張 莉，楊書才，唐景云，黃偉忠，黃彩艷

(廣東省深圳市坪山區(qū)人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.內(nèi)分泌科,廣東深圳 518118；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院第八臨床學(xué)院綜合教研室,廣東深圳 518118)

糖尿病在我國已成為繼腫瘤和心腦血管疾病的第三大威脅人民身體健康的慢性非傳染性疾病[1]。其中1型糖尿病(T1DM)，又被稱為胰島素依賴型糖尿病，是由于機(jī)體胰腺中的β細(xì)胞被大量破壞，導(dǎo)致胰島素分泌嚴(yán)重不足而引起的一種代謝性疾病[2]。T1DM起病急，患者容易發(fā)生酮癥酸中毒[3]，必須用胰島素治療才能獲得滿意療效，否則將危及生命。外泌體是由細(xì)胞中內(nèi)出芽形成的多囊泡內(nèi)體與細(xì)胞膜融合后向細(xì)胞外分泌的具有脂質(zhì)雙層膜的微小囊泡[4]，內(nèi)含有多種生物大分子，如脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)等。這些生物大分子能及時反映出患者疾病的動態(tài)變化，生物大分子也是外泌體在細(xì)胞間進(jìn)行信息交流和物質(zhì)交換的基礎(chǔ)。外泌體的檢測在各個領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景，例如：輔助用藥及療效監(jiān)控等[5]。近年來外泌體研究受到廣泛關(guān)注，外泌體檢測也有望為T1DM患者的診斷提供新的生物學(xué)標(biāo)志物和作為輔助治療的工具[6]。本研究利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測了T1DM患者和健康者血漿外泌體中的蛋白質(zhì)，分析了兩組人群間具有表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，以及這些差異蛋白可能的生物學(xué)功能，旨在為后續(xù)T1DM的發(fā)病機(jī)制研究，以及早期診斷或療效監(jiān)控篩選出新的候選分子。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2018年6月15日至2018年12月31日于深圳市坪山區(qū)人民醫(yī)院住院的T1DM患者(T1DM組)與健康體檢者(對照組)納入研究，納入研究者知情同意后，采靜脈血(10 mL)置于血液收集管中(含EDTA)，2 h內(nèi)分離靜脈血血漿，冷凍離心機(jī)調(diào)至4 ℃，4 000 r/min，離心15 min，離心后取上層血漿于-80 ℃保存。篩選出無傳染性病毒感染和既往病史的患者血液標(biāo)本。共收集到T1DM患者血漿標(biāo)本6例，健康者血漿標(biāo)本6例。

1.2儀器與試劑 外泌體分離試劑盒購于IZON公司；BCA試劑盒、TMT試劑盒購于Thermofisher公司；蛋白酶抑制劑購于Calbiochem公司；碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素和三乙基碳酸氫銨購于Sigma公司；胰酶購于Promega公司；乙腈購于Fisher Chemical公司；Strata X C18固相萃取小柱購于Phenomenex公司；液相色譜柱Agilent 300 Extend C18購于Agilent公司。

1.3方法

1.3.1血漿外泌體蛋白提取 血漿標(biāo)本從-80 ℃取出，于4 ℃，12 000×g，離心15 min，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，0.22 μmol/L微孔濾膜過濾后，按試劑盒說明書分離外泌體。然后加入終濃度為8 mol/L的尿素以及蛋白酶抑制劑超聲裂解，利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。

1.3.2蛋白標(biāo)本制備 將二硫蘇糖醇加入制得的蛋白溶液中，使終濃度為5 mmol/L后，放置于56 ℃還原30 min。加入碘代乙酰胺使其終濃度為11 mmol/L，于室溫避光孵育15 min。隨后稀釋標(biāo)本的尿素濃度至低于2 mol/L。以胰酶和蛋白1∶50的質(zhì)量比例加入胰酶后，放置于37 ℃酶解過夜。過夜后，以胰酶和蛋白1∶100的質(zhì)量比例加入胰酶，于室溫繼續(xù)酶解4 h。將酶解后的肽段使用Strata X C18除鹽后進(jìn)行真空冷凍干燥。將肽段使用0.5 mol/L三乙基碳酸氫銨溶解，使用TMT試劑盒，按照說明書標(biāo)記肽段。使用高pH反向高效液相色譜的方法分級標(biāo)記后的肽段，色譜柱為5 μm粒徑，4.6 mm 內(nèi)徑，250 mm長的Agilent 300 Extend C18。肽段分級梯度設(shè)置為8%～32%乙腈、pH設(shè)置為9，60 min分離60個組分，隨后將60個組分合并為9個，合并后的組分進(jìn)行真空冷凍干燥，進(jìn)行后續(xù)操作。

1.3.3高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 使用EASY-nLC 1200超高效液相系統(tǒng)分離經(jīng)過液相色譜流動相A相溶解后的肽段。流動相A含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；流動相B含0.1%甲酸和90%乙腈的水溶液。液相梯度設(shè)置為0～60 min，10%～22%B；60～82 min，22%～35%B；82～86 min，35%～80%B；86～90 min，80%B，流速維持在400 nL/min。使用超高效液相系統(tǒng)分離肽段，后注入NSI離子源中電離進(jìn)行Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜分析。設(shè)置離子源電壓為2.0 kV，檢測分析肽段母離子及其二級碎片都使用高分辨的Orbitrap。設(shè)置一級質(zhì)譜掃描范圍為350～1 550 m/z，設(shè)置掃描分辨率為60 000；固定二級質(zhì)譜掃描范圍起點(diǎn)為100 m/z，設(shè)置二級掃描分辨率為30 000。在一級掃描后選擇信號強(qiáng)度最高的前10肽段母離子依次進(jìn)入HCD碰撞池，進(jìn)行能量碎裂。依次進(jìn)行二級質(zhì)譜分析。設(shè)置自動增益控制(AGC)為5E4，設(shè)置信號閾值為5E4，設(shè)置最大注入時間為70 ms，設(shè)置串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動態(tài)排除時間為30 s，避免母離子的重復(fù)掃描從而提高質(zhì)譜有效利用率。

1.3.4數(shù)據(jù)庫搜索 二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Maxquant(v1.5.2.8)進(jìn)行檢索。檢索參數(shù)設(shè)置為數(shù)據(jù)庫：Human_SwissProt_1808(II0387條序列)，添加反庫以計(jì)算隨機(jī)匹配造成的假陽性率(FDR)，并且在數(shù)據(jù)庫中加入了常見的污染庫，用于消除鑒定結(jié)果中污染蛋白的影響；設(shè)置酶切方式為Trypsin/P；設(shè)置漏切位點(diǎn)數(shù)為2；設(shè)置肽段最小長度為7個氨基酸殘基；設(shè)置肽段最大修飾數(shù)為5；設(shè)置First search和Main search的一級母離子質(zhì)量誤差容忍度分別為20 ppm和5 ppm，二級碎片離子的質(zhì)量誤差容忍度為相對分子質(zhì)量0.02×103。設(shè)置半胱氨酸烷基為固定修飾，可變修飾為甲硫氨酸的氧化，蛋白N端的乙?；擋０坊?NQ)。設(shè)置定量方法為TMT-10plex，蛋白鑒定、肽段譜圖匹配(PSM)鑒定的FDR都為1%。

1.3.5蛋白差異表達(dá)分析 選擇質(zhì)譜分析中獲得的可定量蛋白進(jìn)行多次全蛋白定量重復(fù)實(shí)驗(yàn)。計(jì)算T1DM組和對照組平均值的比值，該比值作為兩組最終的差異表達(dá)量，計(jì)算兩組該蛋白水平比較的P值。

1.3.6生物信息學(xué)分析 分別使用InterProScan、KAAS、KEGG Mapper、Wolfpsort、Perl module、Blast、R package networkD3等軟件對差異蛋白進(jìn)行蛋白注釋、功能分類、功能富集分析、聚類分析及蛋白相互作用分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 每組各個標(biāo)本的相對定量值以2為底數(shù)取對數(shù)值(以使得數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布)，然后用雙樣本雙尾t檢驗(yàn)方法計(jì)算P值。當(dāng)P<0.05時，差異表達(dá)量大于1.2為顯著上調(diào)，小于1/1.2為顯著下調(diào)。

2 結(jié) 果

2.1T1DM外泌體差異表達(dá)蛋白 經(jīng)質(zhì)譜分析和蛋白理論數(shù)據(jù)搜庫后，得到有效譜圖數(shù)為41 569。通過譜圖解析共鑒定到9 779條特異性肽段，共得到1 146個蛋白，其中948個可用于定量。經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到每個標(biāo)本的定量值后，發(fā)現(xiàn)T1DM組相對于對照組表達(dá)上調(diào)的蛋白數(shù)為37，下調(diào)的為122，見圖1。

圖1 血漿外泌體差異表達(dá)蛋白定量火山圖

2.2差異表達(dá)蛋白的功能分類 對差異表達(dá)進(jìn)行功能分類后，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)主要集中于單一生物進(jìn)程、生物調(diào)控、細(xì)胞進(jìn)程及應(yīng)激反應(yīng)等生物進(jìn)程；細(xì)胞器、細(xì)胞、細(xì)胞外區(qū)域等細(xì)胞組成；分子間相互捆綁及應(yīng)激等分子功能，見圖2。并且在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位也主要集中于細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，見圖3。差異表達(dá)蛋白在COG/KOG功能分類中的分布集中于細(xì)胞骨架、翻譯后修飾及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，見圖4。

圖2 差異表達(dá)蛋白在GO二級分類中統(tǒng)計(jì)分布圖

圖3 差異表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分布圖

圖4 差異表達(dá)蛋白的COG/KOG功能分類分布圖

2.3差異表達(dá)蛋白KEGG通路分析 通過2.2鑒定出的全體蛋白及篩選出的差異表達(dá)蛋白，將差異蛋白進(jìn)行KEGG通路的富集分析，見圖5。差異蛋白主要集中于凝血與補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)、膽固醇代謝及沙門氏菌感染等信號通路。

注：圓圈大小代表富集程度。

圖5差異表達(dá)蛋白在KEGG通路中富集分布?xì)馀輬D

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)包括細(xì)胞質(zhì)蛋白、膜蛋白、高爾基體相關(guān)蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白在內(nèi)的超過4 600種蛋白質(zhì)與外泌體有關(guān)[7-8]。外泌體中最常被鑒定的蛋白質(zhì)有膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、融合蛋白、熱休克蛋白、四跨膜蛋白超家族成員tetraspanins，多泡體生物合成相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白等[9-10]，同時外泌體中也存在著與代謝相關(guān)的酶類、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、載體蛋白和組織相容性抗原[11]。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中的蛋白能夠作為生物靶點(diǎn)[12]，并且檢測蛋白表達(dá)也可以反映疾病進(jìn)程[13]。對血漿外泌體蛋白質(zhì)的分析為T1DM的組織學(xué)研究提供補(bǔ)充，也為臨床篩選出T1DM用于診斷、預(yù)后及分型的分子靶點(diǎn)做出了貢獻(xiàn)。

近年來，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用這一技術(shù)的使用讓定量蛋白質(zhì)組學(xué)取得了長足進(jìn)步，也加速了科學(xué)家對于外泌體的了解，更為篩選外泌體來源的分子靶點(diǎn)提供了新的方向。本研究一共鑒定到1 146個蛋白質(zhì)，其中948個蛋白質(zhì)包含定量信息。本課題組發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，T1DM患者血漿外泌體中有37個蛋白表達(dá)發(fā)生上調(diào)，122個蛋白表達(dá)發(fā)生下調(diào)。

首先，本課題組對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了功能分類，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)廣泛參與了各個生物進(jìn)程，并且定位于多個亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。另外，這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著不同的功能，參與到各種分子信號通路中。為檢測差異表達(dá)蛋白在某些功能類型上富集趨勢的顯著性，本課題組對這些差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析。KEGG途徑包括代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程、人類疾病、藥物開發(fā)等，是探索已知分子間相互作用的橋梁[14]。研究發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要集中于凝血與補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)、膽固醇代謝及沙門氏菌感染等信號通路。這與T1DM發(fā)病機(jī)制方面的研究相符合。目前，關(guān)于T1DM發(fā)病機(jī)制的研究主要集中于自身免疫系統(tǒng)缺陷、遺傳因素及病毒感染等[15]。

4 結(jié) 論

本研究為進(jìn)一步闡明T1DM發(fā)病機(jī)制提供了參考方向，并為T1DM的早期診斷提供了一些新的候選分子。