劉建鳳, 姚瑩, 趙婕, 蘇智, 魏建榮

(1.河北大學生命科學學院, 河北 保定 071002; 2.中國林業(yè)科學研究院沙漠林業(yè)實驗中心, 內蒙古 磴口 015200)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)為胡頹子科沙棘屬落葉灌木或小喬木，是荒漠化防治和水土保持的重要生態(tài)、經濟樹種，在亞歐大陸分布廣泛，一般存在于溫帶、寒溫帶等地區(qū),還有一些亞熱帶高山區(qū)，在北美地區(qū)引種栽培也進行了實驗觀察[1]。我國沙棘資源比較豐富，遍及西南、西北、華北和東北等區(qū)域。沙棘果實富含維生素、氨基酸、不飽和脂肪酸等多種生物活性物質，可以增強人體免疫及抗腫瘤等機能[2-3]。沙棘也具有較好的經濟效益，其果實具有豐富的營養(yǎng)，作為食品原料廣泛應用，還具有抗氧化等功效，廣泛應用于保健品和化妝品中。目前，沙棘在我國已經發(fā)展成為一種重要生態(tài)經濟型樹種。

沙棘木蠹蛾(Eogystiahippophaecolus)、紅緣天牛(AsiashalodendriPalla)、沙棘繞實蠅和沙棘象鼻蟲(Elaeidobiuskamerunicus)是危害沙棘的主要害蟲。其中，沙棘木蠹蛾是嚴重危害沙棘林的重大鉆蛀性害蟲。遼寧省建平縣曾有1 530 hm2沙棘林，是世界上規(guī)模較大的人工沙棘林之一，但由于干旱、蟲害等生物非生物脅迫等原因，給這個人工沙棘林帶來巨大的破壞，同時也影響了相關的沙棘產業(yè)[4]。紅緣天牛屬天牛科，一年一代，跨越兩個年度，其幼蟲蛀食長勢較弱的樹干，成蟲取食沙棘嫩葉及嫩枝[5]。沙棘繞實蠅是危害沙棘果實的主要害蟲[6-7]，自1985年在遼寧省建平縣首次發(fā)生危害以來[8]，先后在內蒙古巴彥淖爾和新疆阿勒泰地區(qū)的沙棘林中暴發(fā)成災，導致沙棘果實幾近絕收，對相關的食品和藥用加工企業(yè)造成了巨大的經濟損失。沙棘象鼻蟲也是危害果實的主要害蟲，其主要通過取食沙棘幼果的種仁(而非果汁)獲取營養(yǎng)。取食時，成蟲以喙管穿入果皮，并以喙管插入點為中心，每粒果實只取食一次。每頭成蟲每天取食4～9粒果實[9]。上述害蟲大發(fā)生時，均給沙棘產業(yè)造成巨大的經濟損失。

目前，林木抗蟲機制及通過基因工程培育抗蟲新品種是抗蟲性研究的主要方向，而植物抗蟲基因的挖掘及其在林木分子育種中的應用更是研究的熱點。鑒于此，本文詳述了沙棘主要害蟲的抗蟲性機制及分子育種研究展開詳述，并提出相關抗蟲基因工程、抗蟲分子機制及展望，以期為我國沙棘抗蟲性研究提供一定的理論基礎，并為抗蟲沙棘分子育種改良與應用提供科學依據(jù)。

1 沙棘的抗蟲機制

林木與昆蟲長期互作，協(xié)同進化，形成了組成型和誘導型兩種防御性機制。組成型防御性機制是由遺傳因素影響決定的，植物會形成一種物理或化學因子，通過防止害蟲取食達到保護植株的效果；誘導型防御性機制是由病原菌侵染或是機械損傷等誘導產生的免疫應答反應[10]。

1.1 組成型抗蟲防御

組成型防御是植物本身具有的，分為物理組成型抗蟲防御和化學物質組成型抗蟲防御，受外界因素影響較小。

1.1.1物理組成型抗蟲防御 物理防御是指林木在長期進化過程中形成了多種防御害蟲入侵的外部形態(tài)特征和內部組織結構，形成物理防御系統(tǒng)來阻止害蟲對沙棘果實的傷害行為[11]。如針葉樹篩管絲團中混有的草酸鈣晶體也可有效抵抗樹皮甲蟲[12]；柳藍葉甲幼蟲更易取食被去除絨毛的柳樹嫩葉[13]；美國西部白松(Pinusbungeana)外皮層含有較多的樹脂道，對沙棘象鼻蟲具有一定的抗性[14]；奧利維爾甲蟲的幼蟲只能以桉樹比較幼嫩的葉片作為食物[15]。物理防御機制是一些大型喬木和裸子植物的常見防御類型，但在胡頹子科沙棘屬落葉性灌木的相關研究報道較少，趙延霞等[16]分析了6個沙棘亞種(品種和雜交種)根、莖和葉的組織結構特征及其與沙棘木蠹蛾抗性的關系，明確了沙棘葉背、葉面表面皮毛與沙棘抗蟲性之間的關系。

本課題組前期通過電鏡掃描發(fā)現(xiàn)，不同抗、感沙棘植株的葉片表皮，果皮以及莖的表面均分布著大量的鱗片狀毛狀體。其中在抗蟲植株的表皮組織中毛狀體分布密集，且在葉片下表皮和果皮中有重疊現(xiàn)象；而敏感植株表皮中的毛狀體相對稀疏(圖1)。進一步對沙棘繞實蠅的產卵選擇性進行了測定，發(fā)現(xiàn)在敏感植株葉片、莖和果實上的產卵數(shù)量均高于抗蟲植株[17]，表明繞實蠅成蟲偏向于選擇毛狀體分布少的沙棘作為主要產卵寄主。由此推測，毛狀體的分布密度是影響沙棘繞實蠅產卵選擇性差異的重要因素，即沙棘表皮毛狀體與抗蟲性密切相關，沙棘可通過增加毛狀體分布密度來進行物理防御。

圖1 不同抗、感無性系毛狀體分布密度差異[16]Fig.1 Trichome distribution density in resistant and sensitive plants[16]

1.1.2化學物質組成型抗蟲防御 化學物質組成型防御是植物利用本身固有的對害蟲具有抗性的化學物質實現(xiàn)抗蟲功能。這些化學物質主要分為兩類：一類主要有核酸、蛋白質、糖類和脂類等初級營養(yǎng)物質。如白樺(Betulaplatyphyll) 隨著昆蟲的生長，存在于葉片中的兩種糖含量會降低[18]；毛白楊(Populustomentosa) 抗蟲性受到無性系樹皮內總糖含量的影響，含量高的時候毛白楊抗蟲性較差[19]；木質部碳水化合物含量較低有利于幼蟲取食[20]；脂肪酸類物質可通過滲透和堵塞白紋伊蚊呼吸道并覆蓋呼吸細胞表面，造成呼吸系統(tǒng)細胞膜破壞對昆蟲達到致死作用[21]。另一類主要是植物的次生代謝物，為了應對植物遇到的生物脅迫與非生物脅迫，會產生萜烯類、酚類和含氮化合物，這些物質的合成和分布具有特異性[22]。

綜上，物理與化學防御的共同作用是植物最常見的基礎防御?；诖耍蓮纳臣锢?、化學物質等組成型防御角度對沙棘抗蟲性機制及開發(fā)利用深入開展相關工作。

1.2 誘導型抗蟲防御

誘導型防御是樹木受到侵害時，通過激發(fā)基因調控表達改變自身的理化性質來達到防御目的[23]。誘導型防御系統(tǒng)具有保守、復雜、精密的特點，并具有持續(xù)性、傳遞性等特點。這個系統(tǒng)會讓植物自身產生大量的次生代謝產物以及防御蛋白，以此形成一個復雜的防御體系，當昆蟲取食時，植物與昆蟲進行接觸互作，啟動防御系統(tǒng)來應對昆蟲攝食帶來的病原菌并有效抵御害蟲侵害[24]。林木的誘導型防御主要包括可誘導的化學防御、蛋白防御和生態(tài)防御等類型[18]。

1.2.1化學物質誘導型抗蟲防御 化學物質誘導防御是植物的主要防御方式之一，受到昆蟲侵害時植物會產生低分子量酚類、萜類及生物堿類物質，這些物質具有抗菌性和毒性，并抑制攝食昆蟲的消化吸收繁殖等生理功能。有研究發(fā)現(xiàn)，擁有抗蟲基因的白云杉植株被云杉蚜蟲取食后，酚類化合物pungenol 和piceol 合成量顯著增加，使昆蟲的取食量受到顯著影響，有效保護植物自身[25]。

1.2.2蛋白抗蟲防御 蛋白防御是一個復雜的系統(tǒng)，在這整個防御網絡中主要涉及氧化水解酶和蛋白抑制劑，主要功能是抗菌，抑制幼蟲生長和昆蟲的營養(yǎng)吸收。PR-3 蛋白家族具有抑制昆蟲生長的作用，通過破壞真菌細胞壁及細胞膜來完成，而PR-6 蛋白家族則被發(fā)現(xiàn)具有抑制昆蟲營養(yǎng)吸收的作用，是一些昆蟲的消化酶抑制劑[26]。除此之外，多酚氧化酶還有減少昆蟲吸收氨基酸的作用，抑制昆蟲對植物營養(yǎng)攝取消化，作用機制是通過氧化被取食植物種的酚類物質成為醌類化合物，醌類化合物再與昆蟲腸道蛋白交聯(lián)達到目的[27]。

1.2.3生態(tài)抗蟲防御 生態(tài)防御主要是通過“宿主-昆蟲-天敵”的取食關系來實現(xiàn)的。如北美香柏(Thujaoccidentalis)根部受到黑象甲(CosmopolitessordidusGermar)幼蟲侵害時，會釋放乙酸葉醇酯來吸引其天敵桿線蟲(Ceanorhabditiselegans)[28]。植物與植食性昆蟲在長期的相互過程中形成了多種防御機制，進而快速適應環(huán)境。上述防御機制在其他林木抗蟲功能研究中已有廣泛報道，這為進一步深入研究各種誘導防御機制參與沙棘抗蟲的調控過程提供了重要的理論依據(jù)。

本課題組前期對抗、感沙棘植株抗繞實蠅研究中發(fā)現(xiàn)，抗、感沙棘無性系中分別含有醛類、酯類、醇類、酸類、酚類和甲基硫等多種化學防御物質。其中，抗蟲沙棘植株中酯類物質含量明顯低于敏感植株，而醛類物質含量明顯高于敏感植株，這些化學物質直接或間接參與了沙棘抵御繞實蠅的防衛(wèi)。同時，在繞實蠅產卵盛期，抗蟲沙棘無性系內可溶性蛋白和脯氨酸等防御蛋白含量均顯著高于與敏感無性系，表明沙棘植株可以通過產生化學防御物質來抵御繞實蠅的危害[17]。

1.3 激素相關信號通路介導的植株抗蟲機制

昆蟲從植物中攝取營養(yǎng)物質有多種手段，同時植物應對昆蟲的侵害也進化出了多種防御機制，如可通過轉錄因子調控茉莉酸(JA)、水楊酸(SA) 和乙烯(ET) 等信號途徑[29]參與植株的防御防衛(wèi)。植物WRKY轉錄因子既可通過參與JA、ET和SA信號代謝途徑，也可作用于下游靶基因來提高植株的抗逆性[30-33]。如火龍果(Hylocereuspolyrhizus)HpWRKY44可通過調控下游靶基因CYP450-like1的表達，從而表現(xiàn)出對不同逆境的應答反應[33]；陸地棉(Ghossypiumhirsutum)GhWRKY40基因通過調控MPK-WRKY-茉莉酸(JA)或ET信號通路來提高植株對白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)的抗性[34]；水稻(Oryzasativa)OsWRKY24/70/53/45通過影響乙烯(ET)信號途徑來參與調控抗褐飛虱(Nilaparvatalugens)反應[35-37]。還有研究發(fā)現(xiàn)，大豆(Glycinemax)WRKY家族成員受水楊酸(SA)信號通路誘導提高了植株抗大豆胞囊線蟲的能力[38]。

盡管國內外學者在WRKY轉錄因子信號通路等方面開展了一些研究，但多集中在模式植物擬南芥、水稻及經濟作物大豆和棉花中，有關胡頹子科植物WRKY成員分子特征及介導毛狀體分布密度參與抗蟲的分子機制，迄今未見有相關論文發(fā)表。本課題組利用沙棘轉錄數(shù)據(jù)，獲得了沙棘HrWRKY基因家族成員48個，其中HrWRKY44與擬南芥AtWRKY44有同源性，據(jù)此推測沙棘HrWRKY44可能通過某種信號途徑參與了植株毛狀體的形態(tài)建成，進而提高了植株的抗蟲性。

2 沙棘抗蟲性分子育種研究

目前，林木抗蟲育種主要是利用抗性資源進行常規(guī)育種，但由于林木抗蟲的復雜性以及林木、昆蟲互作機制研究的局限性，林木抗蟲育種一直是林業(yè)生產上的重大科學問題。近年來分子育種技術的快速發(fā)展為林木抗蟲育種提供了有效的探索途徑，各研究學者對抗蟲基因進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)并挖掘植物中的各種抗蟲基因病，深入研究植物體內的各種抗蟲機制，為林木抗蟲基因工程育種提供了大量資料。目前已對多種樹種的分子抗蟲機制進行了深入研究，通過轉基因獲得抗性植株，其中很多研究成果已經投入到了生產應用中[39-40]。與上述林木相比，有關沙棘抗蟲相關的常規(guī)育種或分子育種研究鮮見報道。本課題組在中國林業(yè)科學研究院沙漠林業(yè)實驗中心經過數(shù)年的調查，發(fā)現(xiàn)了少量的高抗繞實蠅沙棘植株，開展了生理水平、揮發(fā)性物質和次生代謝物質等方面的研究，發(fā)現(xiàn)一些次生代謝物質不同程度參與了植株的抗蟲性[17]。這些具有抗蟲優(yōu)良性狀的植株為深入研究沙棘抗蟲的分子機制提供了重要的種質資源。

2.1 分子標記輔助育種

種質資源的鑒定是林木育種的重要保障，同時為林業(yè)科研和生產也提供很大幫助。傳統(tǒng)的形態(tài)學和生化鑒定方法已無法滿足科研、生產需要，隨著深入研究以及科技發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了分子標記技術，從分子的角度對林木種質資源進行鑒定和純度分析研究。如Fossati[41]通過 AFLP 分子標記技術，將形態(tài)上不能區(qū)分的天然歐洲山楊、銀白楊、銀灰楊的雜種區(qū)進行區(qū)分。Ruan和Li[42]用RAPD 分析了來自中國、俄羅斯、蒙古的14個不同沙棘品種的遺傳關系。沙棘在品種篩選過程中已運用了分子標記輔助育種技術，但還未運用到沙棘抗蟲性研究中。由此可見，尋找與經濟性狀緊密連鎖的分子標記，為沙棘分子標記輔助育種提供可靠的科學依據(jù)，對培育沙棘抗蟲品種具有重大幫助。

2.2 轉基因抗蟲育種

轉基因作為重要的生物技術，在林木抗蟲育種工作中廣泛應用。通過DNA重組技術，將一些外源帶有抗性的目的基因導入到林木染色體中，從而使外源抗蟲基因表達，表現(xiàn)出抗蟲性。目前研究表明，林木的抗蟲基因主要來源是微生物源、植物源、動物源，如蛋白酶抑制劑、淀粉酶抑制劑等[43]。轉基因作為重要的生物技術，在林木抗蟲育種工作中廣泛應用。通過DNA重組技術，將一些外源帶有抗性的目的基因導入到林木染色體中，從而使被轉移林木產生具有外源抗蟲基因表達，表現(xiàn)出抗蟲性。目前研究表明，林木的抗蟲基因主要來源是微生物源、植物源、動物源，如蛋白酶抑制劑、淀粉酶抑制劑等。農桿菌轉化、基因槍法和顯微注射法是比較常見的轉基因方法，其轉入的外源基因均是完整的ORF框，片段較長，插入具有一定的隨機性，而目前最熱門的基因編輯技術，轉化的僅僅是一個20 nt左右的片段，且能定點插入，具有精確改良與編輯目標片段的效果，該方法已經廣泛用于動物和一些模擬植物及經濟作物中，但在林木上開展研究還鮮見報道[44]，而目前最熱門的基因編輯技術在林木上還鮮見報道。

在抗蟲基因研究領域，利用分子標記法已在多個樹種上構建遺傳圖譜，通過克隆定位抗蟲的基因位點進行研究。毛狀體形態(tài)特征及分布密度是植株抗蟲性狀篩選的重要依據(jù)之一，而WRKY轉錄因子可以調控植株毛狀體分布密度和形態(tài)建成過程。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中AtWRKY44(又稱TTG2)是一個與表皮毛狀體和種皮發(fā)育相關的轉錄因子，也是首次揭示與植物形態(tài)發(fā)育有關的轉錄因子，且發(fā)現(xiàn)擬南芥AtWRKY44突變體植株的葉表面毛狀體分布密度降低，形態(tài)上無分支[26]；番茄(Solanumgalapagense)中SgWRKY基因的表達可以增加植株葉片毛狀體分布密度，從而提高其對白粉虱(Bemisiatabaci)的抗性[45]。向日葵(Helianthusannuus) HaWRKY轉錄因子調控參與頭狀花序邊花中毛狀體的分布密度，提高了植株抗蟲性[46]。本課題組發(fā)現(xiàn)，沙棘毛狀體分布密度與抗蟲性密切相關，因此，可基于分子標記構建遺傳圖譜或沙棘轉錄組數(shù)據(jù)挖掘WRKY轉錄因子家族成員，并解析其如何調控沙棘抗繞實蠅的生物學功能及作用機制，為沙棘抗蟲分子育種進行遺傳改良提供重要參考。

2.3 沉默基因抗蟲育種

RNA干擾技術主要是通過雙鏈RNA引發(fā)的基因沉默，是一些存在于昆蟲體內的重要基因在轉錄后表現(xiàn)的機制，為植物抗蟲防御方面起著很重要的作用。表達Snf7dsRNA的轉基因玉米可以有效的防御玉米根部受到西部玉米根蟲的侵害，其機理是該基因可以通過干擾昆蟲的Snf7基因表達基因沉默來影響其體內液泡的分選過程使昆蟲取食受到影響或者導致其死亡的基因表達[47]。此外，通過Crisp/Cas9基因編輯技術的反義遺傳學手段可以誘導玉米[47]、擬南芥[48]和水稻[49]等植物基因突變，比如基因組缺失突變、特殊序列替換或插入，可調節(jié)基因組內特異目標位點。最近研究表明，利用Crisp/Cas9技術將楊樹油菜素內酯合成相關的PtDWF4基因沉默后，抑制了楊樹幼苗的生長發(fā)育[50]。目前基因編輯技術在林木中的應用實例相對于其他植物的研究比較少，但這些技術手段對于沙棘中抗病基因的研究有很大幫助，以此來消除目的植株轉基因林木的篩選標記，對外源基因穩(wěn)定表達及降低嵌合體和變種的產生概率有很大幫助。

綜上，基因編輯技術應用于林木抗蟲植株雖然成效很好，但是因為技術、管理手段和生物安全等多方面因素，并未進行大規(guī)模商業(yè)化種植?，F(xiàn)階段，適用于林木可攜帶多基因并可以穩(wěn)定轉化的載體并不多，將啟動子特異性改造后活性也低?，F(xiàn)在林木的高效組培再生系統(tǒng)和基因轉化體系建成的還不完全，仍存在某些問題。目前大部分抗蟲機理還未明確，已知的、進行深入研究的抗蟲基因數(shù)目有限，還有待開發(fā)。沙棘具有獨特的生態(tài)及經濟價值，利用分子生物學手段進一步改良其抗蟲性狀是目前亟待解決的重要課題。因此，今后應加強沙棘等林木轉基因抗蟲育種的研究工作。

3 展望

沙棘具有保持水土的生態(tài)作用，也具有重要的營養(yǎng)價值及藥用價值。但近年來沙棘象鼻蟲、沙棘繞實蠅、紅緣天牛、沙棘木蠹蛾等害蟲已經嚴重影響到沙棘的正常生長，因此加強對沙棘抗蟲性的研究變得至關重要。在以后對沙棘抗蟲性相關研究中需要加強以下幾個方面：①重視沙棘基因組的測序工作，樹木基因組測序是分子育種的重要基礎，是分子育種技術的支撐，這是一項基礎性、戰(zhàn)略性的工作；②轉基因植株抗蟲防御物質直接或間接參與植株抗蟲的作用機制，應考慮多種防御機制對植株抗蟲性所產生的綜合影響，深入研究外源基因響應植株抗蟲的分子機制，并進一步探索有利于抗蟲基因穩(wěn)定表達的培育環(huán)境和措施；③合理利用某些抗蟲特征性狀，從分子角度獲得抗蟲關鍵基因，將其利用在改良沙棘等林木品種的抗蟲研究中；④利用轉錄組學、代謝組學和蛋白質組學等多種組學及分子生物學方法，對抗蟲關鍵基因在調控植株抗蟲方面開展生物學功能研究，探明該基因通過調控哪種信號途徑或下游靶基因來參與植株抗蟲的分子機制；⑤堅持與其他學科溝通交流進行研究，以分子標記技術為主的研究，將林木遺傳育種與其他各學科相結合，從分子、細胞、生態(tài)、表型方面綜合論述評定，整體上從各個學科相互交融中綜合分析林木的遺傳機制，明確他的數(shù)量性狀等復雜調控機制，在明確林木自身作用機制的同時，也兼顧他的經濟價值，弄清遺傳機制，建立數(shù)學模型進行分析，為之后的研究打下堅實基礎?？傊鳛樯臣蒲泄ぷ髡邞摃r刻關注植物學抗蟲領域的研究進展，學習并借鑒應用新的技術和方法，為沙棘育種方面做出貢獻，推動沙棘分子育種科學發(fā)展和經濟發(fā)展，為沙棘抗蟲新品種育種和高產提供新的技術手段。