方 蘭，盧一艷△，劉金楠

(1.航天中心醫(yī)院病理科,北京 100049；2.中國人民解放軍總醫(yī)院病理科,北京 100039)

食管癌是全球腫瘤相關(guān)死亡的第六大原因，在男性中為第三常見腫瘤，女性中第五常見。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球2018年食管癌死亡病例為51萬左右，我國食管癌病例死亡人數(shù)占全球一半以上，是我國男性和女性腫瘤相關(guān)死亡的第三大主要原因[1-2]。目前食管癌的治療包括手術(shù)、放療和化療等手段，三者的聯(lián)合治療具有一定的療效，但是患者預(yù)后仍然較差[3]。因此，研究影響食管癌發(fā)生、發(fā)展中的潛在分子機制，對尋找食管癌治療候選靶點、開發(fā)靶向藥物、改善患者預(yù)后具有重大意義。細(xì)胞周期相關(guān)因子(CDCA3)是促使細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂的始動因子，在多種腫瘤組織中表達(dá)增加，參與腫瘤惡性疾病的進(jìn)展[4-7]。SU等[8]采用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CDCA3為食管癌中差異表達(dá)基因之一，然而CDCA3在食管癌中的具體作用目前仍不明確。本研究分析了CDCA3在食管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，并分析了CDCA3對食管癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能的作用機制，現(xiàn)作如下報道。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集2016年1月至2018年1月入住航天中心醫(yī)院行首次手術(shù)切除的食管癌患者的癌組織及其配對的癌旁組織標(biāo)本各50例。納入研究的患者術(shù)前未接受包括放化療等任何形式的抗腫瘤治療，經(jīng)病理專家證實為食管癌，所有患者均簽署知情同意書，所有操作均符合航天中心醫(yī)院倫理委員會規(guī)定。

1.2細(xì)胞、試劑與儀器 食管癌細(xì)胞系Eca109、Kyse-170、TE1和人食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A均購自美國ATCC細(xì)胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基、FBS和0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；RNA提取試劑RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒均購自日本Takara公司；CDCA3、內(nèi)參GAPDH引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine 2000為賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；CDCA3 siRNA由上海吉凱有限公司設(shè)計；MTS試劑盒購自美國Biovision公司；細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡Annexin Ⅴ-FITC /PI檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白RIPA裂解液購自美國Solarbio公司。CDCA3、CyclinD1和clevead caspase-3兔多克隆抗體購自英國Abcam公司，Mastercycler Ep Realplex qRT-PCR儀購自德國Eppendorf公司；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；BDFACS Calibur 流式細(xì)胞儀購自美國Becton Dickinson公司；Mini-PROTEAN Tetra電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1實時熒光定量PCR(qPCR)檢測食管癌組織和細(xì)胞中CDCA3 mRNA的表達(dá) 采用RNA提取試劑RNAiso Plus提取組織和細(xì)胞中的總RNA，測定RNA濃度及純度(以A260/A280進(jìn)行判斷)后，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的操作指南將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，以GAPDH為內(nèi)參，GAPDH上游引物5′-ACA ACT TTG GTA TCG TGG AAG G-3′，下游引物5′-GCC ATC ACG CCA CAG TTT C-3′，CDCA3上游引物5′-AAG AGC GTC CCA GTC ACA C-3′，下游引物5′-CCA GCA CTA GGT GAA CGG G-3′；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算CDCA3 mRNA的相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 Eca109、Kyse-170、TE1和Het-1A細(xì)胞均接種于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合度為90%時傳代。Eca109、TE1細(xì)胞生長至對數(shù)期時，胰酶消化以2×105個/孔接種于6孔板中，按照轉(zhuǎn)染說明書將siRNAs和si-NC轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后采用qPCR驗證siRNAs沉默效果。對照序列(si-NC序列):5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′。si-CDCA3-1序列:5′-GCA AUA GAU GGA AAC CAA ATT-3′；si-CDCA3-2序列:5′-GCU CUC CUA CUC UUG GUA UTT-3′；si-CDCA3-3序列:5′- GAG UGA AGU AUU UGA AAC UTT-3′；選取沉默效果較好的兩條si-CDCA3序列進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.3MTS增殖實驗 Eca109、TE1細(xì)胞生長至對數(shù)期時，胰酶消化以3 000個/孔接種于96孔板中，每組有6個平行孔，按照轉(zhuǎn)染說明書將轉(zhuǎn)染沉默效果較好的兩條si-CDCA3轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入100 μL新鮮培養(yǎng)基和20 μL MTS工作液，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2 h后，全波長掃描儀測取每個樣品在490 nm波長處測的吸光度(A)值，細(xì)胞增殖抑制率=(A實驗組-A對照組)/A對照組×100%。

1.3.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡情況 (1)細(xì)胞周期:收集轉(zhuǎn)染si-CDCA3 48 h的Eca109、TE1細(xì)胞，PBS洗3次后，加入預(yù)冷的75%的乙醇固定2～24 h，以每管1×106個細(xì)胞，加入500 μL Binding Buffer、25 μL PI和10 μL RNase A染液，混勻后避光室溫孵育30 min。于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。(2)細(xì)胞凋亡：收集轉(zhuǎn)染si-CDCA3 48 h的Eca109、TE1細(xì)胞，PBS洗3次后，以每管1×106個細(xì)胞，加入500 μL Binding Buffer、5 μL PI和5 μL Annexin Ⅴ-FITC染液，混勻后避光室溫孵育15 min。PBS洗1次后，流式細(xì)胞儀檢測并分析凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.3.5Western blot檢測蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染si-CDCA3 48 h的Eca109、TE1細(xì)胞，加入蛋白裂解液(含有100×的蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，超聲充分裂解30 min，在低溫下(4 ℃)以14 000 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行20 min的離心運動，獲得細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，加入Loading Buffer煮沸，之后將蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，在室溫下采用8%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，2 h后采用TBST沖洗，加入目的基因一抗，在4 ℃的環(huán)境下孵育過夜，次日TBST洗3次，加入二抗，在室溫下孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光條帶。采用Quantity One 5.0 軟件進(jìn)行分析，計算目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值。

2 結(jié) 果

2.1CDCA3 mRNA在食管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平 食管癌組織中CDCA3 mRNA的相對表達(dá)水平為1.84±0.89，高于癌旁組織的1.07±0.57(P<0.05)，見圖1A。CDCA3 mRNA在食管癌細(xì)胞系Eca109、Kyse-170、TE1中的表達(dá)水平分別為11.65±2.46、4.02±1.05、7.86±1.21，均高于在食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A中的表達(dá)水平(1.00±0.10，P<0.05)。Eca109和TE1細(xì)胞系中CDCA3 mRNA的表達(dá)水平高于Kyse-170細(xì)胞系(P<0.05)，選CDCA3 mRNA高表達(dá)的Eca109和TE1細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實驗，見圖1B。

注：A為CDCA3 mRNA在食管癌組織和癌旁組織中的表達(dá)；B為CDCA3 mRNA在食管癌細(xì)胞系中的表達(dá)；組間比較，*P<0.05。

圖1CDCA3mRNA的表達(dá)

2.2檢測轉(zhuǎn)染si-CDCA3的沉默效果 Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC、si-CDCA3-1、si-CDCA3-2和si-CDCA3-3后的CDCA3 mRNA表達(dá)水平分別為1.00±0.02、0.19±0.03、0.24±0.08和0.54±0.16，與si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-CDCA3-1、si-CDCA3-2和si-CDCA3-3后的細(xì)胞CDCA3 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05);TE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC、si-CDCA3-1、si-CDCA3-2和si-CDCA3-3后的CDCA3 mRNA表達(dá)水平分別為1.00±0.06、0.20±0.09、0.36±0.11和0.66±0.20，與si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-CDCA3-1、si-CDCA3-2和si-CDCA3-3后的細(xì)胞CDCA3 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)，見圖2。后續(xù)實驗采用si-CDCA3-1和si-CDCA3-2來沉默CDCA3的表達(dá)。

注：與轉(zhuǎn)染si-NC的同系細(xì)胞比較，*P<0.05。

圖2Eca109和TE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-CDCA3后CDCA3

mRNA的表達(dá)情況

2.3沉默CDCA3表達(dá)對食管癌細(xì)胞增殖的影響 Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC、si-CDCA3-1和si-CDCA3-2后的增殖率分別是(100.00±5.00)%、(36.00±5.29)%和(50.67±8.39)%，與si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-CDCA3-1和si-CDCA3-2的細(xì)胞增殖率降低(P<0.05);TE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC、si-CDCA3-1和si-CDCA3-2后的增殖率分別是(100.00±3.24)%、(38.67±5.51)%和(54.33±5.69)%，與si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-CDCA3-1和si-CDCA3-2后的細(xì)胞增殖率降低(P<0.05)。見圖3。

注：與si-NC比較，*P<0.05。

圖3沉默CDCA3對Eca109和TE1細(xì)胞增殖的影響

2.4沉默CDCA3表達(dá)對食管癌細(xì)胞周期的影響 Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC、si-CDCA3-1和si-CDCA3-2后，G0/G1期細(xì)胞比例分別是(56.12±1.05)%、(61.00±0.53)%和(59.90±0.66)%，與si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-CDCA3-1和si-CDCA3-2細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例增加(P<0.05);TE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC、si-CDCA3-1和si-CDCA3-2后的G0/G1期細(xì)胞比例分別是(68.10±2.05)%、(78.45±0.28)%和(76.11±1.20)%，與si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-CDCA3-1和si-CDCA3-2后的細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例增加(P<0.05)。見圖4。

注：與si-NC比較，*P<0.05。

圖4沉默CDCA3表達(dá)對Eca109和TE1細(xì)胞周期的影響

2.5沉默CDCA3表達(dá)對食管癌細(xì)胞凋亡的影響 Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC、si-CDCA3-1和si-CDCA3-2后的凋亡率分別是(0.25±2.67)%、(26.33±1.19)%和(14.07±1.59)%，與si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-CDCA3-1和si-CDCA3-2細(xì)胞的凋亡率增加(P<0.05);TE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC、si-CDCA3-1和si-CDCA3-2后的凋亡率分別是(2.17±0.317)%、(38.00±2.65)%和(21.00±2.00)%，與si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-CDCA3-1和si-CDCA3-2細(xì)胞的凋亡率增加(P<0.05)。見圖5。

注：與si-NC比較，*P<0.05。

圖5 沉默CDCA3表達(dá)對Eca109和TE1細(xì)胞凋亡的影響

注：與si-NC比較，*P<0.05。

圖6沉默CDCA3表達(dá)對Eca109和TE1細(xì)胞CyclinD1、cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)的影響

2.6沉默CDCA3表達(dá)對CyclinD1、cleaved caspase-3蛋白的影響 為進(jìn)一步探討CDCA3表達(dá)對食管癌細(xì)胞增殖和凋亡作用的機制，檢測沉默CDCA3表達(dá)對CyclinD1、cleaved caspase-3的影響。Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染si-CDCA3-1和si-CDCA3-2細(xì)胞中CDCA3蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。沉默CDCA3后，Eca109和TE1細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)減少，而cleaved caspase-3蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。見圖6、表1。

3 討 論

腫瘤是疾病相關(guān)死亡的主要原因，而我國惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率均居世界首位，近年來隨著生活節(jié)奏的加快、工作壓力的增加等外在環(huán)境因素及腫瘤異質(zhì)性內(nèi)在因素，使得腫瘤的發(fā)病率和病死率呈現(xiàn)上升趨勢[9-10]。食管癌是惡性程度較高的腫瘤，由于早期癥狀的隱匿性，確診時通常為晚期，患者預(yù)后較差。近年來靶向治療為食管癌的治療提供了新的思路，該方向也成為臨床研究的重點[11-12]。惡性腫瘤的發(fā)生比較復(fù)雜，癌基因激活和抑癌基因失活產(chǎn)生的基因功能紊亂，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素[13-14]。不良的飲食習(xí)慣、吸煙等因素引起基因變異導(dǎo)致調(diào)控失常，促進(jìn)食管癌的發(fā)生、發(fā)展，因此從基因分子水平探究診治食管癌的新方向，已成為食管癌領(lǐng)域的研究熱點[15-16]。

細(xì)胞的生長在于細(xì)胞的分裂，細(xì)胞分裂的失控導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常是惡性腫瘤細(xì)胞的共同特征，細(xì)胞周期的進(jìn)程取決于復(fù)雜的周期相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，研究已經(jīng)證實周期相關(guān)蛋白分子與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，靶向周期相關(guān)蛋白阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程可以顯著抑制腫瘤的增殖能力，可能是改善患者療效的潛在靶點[17]。細(xì)胞周期分裂相關(guān)蛋白家族成員CDCA3，被稱為進(jìn)入有絲分裂的“觸發(fā)因子”，CDCA3作為S期激酶相關(guān)蛋白1(SKP1)/淘汰素(Cullin1)/F-box(SCF)E3泛素連接酶復(fù)合物的一部分，介導(dǎo)有絲分裂抑制激酶wee1的降解，從而介導(dǎo)細(xì)胞周期的進(jìn)展[18]。本研究顯示，在食管癌組織以及細(xì)胞系中CDCA3 mRNA的表達(dá)均高于癌旁組織以及正常人食管鱗狀上皮細(xì)胞。研究報道，CDCA3 mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于對照組，并顯著降低了患者的存活率[4]；非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中CDCA3的表達(dá)水平均高于對照組[5]；生物信息學(xué)分析CDCA3在食管癌中表達(dá)上調(diào)[8]。此外，通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，沉默CDCA3的表達(dá)可抑制食管癌細(xì)胞Eca109、TE1的增殖且使細(xì)胞阻滯于G0/G1期。ZHANG等[6]研究發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞BGC823中敲低CDCA3的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖、集落形成和體內(nèi)移植瘤的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期的阻滯；QIAN等[7]同樣報道在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中敲減CDCA3的表達(dá)，在體內(nèi)和體外均抑制細(xì)胞增殖，機制為細(xì)胞周期G1到S期的轉(zhuǎn)換停滯，與本研究結(jié)果一致，但是ADAMS等[5]研究在非小細(xì)胞肺癌中抑制CDCA3的表達(dá)通過將細(xì)胞阻滯在G2/M期發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用，表明CDCA3在不同的惡性腫瘤中發(fā)揮的調(diào)控作用機制可能不同。細(xì)胞凋亡是正常生命現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡異常同樣導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，腫瘤的化療、放療等治療中均涉及細(xì)胞凋亡的激活，因此細(xì)胞凋亡在腫瘤治療中具有重要作用[19-20]。已有研究報道在非小細(xì)胞肺癌中CDCA3的缺失可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[5]，而CDCA3是否參與食管癌的細(xì)胞凋亡尚不清楚。本研究顯示，沉默CDCA3表達(dá)后，凋亡細(xì)胞增多，表明CDCA3參與食管癌細(xì)胞的凋亡。

本研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CDCA3調(diào)控食管癌細(xì)胞增殖和凋亡，但是具體的作用機制仍需進(jìn)一步研究。本研究采用Western blot檢測CDCA3沉默后，Eca109、TE1細(xì)胞中CyclinD1的表達(dá)降低。CyclinD1是細(xì)胞周期的正性調(diào)控因子，通過促進(jìn)Rb的磷酸化，使pRb-E2F復(fù)合物解離，E2F促使DNA合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，啟動G1期DNA的復(fù)制進(jìn)入S期，CyclinD1表達(dá)減少時，細(xì)胞周期阻滯在G1期[21]，本研究結(jié)果提示CDCA3高表達(dá)可能通過增加CyclinD1蛋白的表達(dá)促進(jìn)食管癌增殖。細(xì)胞凋亡涉及一系列的蛋白改變，凋亡發(fā)生的重要標(biāo)志為Caspase蛋白家族的激活，其中Caspase3蛋白是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行分子，其被切割為cleaved caspase-3后可導(dǎo)致下游蛋白級聯(lián)激活反應(yīng)，是細(xì)胞凋亡不可逆的標(biāo)志[22]。而沉默CDCA3的表達(dá)后，Eca109、TE1細(xì)胞中cleaved caspase-3的表達(dá)增加，提示CDCA3高表達(dá)可能通過抑制Caspase3蛋白的表達(dá)抑制食管癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，CDCA3在食管癌組織和細(xì)胞中表達(dá)均增加，在食管癌細(xì)胞中沉默CDCA3的表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞阻滯，并可以對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生促進(jìn)作用，其機制可能是調(diào)控cyclinD1、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)。CDCA3可能是食管癌治療的潛在分子靶點。本文未對CDCA3的表達(dá)與患者預(yù)后生存期進(jìn)行分析，這將在今后研究中進(jìn)一步探索。

4 結(jié) 論

本文首次報道CDCA3在食管癌中高表達(dá)，發(fā)揮促癌基因的功能。抑制CDCA3的表達(dá)可能通過調(diào)控周期蛋白和凋亡蛋白抑制食管癌細(xì)胞的增殖。CDCA3可能成為治療食管癌新的治療靶點。