鐘慧鈺，趙珍珍，宋興勃，陸小軍，王旻晉，周 易，宋佳佳，劉堂喻亨，巫麗娟，周汶靜，葉遠(yuǎn)馨，斯艷君，周燕虹，陶昕彤，王 念，應(yīng)斌武

(四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科,四川成都 610041)

2019新型冠狀病毒(以下簡(jiǎn)稱(chēng)新冠病毒)是一種新型β屬冠狀病毒，屬于單鏈RNA病毒，可引起人類(lèi)呼吸道感染，其基因特征與嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)相關(guān)冠狀病毒和中東呼吸綜合征(MERS)相關(guān)冠狀病毒有明顯區(qū)別，基因組序列約由29 kb構(gòu)成，擁有10個(gè)基因，可有效編碼10個(gè)蛋白[1]。該病毒感染人類(lèi)引起的肺炎自2019年12月在湖北省武漢市發(fā)現(xiàn)以來(lái),截至2月22日24時(shí)，據(jù)31個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)及新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)報(bào)告，現(xiàn)有確診病例51 606例(其中重癥病例10 968例)[2]。國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)于2020年2月12日正式將其命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)。由于疫情發(fā)展迅速，對(duì)不同程度臨床癥狀患者及疑似患者進(jìn)行診斷需要快速有效的方法，而新冠病毒核酸檢測(cè)可為診斷提供直接證據(jù)，在目前最新版本診療方案中，新冠病毒核酸的檢出仍是唯一確診依據(jù)[3]。由于是新發(fā)疾病，從新冠病毒所致感染病程到新冠病毒核酸檢測(cè)技術(shù)等各個(gè)方面均缺乏大量科學(xué)數(shù)據(jù)支撐，在開(kāi)展核酸檢測(cè)過(guò)程中的各個(gè)環(huán)節(jié)中存在較多問(wèn)題。本文將圍繞目前新冠病毒核酸檢測(cè)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及其中可能影響核酸檢測(cè)結(jié)果及時(shí)性、準(zhǔn)確性的因素進(jìn)行評(píng)述。

1 新冠病毒核酸檢測(cè)方法

在疫情初期，最先檢出新的病原體的方法是下一代測(cè)序技術(shù)/高通量測(cè)序(NGS)技術(shù)，并很快確定了新冠病毒的核酸序列。隨著疫情發(fā)展，國(guó)內(nèi)迅速研發(fā)出多種應(yīng)用于新冠病毒核酸檢測(cè)的試劑盒，絕大多數(shù)都基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)。此外也有非常多的快速基因檢測(cè)技術(shù)推出，如現(xiàn)場(chǎng)快速檢驗(yàn)(POCT)技術(shù)、卡式熒光PCR技術(shù)等，整個(gè)檢測(cè)流程時(shí)間較短，最多可以節(jié)約3～4 h。和傳統(tǒng)的qPCR技術(shù)相比，一體化POCT確實(shí)便攜、操作簡(jiǎn)單，但是如果過(guò)于強(qiáng)調(diào)其"快速"的特性，其靈敏度可能受到影響，而現(xiàn)實(shí)的問(wèn)題是傳統(tǒng)PCR技術(shù)都受到“假陰性”結(jié)果的挑戰(zhàn)，在現(xiàn)有條件下，時(shí)間的縮短可能會(huì)進(jìn)一步帶來(lái)一定程度的靈敏度降低。從技術(shù)角度看，在靈敏度和特異性的平衡上，相較一些快速檢測(cè)方法，目前平衡性最好的是qPCR檢測(cè)技術(shù)。從過(guò)往的重大疫情來(lái)看，無(wú)論是西非埃博拉病毒、甲型流感還是MERS，qPCR仍是各個(gè)部門(mén)主推的檢測(cè)手段，目前我國(guó)已批準(zhǔn)上市的試劑盒也均以qPCR技術(shù)為主。

目前新冠病毒核酸檢測(cè)針對(duì)的位點(diǎn)主要包含病毒基因組中3段保守基因序列，即以開(kāi)放讀碼框1ab(ORF1ab)、核殼蛋白(N)基因以及包膜蛋白(E)基因作為檢測(cè)靶標(biāo)，也有少數(shù)商品試劑盒同時(shí)檢測(cè)刺突糖蛋白(S)基因。根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南(第五版)》(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南”)，在實(shí)驗(yàn)室要確認(rèn)一個(gè)病例為陽(yáng)性，需滿(mǎn)足同一份標(biāo)本中新冠病毒的ORF1ab及N基因2個(gè)靶標(biāo)特異性qPCR檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，或單靶標(biāo)陽(yáng)性患者重新采樣/另一類(lèi)型標(biāo)本檢測(cè)仍為單靶標(biāo)陽(yáng)性[4]，故實(shí)驗(yàn)室針對(duì)新冠病毒的核酸檢測(cè)應(yīng)至少包含最為保守及特異的ORF1ab區(qū)域以及N基因。

2 新冠病毒核酸檢測(cè)標(biāo)本類(lèi)型及病毒核酸檢出情況

2.1不同標(biāo)本類(lèi)型中新冠病毒的核酸檢測(cè) 在最新版診療方案中，其確診所提到的核酸檢測(cè)標(biāo)本類(lèi)型不僅包含呼吸道標(biāo)本及血液標(biāo)本，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)室檢查中增加“糞便標(biāo)本中可檢測(cè)新型冠狀病毒核酸”[3]。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南中，又將標(biāo)本類(lèi)型細(xì)分，呼吸道標(biāo)本包含鼻咽拭子、咽拭子、鼻咽抽取物或呼吸道抽取物、深咳痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液；消化道標(biāo)本包含糞便及肛拭子；血液標(biāo)本包含全血及血清標(biāo)本，并分別有相應(yīng)的采集及保存要求[4]。由于新冠病毒造成的肺炎為下呼吸道感染，對(duì)于已有癥狀及肺部CT改變的患者來(lái)說(shuō)，下呼吸道標(biāo)本(如深咳痰液、灌洗液等)為核酸檢測(cè)首選，而在新冠肺炎不同病程中取上呼吸道標(biāo)本(如鼻咽拭子)也能檢出病毒核酸。臨床上由于多數(shù)患者咳痰困難，取下呼吸道灌洗液標(biāo)本操作的生物安全風(fēng)險(xiǎn)極大，故呼吸道標(biāo)本以鼻咽拭子及咽拭子為主，而拭子標(biāo)本采用目前的qPCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，只有30%～50%的陽(yáng)性檢出率，大量的假陰性結(jié)果無(wú)法避免，必須進(jìn)行多次取樣檢測(cè)或結(jié)合其他類(lèi)型標(biāo)本檢查結(jié)果進(jìn)行確診。筆者所在研究團(tuán)隊(duì)對(duì)臨床上的新冠病毒疑似病例分別采集不同類(lèi)型呼吸道標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)，結(jié)果初步提示在新冠病毒感染者中，取咽拭子標(biāo)本及深咳痰液標(biāo)本的病毒核酸檢出率之間有明顯差異，咽拭子標(biāo)本中新冠病毒陽(yáng)性檢出率低于深咳痰液標(biāo)本。

隨著對(duì)新冠病毒核酸檢測(cè)的科技攻關(guān)，目前已有較多報(bào)道提出在患者的糞便標(biāo)本中可檢出病毒核酸，糞便標(biāo)本將成為臨床患者篩查的重要標(biāo)本類(lèi)型[5-6]。目前筆者所在研究團(tuán)隊(duì)對(duì)呼吸道標(biāo)本核酸檢測(cè)確診的患者進(jìn)行治療過(guò)程中及出院前的糞便標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)，結(jié)果顯示糞便標(biāo)本是患者診療過(guò)程中一種非常好的標(biāo)本類(lèi)型，其核酸檢出的持續(xù)時(shí)間普遍較呼吸道標(biāo)本更長(zhǎng)，同時(shí)糞便中新冠病毒核酸陽(yáng)性與患者的疾病發(fā)展進(jìn)程具有重要的相關(guān)性，可能作為一種療效評(píng)估和出院標(biāo)準(zhǔn)的重要檢測(cè)指標(biāo)。

2.2不同呼吸道標(biāo)本取樣材料對(duì)新冠病毒核酸檢測(cè)結(jié)果的影響 目前相關(guān)的診療方案及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南并未提及用于采集鼻咽拭子及咽拭子的拭子種類(lèi)，但對(duì)于呼吸道標(biāo)本的病毒核酸檢測(cè)來(lái)說(shuō)，不同的拭子及保存管很大可能將影響核酸檢測(cè)結(jié)果，但相關(guān)影響因素尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者所在研究團(tuán)隊(duì)初步在確診患者中對(duì)比了帶病毒保存液的植絨拭子標(biāo)本及無(wú)病毒保存液的普通棉簽拭子標(biāo)本的新冠病毒核酸檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)普通棉簽拭子的核酸檢出率明顯低于帶病毒保存液的植絨拭子(P<0.05)，普通棉簽拭子即便檢出，其陽(yáng)性CT值也明顯大于植絨拭子。

3 新冠病毒核酸檢測(cè)標(biāo)本核酸提取方法及病毒核酸檢出情況

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南等文件中，并未明確提及或推薦新冠病毒標(biāo)本的核酸提取方法，但由于目前臨床常見(jiàn)鼻咽拭子標(biāo)本存在核酸檢出率較低的問(wèn)題，對(duì)提取方法及提取流程進(jìn)行有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)依據(jù)的選擇及優(yōu)化是有必要的，提取流程的優(yōu)化可由各實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自身情況及比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)進(jìn)行。

新冠病毒核酸檢測(cè)所采用的qPCR是臨床分子檢測(cè)中常用的檢測(cè)方法，在以往采用qPCR對(duì)病毒核酸進(jìn)行的檢測(cè)中，磁珠法是較為常用的核酸提取方法，普遍認(rèn)為其提取病原體的核酸時(shí)具有簡(jiǎn)便、高效、提取濃度及純度較高等優(yōu)勢(shì)[7-8]。此外因各實(shí)驗(yàn)室條件不同及各檢測(cè)試劑盒要求，離心柱法、煮沸裂解法、一步裂解釋放法等也在臨床大量應(yīng)用。不同的病毒核酸提取方法因其提取產(chǎn)物濃度、純度的差別及對(duì)RNA的保護(hù)程度不同，將在一定程度上影響病毒核酸尤其是臨界陽(yáng)性標(biāo)本的核酸檢出。筆者所在研究團(tuán)隊(duì)初步對(duì)58例已確診患者原始標(biāo)本(均為帶病毒保存液的咽拭子標(biāo)本)同時(shí)采用不同提取方法后的核酸檢測(cè)結(jié)果顯示，分別采用離心柱法及磁珠法提取后，PCR檢測(cè)的CT值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

4 新冠病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求

4.1實(shí)驗(yàn)室及檢驗(yàn)人員生物安全 自新冠肺炎疫情暴發(fā)以來(lái)，各醫(yī)院檢驗(yàn)科在面對(duì)新冠病毒標(biāo)本檢測(cè)量增加、確診/疑似病例和普通患者的標(biāo)本不易區(qū)分、實(shí)驗(yàn)室空間限制、生物安全防護(hù)物資不足等各類(lèi)問(wèn)題時(shí)，臨床實(shí)驗(yàn)室特別是進(jìn)行新冠病毒核酸檢驗(yàn)科室的生物安全防護(hù)措施尤為關(guān)鍵。目前國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)對(duì)新冠病毒暫按照病原微生物危害程度分類(lèi)中第二類(lèi)病原微生物進(jìn)行管理，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南及實(shí)驗(yàn)室生物安全指南，如無(wú)法對(duì)原始標(biāo)本進(jìn)行可靠的滅活，則對(duì)其進(jìn)行的核酸檢測(cè)應(yīng)當(dāng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，同時(shí)采用生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)(建議至少穿戴工作服、一次性工作帽、雙層手套、醫(yī)用一次性防護(hù)服、醫(yī)用防護(hù)口罩或動(dòng)力送風(fēng)過(guò)濾式呼吸器、防護(hù)面屏或護(hù)目鏡、工作鞋或膠靴、防水靴套)，各實(shí)驗(yàn)室還可根據(jù)自身情況增加進(jìn)一步的防護(hù)[9]；同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防、不定期通風(fēng)和手衛(wèi)生等重要的防護(hù)措施必不可少。

在物資匱乏及實(shí)驗(yàn)室條件不足等限制下，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)物資短缺的情況，對(duì)檢驗(yàn)標(biāo)本及檢驗(yàn)崗位等啟動(dòng)分級(jí)、分層的生物安全防護(hù)預(yù)案，根據(jù)擬定的不同防護(hù)級(jí)別，最大限度滿(mǎn)足生物安全防護(hù)要求。如針對(duì)不同的檢驗(yàn)崗位，建議至少應(yīng)保證對(duì)確診患者、疑似患者標(biāo)本進(jìn)行呼吸道標(biāo)本病毒核酸提取和抗原檢測(cè)的相關(guān)人員的核心防護(hù)，即三級(jí)生物安全防護(hù)、二級(jí)生物安全柜，有條件時(shí)應(yīng)佩戴正壓防護(hù)頭套及在負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室中操作，其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員酌情采取重點(diǎn)防護(hù)或標(biāo)準(zhǔn)防護(hù)[10]。同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)所有實(shí)驗(yàn)室人員的安全意識(shí)，在日常進(jìn)行新冠病毒核酸檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，所有實(shí)驗(yàn)人員均應(yīng)嚴(yán)格遵循新冠病毒實(shí)驗(yàn)室生物安全指南中的相應(yīng)要求，結(jié)束核酸檢測(cè)工作后，對(duì)進(jìn)行新冠病毒核酸檢測(cè)操作的安全柜、臺(tái)面及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及時(shí)進(jìn)行有效的消毒；同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照相關(guān)文件要求進(jìn)行防護(hù)裝備的脫卸，注意盡量少地觸碰到污染面，且脫卸的每一步后均應(yīng)有手消毒，防護(hù)服、醫(yī)用帽及醫(yī)用口罩等一次性物品盡量不重復(fù)使用，在全部脫卸完成后，再進(jìn)行相應(yīng)的手衛(wèi)生及消毒。對(duì)于嚴(yán)格分區(qū)的實(shí)驗(yàn)室，在相應(yīng)區(qū)域完成防護(hù)裝備脫卸及手衛(wèi)生即可進(jìn)入清潔區(qū)，未嚴(yán)格分區(qū)的實(shí)驗(yàn)室中檢驗(yàn)人員在完成防護(hù)裝備脫卸及手衛(wèi)生后，還可增加其他有效的消毒措施[11]。

4.2原始標(biāo)本的滅活及對(duì)核酸檢測(cè)的影響 新冠病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指南中未對(duì)原始標(biāo)本的有效滅活條件進(jìn)行規(guī)定或建議，在目前最新的新冠病毒核酸檢測(cè)專(zhuān)家共識(shí)中，建議采用56 ℃水浴45 min，并可根據(jù)提取試劑在標(biāo)本裂解時(shí)所采用的溫度調(diào)整滅活溫度，但不低于56 ℃，此條件是依據(jù)以往對(duì)MERS等病毒滅活條件的研究。同時(shí)專(zhuān)家共識(shí)也建議各實(shí)驗(yàn)室對(duì)原始標(biāo)本的滅活條件有預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的支持[12]。由于目前常見(jiàn)標(biāo)本類(lèi)型的新冠病毒核酸陽(yáng)性檢出率仍不高，故任何可能降低病毒核酸提取效果及檢出率的因素，如標(biāo)本滅活條件及滅活時(shí)間等均應(yīng)引起重視。此前，華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科的專(zhuān)家學(xué)者對(duì)PCR檢測(cè)病毒核酸(以乙型流感病毒為例)進(jìn)行了相應(yīng)的小標(biāo)本量比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未滅活處理、56 ℃水浴30 min及50 ℃干浴1 h的同一標(biāo)本其PCR檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果的擴(kuò)增曲線CT值無(wú)明顯變化，可作為新冠病毒標(biāo)本滅活的參考。根據(jù)筆者所在研究團(tuán)隊(duì)對(duì)20例新冠病毒感染者的同一陽(yáng)性標(biāo)本分別進(jìn)行56 ℃干浴30 min及65 ℃干浴30 min后，其PCR檢測(cè)的陽(yáng)性CT值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，該研究結(jié)果尚未發(fā)表。

5 新冠病毒核酸檢測(cè)結(jié)果判讀

根據(jù)目前最新版新冠病毒診療指南、防控方案及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)專(zhuān)家共識(shí)，對(duì)新冠病毒的核酸檢測(cè)均應(yīng)至少檢測(cè)ORF1ab及N基因(或E基因)，檢測(cè)的通道同時(shí)陽(yáng)性時(shí)可判定為陽(yáng)性，并均提到陰性結(jié)果不能排除新冠病毒感染，應(yīng)考慮各環(huán)節(jié)中導(dǎo)致假陰性的原因。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南中，對(duì)于單通道陽(yáng)性結(jié)果，不僅要求重新采樣及檢測(cè)，對(duì)結(jié)果判定也增加了新的要求，即重新檢測(cè)結(jié)果仍為單通道陽(yáng)性時(shí)，判定核酸檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；同時(shí)增加了2種類(lèi)型標(biāo)本均檢測(cè)得到單靶標(biāo)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，應(yīng)判定核酸檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性[4]。

對(duì)于臨床新冠病毒核酸檢測(cè)中經(jīng)常出現(xiàn)的單靶標(biāo)陽(yáng)性結(jié)果，可有如下幾點(diǎn)考慮。(1)不同廠家雙位點(diǎn)qPCR試劑盒對(duì)于新冠病毒N蛋白基因的擴(kuò)增靈敏度可能高于ORF1ab檢測(cè)，將可能導(dǎo)致部分病毒含量較低的標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為單通道陽(yáng)性。(2)專(zhuān)研SARS病毒的專(zhuān)家學(xué)者認(rèn)為，理論上講新冠病毒的mRNA轉(zhuǎn)錄模式與SARS類(lèi)似，在細(xì)胞中新冠病毒的mRNA數(shù)倍于病毒的基因組RNA，且將轉(zhuǎn)錄出不同長(zhǎng)度的mRNA，這些mRNA都帶有N基因，而只有少數(shù)帶有ORF1ab；目前的試劑盒實(shí)際檢測(cè)多為細(xì)胞內(nèi)的病毒mRNA，因患者標(biāo)本中N基因mRNA的拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于ORF1ab基因，故在新冠病毒拷貝數(shù)較低的情況下，N基因檢測(cè)單通道陽(yáng)性的比例較高。(3)N基因在新冠病毒的核酸序列中保守程度不及ORF1ab，故還可能存在少數(shù)標(biāo)本由于其他冠狀病毒等的核酸序列與其有交叉，導(dǎo)致N基因擴(kuò)增陽(yáng)性而ORF1ab陰性。

6 結(jié) 論

綜上所述，目前新冠病毒所致疾病其病理過(guò)程及臨床病程還未完全闡明，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)路徑未標(biāo)準(zhǔn)化，加上其核酸檢測(cè)試劑盒研發(fā)時(shí)間緊迫，沒(méi)有足夠的評(píng)估及大樣本量的臨床驗(yàn)證，檢測(cè)效果良莠不齊，故對(duì)于臨床上新冠病毒核酸檢測(cè)結(jié)果為陰性或單通道陽(yáng)性的標(biāo)本均需要謹(jǐn)慎對(duì)待，考慮到各環(huán)節(jié)中可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確的影響因素。各臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在現(xiàn)有研究報(bào)道及文件和指南的基礎(chǔ)上，根據(jù)自身?xiàng)l件對(duì)新冠病毒核酸檢測(cè)全過(guò)程進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制及合理的優(yōu)化。同時(shí)，目前實(shí)驗(yàn)室已開(kāi)始檢測(cè)新冠病毒IgM及IgG抗體，更靈敏的核酸檢測(cè)方法如數(shù)字PCR也開(kāi)始應(yīng)用于新冠病毒的核酸檢測(cè)，部分研究團(tuán)隊(duì)著力于探索更加高效的新冠病毒實(shí)驗(yàn)室診斷模型，有望在新冠病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方面大大降低假陰性率，并為更好更快地確診新冠病毒感染者提供事實(shí)依據(jù)。