Aniline Blue Plate

圖1 菌株FG-22 愈創(chuàng)木酚變色及苯胺藍(lán)退色Fig.1 Discoloration of guaiacol and decolorization of aniline blue by fungus FG-22

通過表2 可以看出，19 種菌株中發(fā)現(xiàn)有7 株菌（FG-04、FG-19、FG-22、FG-27、FG-33、FG-45 和FG-69）在PDA-苯胺藍(lán)平板上發(fā)生明顯退色反應(yīng)，并且在第4-6 天退色較為明顯的為FG-19、FG-22、FG-45、FG-69，并且出現(xiàn)全退色現(xiàn)象。由此初步表明這4 株菌株有產(chǎn)過氧化物酶類（Mnp 和Lip）的能力，而其他菌株未發(fā)生退色反應(yīng)或退色反應(yīng)不明顯，表明不產(chǎn)生降解木素質(zhì)的過氧化物酶類。PDA-苯胺藍(lán)退色反應(yīng)詳見圖1。

2.3 4 個(gè)菌株的復(fù)篩

根據(jù)以上PDA-愈創(chuàng)木酚平板顯色反應(yīng)及PDA-苯胺藍(lán)平板退色反應(yīng)的初篩結(jié)果，對(duì)FG-19、FG-22、FG-45、FG-69 菌株進(jìn)行液態(tài)產(chǎn)酶復(fù)篩，測(cè)定其各自發(fā)酵液中漆酶（Lac）及過氧化物酶類（Mnp 和Lip）的酶活力，結(jié)果見圖2 和圖3。

圖2 4 個(gè)菌株的Lac 酶活變化Fig.2 Breakdown charts of lactase activities of four fungi

圖3 4 個(gè)菌株的過氧化物酶類（Mnp 和Lip ）酶活變化Fig.3 Breakdown charts of peroxidase (Mnp and Lip) activities in four fungi

從圖2 可以看出，4 個(gè)菌株均可出產(chǎn)Lac，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)酶活力不斷發(fā)生變化。從第5 天起各菌株的酶活明顯增高，在7～9 d 時(shí)分別達(dá)到產(chǎn)酶高峰值。在第7 天，F(xiàn)G-22 具有最高的產(chǎn)酶值，其酶活可達(dá)到10.8 U·mL-1，是FG-69 的7.14 倍。FG-19 和FG-45 的產(chǎn)酶能力比較接近。在酶活達(dá)到最高峰后，各菌株酶活開始逐漸下降直至趨于穩(wěn)定。

從圖3 可以看出，4 個(gè)菌株均有一定產(chǎn)生過氧化物酶類（MnP 和LiP）的能力。在第9 天，F(xiàn)G-22 達(dá)到最大產(chǎn)酶高峰，酶活力為20.16 U·mL-1，為FG-69 的2.2 倍。酶活力不斷達(dá)到高峰后恢復(fù)至穩(wěn)定，酶活力始終維持在19 U·mL-1。而FG-19 的過氧化物酶類最高酶活力雖然達(dá)到21.87 U·mL-1，但FG-19 的漆酶活力明顯小于FG-22。因此，綜合以上結(jié)果，菌株FG-22 具有較高的產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的綜合能力。

2.4 菌株FG-22 的鑒定

2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株FG-22 的鑒定：FG-22 菌株在平板上快速呈現(xiàn)出菌落特征，菌落呈白色、圓形，菌落成長(zhǎng)較快，在平板培養(yǎng)7～9 d 就覆蓋平板，菌落新生長(zhǎng)區(qū)的菌絲分布均勻，呈分散、有序的絮狀，菌落，表面較為平滑，新生長(zhǎng)的菌絲無色，呈節(jié)狀分隔。

2.4.2 菌株FG-22 的rDNAITS 區(qū)PCR 擴(kuò)增結(jié)果 根據(jù)分子生物學(xué)的測(cè)序結(jié)果，所測(cè)得的序列如下所示：

AGTTGTACTGCGGAGACATTAACGAGTTTTGAACGAGTTGTAGCTGGCCTTCCGGGGCATGTGCACGCTCTGCTCATCCACTCTACCCCTGTGCACTTACTGTAGGTTGGCGTGGGCTCCTTTGCGGGAGCATTCTGCCGGCCTATGTATACTACAAACACTTTAAAGTATCAGAATGTAAACGCGTCTAACGCATCTATAATACAACTTTTAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGGAATTCTCAACTTATAAATCCTTGTGATCTATAAGCTTGGACTTGGAGGCTTGCTGGCCCTTGTTGGTCGGCTCCTCTTGAATGCATTGGCTCGATTCCGTACGGATCGGCTCTCAGTGTGATAATTGTCTACGCTGTGACCGTGAAGTGTTTTGGCGAGCTTCTAACCGTCCATTAGGACAACTTTTTAACATCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCCTAGTAACTGCGAGTGAAGCGGGAAAAGCTCAAATTTAAAATCTGGCGGTCTTTGGCCGTCCGAGTTGTAGTCTGGAGAAGCGTCTTCCGCGCTGGACCGTGTACAAGTCTCCTGA

2.4.3 系統(tǒng)發(fā)育樹 利用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），通過基因序列相似性對(duì)比和系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析，菌株FG-22 與接收號(hào)為AY840585（Trametes versicolor）的ITS 序列最為接近，相似度達(dá)到98%，結(jié)合FG-22 菌落的形態(tài)特征，初步確定FG-22 屬多孔科、云芝屬的雜色云芝（Trametes versicolor）。

圖4 基于菌株FG-22 及來自GenBank 的ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic trees based on FG-22 fungi and ITS sequences from GenBank

3 結(jié)論與討論

3.1 通過平板劃線法對(duì)49 份腐爛的竹材樣品中分離純化得到74 株真菌，并對(duì)74 株真菌進(jìn)行木質(zhì)素降解篩選，經(jīng)過PDA-愈創(chuàng)木酚平板變色初篩得到19 株變色明顯的菌株，并對(duì)這19 株進(jìn)行PDA-苯胺藍(lán)退色篩選，其中FG-19、FG-22、FG-45、FG-694 株菌退色較為明顯，并對(duì)這4 株菌進(jìn)行酶活力測(cè)定復(fù)篩，通過酶活力測(cè)定發(fā)現(xiàn)菌株FG-22 具有較好的降解木質(zhì)素的綜合酶活力。

3.2 通過對(duì)FG-22 進(jìn)行菌落形態(tài)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等分子生物學(xué)鑒定，確定FG-22 菌株屬多孔科、云芝屬的雜色云芝（Trametes versicolor）。

3.3 自然界中，木質(zhì)素的降解主要是通過真菌、細(xì)菌和微生物的共同作用，其中真菌在降解木質(zhì)素中扮演著非常重要的作用，而研究者也將研究的重點(diǎn)側(cè)重于真菌對(duì)木質(zhì)素的降解，目前，研究較多的有黃孢原毛平革菌、變色栓菌、煙管菌、彩絨革蓋菌等白腐菌[15]。而文章通過從天然腐爛的竹材中新分離篩選得到一株新的木質(zhì)素降解菌——雜色云芝（Trametes versicolor），對(duì)竹材木質(zhì)素的降解更有效，為竹材木質(zhì)素降解的進(jìn)一步研究提供借鑒和參考。