王 藝，周道紅，黎 敏，魯衛(wèi)平，張峰領(lǐng)

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院檢驗科，重慶 400042)

菌膜假絲酵母菌在環(huán)境中廣泛存在，也是胃腸道和皮膚的正常菌群。因其抗菌性而用于食物和飼料的保存劑，也可用于葡萄酒的香味增強劑。然而，越來越多的臨床資料證明此菌為條件致病菌，可引起患者的血流感染，特別是在免疫功能低下的患者中可分離出此菌[1]。除在血液中分離出該菌株，在臨床患者其他部位分離出的報道少見，為加強實驗室人員對該菌株的認(rèn)識，本文就該菌引起的眼內(nèi)炎1例進行報道，同時這也是國內(nèi)第1例由該菌引起眼內(nèi)炎的案例報道。

1 病例資料

患者是一名57歲的女性，首次是由于左眼紅痛5個月伴加重4 d于2017-05-16入本院眼科門診就診。眼科?？茩z查顯示她的左眼視力為0.05，左眼結(jié)膜混合充血(+++)，角膜中央片狀上皮剝脫，局限性潰瘍，水腫，tyn陽性(丁達爾征)，虹膜后粘連瞳孔5 mm，散大光反射消失，晶體渾濁。左眼眼壓9 mm Hg。初步診斷為左眼病毒性潰瘍；左眼前部葡萄膜炎。給予更昔洛韋凝膠每日2次抗病毒治療和氟米龍滴眼液每日3次促角膜上皮生長對癥治療，患者好轉(zhuǎn)后出院。4個月后，患者左眼病情加重，期間左眼病情反復(fù)，多在感冒和休息不佳時加重。遂于2017-09-21在本院門診進行第2次診療，以“左眼角膜潰瘍”收入本院。?？茩z查結(jié)果顯示：左眼視力較上次入院時下降(0.05，數(shù)指/30 cm)，結(jié)膜混合充血(++)，角膜中央可見大小約2 mm×3 mm潰瘍，白色干酪樣分泌物附著，邊界清楚，下方少許浸潤，前房深度存在，tyn陰性，虹膜后粘連瞳孔3 mm，光反射遲鈍，晶體渾濁，眼底未見異常。左眼眼壓8 mm Hg。患者既往病毒性角膜潰瘍病史，此次潰瘍從形態(tài)上考慮真菌性潰瘍的可能性大，推薦進行角膜潰瘍分泌物革蘭染色及真菌涂片檢查，分泌物細(xì)菌及真菌培養(yǎng)，同時進行真菌感染臨床經(jīng)驗性治療。2017-09-22送檢分泌物真菌涂片檢查查見大量的真菌有隔菌絲(檢驗樣本號1709222002)，真菌性角膜炎的實驗室證據(jù)加強，2017-09-25真菌培養(yǎng)及藥敏報告為菌膜假絲酵母菌生長，明確患者的真菌感染，對氟康唑(FCA)、兩性霉素B(AMB)、伏立康唑(VRO)等常規(guī)抗真菌藥物敏感?；颊咭蚧厩闆r良好，于2017-09-22真菌涂片查見真菌孢子后隨即出院，每日3次兩性霉素B滴眼治療，每月隨訪直至2018年3月，共計6次，病情進一步穩(wěn)定和恢復(fù)。

2 菌株鑒定及藥敏試驗

2.1真菌分離培養(yǎng) 取角膜潰瘍分泌物床旁接種于血平板(北京賽默飛世爾公司)、巧克力平板和增菌肉湯液(后兩者均為重慶龐通公司)，同時制作2份樣本玻片用于革蘭染色及真菌10%KOH壓片檢查。將平板和增菌肉湯液置于35 ℃，5%CO2培養(yǎng)，1份樣本玻片進行革蘭染色后顯微鏡鏡檢，另1份樣本玻片進行10%KOH壓片檢查。24 h后在沙保弱平板和巧克力平板上均可見菌落生長，沙保弱平板上菌落為乳白色奶油狀，中等大小，凸起，邊緣光滑，未產(chǎn)生色素，見圖1。菌落在科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基上無明顯顏色變化，對真菌的鑒定意義不大。菌落革蘭染色鏡下形態(tài)：革蘭陽性酵母樣真菌，見圖2。

圖1 沙保弱平板48h菌落形態(tài)

2.2真菌生化鑒定 采用VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定儀(法國生物梅里埃公司)及配套YST卡進行菌株鑒定，結(jié)果為菌膜假絲酵母菌，生物編碼為：6701544205565771，鑒定率為99%。采用VIETK MS質(zhì)譜系統(tǒng)進行菌種鑒定，結(jié)果仍為菌膜假絲酵母菌，鑒定率為99.9%。

2.3真菌分子生物學(xué)鑒定 以真菌基因組DNA為模板，參照文獻合成18S rRNA基因引物。上游引物為5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′；下游引物為5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′，擴增產(chǎn)物長度為576 bp。PCR反應(yīng)采用Ex Taq酶(大連寶生生物公司)，引物由成都擎科生物有限公司合成。25 μL反應(yīng)體系：2×Ex Taq Prex 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min(35個循環(huán))；72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物由深圳華大基因公司進行雙向測序，測定結(jié)果與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫進行BLAST序列比對，顯示該序列與菌膜假絲酵母菌(GenBank編號LWUN00000000.1)相似度為99%。

圖2 原始標(biāo)本革蘭染色鏡下形(1 000×)

2.4真菌藥敏試驗 采用ATB Fugus 3(法國生物梅里埃公司)藥敏試劑(微量肉湯稀釋法)進行檢測，結(jié)果顯示(最低抑菌濃度)：5-氟胞嘧啶≤4 μg/mL、兩性霉素B≤0.5 μg/mL、氟康唑≤1 μg/mL、伊曲康唑≤0.125 μg/mL、伏立康唑≤0.06 μg/mL。其中氟康唑、兩性霉素B、伏立康唑等敏感，5-氟胞嘧啶和伊曲康唑缺乏判斷標(biāo)準(zhǔn)。藥敏判讀標(biāo)準(zhǔn)參見CLSI-M60文件。

3 討 論

菌膜假絲酵母菌，也稱作異常畢赤酵母和異常威克漢姆酵母，是子囊菌酵母菌。主要分離自食物、飼料等，以其抗菌性能而聞名，一度被認(rèn)為是生物防治劑。然而過去幾十年的研究報道顯示其可能為條件致病菌，可以引起醫(yī)院內(nèi)酵母菌血癥，特別是在兒科監(jiān)護病房[2]。國外的案例報告中已經(jīng)從癌癥患者、嬰兒、早產(chǎn)兒和外科重癥監(jiān)護患者中分離出此菌[3]。國內(nèi)的研究中以兒科監(jiān)護病房分離出此菌為主，同時還有此菌引起的尿路感染、心內(nèi)膜炎等案例報道[4-5]。

實驗室從1例眼內(nèi)炎患者眼分泌物中分離出菌膜假絲酵母菌，通過實驗室VITEK compact自動鑒定儀和VITEK MS質(zhì)譜儀鑒定菌株為菌膜假絲酵母菌，作為菌株鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)--基因序列測定，其分析結(jié)果也證實了菌株為菌膜假絲酵母菌。這是實驗室首次從眼內(nèi)炎患者樣本中分離出此菌株，同時也是國內(nèi)首次對該菌株引起眼內(nèi)炎的案例報道[6]。結(jié)合患者的病歷資料分析，患者首次就診時并未出現(xiàn)真菌感染的相關(guān)實驗室證據(jù)和臨床表現(xiàn)，而是以病毒性感染為診療基礎(chǔ)的，患者并無外傷及手術(shù)史，無糖尿病史，唯一的易感因素是糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用，在第一次入院至第二次入院期間，患者持續(xù)使用糖皮質(zhì)激素滴眼液，眼部角膜潰瘍并未好轉(zhuǎn)，這為患者感染真菌提供了可能性。眼內(nèi)炎是嚴(yán)重的眼內(nèi)炎癥，最常見的形式是白內(nèi)障術(shù)后眼內(nèi)炎。發(fā)生率約0.1%，病原體通常為細(xì)菌，其中真菌約占3%[7]。國外文獻報道顯示，糖尿病是內(nèi)源性眼內(nèi)炎最常見的危險因素，其他危險因素還包括器官移植、糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用、靜脈導(dǎo)管留置和人類免疫缺陷病毒感染等[8-9]。由于眼內(nèi)炎患者常有較差的視力預(yù)后，所以早期及時有效確定病原體對患者的預(yù)后極為重要，患者從入院到真菌藥敏報告的發(fā)放歷時4 d，由于這例患者能及時確定感染病原體——菌膜假絲酵母菌，從而得到有效的治療，在隨后的定時復(fù)診(每月1次，直至第2年3月)和隨訪中取得了不錯的治療效果，這也極大地肯定了病原體檢測在診療過程中的重要性。隨著臨床中新技術(shù)如時間飛行質(zhì)譜鑒定和分子生物技術(shù)的應(yīng)用對病原微生物的鑒定效率得到顯著提高，大大縮短了病原體感染性疾病的診斷時間，同時也為臨床治療也提供了理論依據(jù)[10]。