谷瑤 周麗珠 欒潔 楊漓 曾永明 蒙芳慧

【摘 要】文章建立一種用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定板栗中粗蛋白含量的方法，通過(guò)板栗與硫酸和催化劑一同加熱消解，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為粗蛋白含量。結(jié)果表明：采用全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定（NH4）2SO4標(biāo)準(zhǔn)品氮回收率為99.8%～99.9%，測(cè)定板栗粗蛋白含量平均為4.1894%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.28%（<10%）（n=6）。說(shuō)明該方法具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、低耗、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)偏差小，是板栗種仁中粗蛋白測(cè)定的首選方法。

【關(guān)鍵詞】板栗;粗蛋白;凱氏定氮法;消解;蒸餾

【中圖分類(lèi)號(hào)】S7 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674-0688（2020）12-0081-03

板栗（Castanea mollissima Bl.），是殼斗科（Fagaceae）栗屬（Castanea）堅(jiān)果類(lèi)植物[1]，生長(zhǎng)于海拔370～2 800 m的區(qū)域，廣泛分布在越南、中國(guó)等國(guó)家，現(xiàn)主要以人工栽培為主[2]。板栗營(yíng)養(yǎng)豐富，含有大量淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、B族維生素等多種營(yíng)養(yǎng)素，被稱(chēng)為“干果之王[3]。板栗中蛋白質(zhì)含有18氨基酸，其中谷氨酸、天門(mén)冬氨酸、亮氨酸和賴(lài)氨酸的含量較高，有8種人體必需氨基酸，它們的含量占氨基酸總含量的33.59%[4]。

食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法有兩類(lèi)：直接法和間接法[5]。杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法是使用最廣泛的間接法[6-7]，而近紅外光譜法、紫外分光光度法、電泳法、紫外吸收光譜法和Bradford法是常見(jiàn)的直接法[5]。凱氏定氮法因靈敏度高、穩(wěn)定性好、成本低廉，是目前進(jìn)行氮含量測(cè)定常見(jiàn)的方法，也是國(guó)內(nèi)外法定的檢測(cè)方法[8]。目前，大量文獻(xiàn)報(bào)道了凱氏定氮法測(cè)定食品中的蛋白質(zhì)含量，但針對(duì)特定食品蛋白質(zhì)的研究?jī)H限于大豆、小麥、乳制品和大米[9-15]。食品基質(zhì)復(fù)雜，普適性方法需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整和改進(jìn)，有必要針對(duì)性地建立核桃蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，在最短的時(shí)間內(nèi)得到更精準(zhǔn)的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5—2016）中的凱氏定氮法測(cè)定板栗種仁中粗蛋白含量[16]，通過(guò)方法優(yōu)化，得到精準(zhǔn)的含量值，為板栗種仁粗蛋白快速、準(zhǔn)確測(cè)定提供了科學(xué)參考。

方法原理：蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。板栗果實(shí)中的粗蛋白與硫酸和催化劑一同加熱消解，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量;其反應(yīng)式如下：

2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4→（NH）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O（1）

（NH4）2SO4+2NaOH→2NH3+Na2SO4+2H2O（2）

2NH3+4H3BO3→（NH4）2B3O7+5H2O（3）

（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3（4）

1 試劑和材料

1.1 試劑

本實(shí)驗(yàn)方法所用試劑均為分析純，水為三級(jí)水。試劑包括五水硫酸銅（CuSO4·5H2O）、硫酸鉀（K2SO4）、硫酸（H2SO4）、硼酸（H3BO3）、甲基紅指示劑（C15H15N3O2）、溴甲酚綠指示劑（C21H14Br4O5S）、氫氧化鈉（NaOH）、95% 乙醇（C2H5OH）、鹽酸（HCl）、無(wú)水碳酸鈉（Na2CO3）基準(zhǔn)試劑、硫酸銨（（NH4）2SO4）標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 試劑配制

（1）硼酸溶液（20 g/L）：稱(chēng)取20 g硼酸，加水溶解后，稀釋至1 000 mL。

（2）氫氧化鈉溶液（30%）：稱(chēng)取300 g氫氧化鈉加水溶解后，放冷，并稀釋至1 000 mL。

（3）鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[C（HCl）]0.1 moL/L：量取9 mL分析純濃鹽酸（HCl）于1 000 mL容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，搖勻;稱(chēng)取于270～300 ℃高溫爐中灼燒至恒量的工作基準(zhǔn)試劑無(wú)水碳酸鈉0.2 g（精確到0.000 1 g）溶于50 mL水中，加10滴溴甲酚綠-甲基紅指示液，用配制的鹽酸溶液滴定至溶液由綠色變?yōu)榘导t色，煮沸2 min，加蓋具鈉石灰管的橡膠塞，冷卻，繼續(xù)滴定至溶液再呈暗紅色;同時(shí)做空白試驗(yàn)，準(zhǔn)確計(jì)算鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度[C（HCl）]。

（4）甲基紅乙醇溶液（1 g/L）：稱(chēng)取0.1 g甲基紅溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。

（5）溴甲酚綠乙醇溶液（1 g/L）：稱(chēng)取0.1 g溴甲酚綠，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。

（6）混合指示液：1份甲基紅乙醇溶液與3份溴甲酚綠乙醇溶液臨用時(shí)混合。

（7）吸收液：硼酸溶液（20 g/L）和混合指示液均勻混合而成。

1.3 儀器和設(shè)備

ME204/02型分析天平[感量為1 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)]，K12A全自動(dòng)凱氏定氮儀（上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司生產(chǎn)），SH230N石墨爐消解儀（山東海能科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)），DFT-200C超高速粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司生產(chǎn)），101-2ES電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司生產(chǎn)）。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 采收

本實(shí)驗(yàn)的板栗果實(shí)采自廣西百色市隆林縣，采收方法有兩種，即拾栗法和打粟法。拾栗法就是待栗充分成熱，自然落地后，人工拾栗實(shí)。打栗法就是分散分批地將成熟的栗苞用竹竿輕輕打落，然后將栗苞、栗實(shí)揀拾干凈。

2.2 制樣

板栗進(jìn)行暴曬后去殼，在110 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥1～2 h，用超高速粉碎機(jī)粉碎，裝入塑料瓶中備用。

2.3 消解

消解藥品：濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅。板栗消解條件：稱(chēng)取板栗樣品0.5 g（精確至0.000 1 g）于干燥消解管內(nèi)，依次加入3.5 g硫酸鉀、0.5 g硫酸銅、10 mL濃硫酸，消解過(guò)程采用曲線升溫模式，設(shè)定消解爐消解參數(shù)：一階段220 ℃維持20 min，二階段420 ℃維持60 min（消解爐可提前預(yù)熱至220 ℃），放入樣品，打開(kāi)尾氣回收，待時(shí)間結(jié)束，可觀察樣品，與試劑空白一樣呈澄清，有淡綠色即為消解完全，靜置冷卻。

2.4 蒸餾

檢查并補(bǔ)充蒸餾水桶、堿液桶、硼酸桶、標(biāo)液瓶?jī)?nèi)試劑;打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，同時(shí)打開(kāi)自來(lái)水閥;在“維護(hù)”欄“初始化滴定器”1次，“清洗滴定缸”3次;開(kāi)機(jī)時(shí)，手動(dòng)先排空酸、堿管氣體（點(diǎn)擊“維護(hù)”再點(diǎn)擊“酸泵”“堿泵”），并置換標(biāo)液（點(diǎn)擊“初始化滴定器”3次），點(diǎn)擊“清洗滴定缸”3次;點(diǎn)擊“參數(shù)設(shè)置”輸入“標(biāo)液濃度”“換算系數(shù)”數(shù)值;安裝一空消化管，關(guān)閉安全門(mén)，點(diǎn)擊“測(cè)試”，點(diǎn)擊“工作模式”選擇“空白測(cè)試”，設(shè)置堿液量為10 mL，吸收液量為30 mL，點(diǎn)擊“運(yùn)行”空蒸，當(dāng)連續(xù)兩次空白值相差不大于0.1 mL，取后一次空白值為儀器空白（消解樣空白此時(shí)可測(cè)），然后把空白值輸入“維護(hù)”中“參數(shù)設(shè)置”輸入“空白”數(shù)據(jù);測(cè)定前應(yīng)該先用（NH4）2SO4標(biāo)準(zhǔn)品做氮回收率的測(cè)定，借以驗(yàn)證所用儀器、試劑及操作等條件的可靠性;要求（NH4）2SO4標(biāo)準(zhǔn)品氮回收率在95%～105%;點(diǎn)擊“測(cè)試”依次輸入“樣品量”“吸收液量”（30 mL）“堿液量（60 mL）”，然后安裝樣品，點(diǎn)擊“運(yùn)行”。工作完成后，點(diǎn)擊“數(shù)據(jù)”尋找對(duì)應(yīng)的樣品編號(hào)，點(diǎn)擊編號(hào)調(diào)出測(cè)試結(jié)果，并記錄;全部測(cè)試結(jié)束，點(diǎn)擊“維護(hù)”“清洗滴定缸”，關(guān)閉電源、水源。

2.5 數(shù)據(jù)處理

板栗樣品中蛋白質(zhì)的含量按下面的公式計(jì)算：

上式中：X為試樣中蛋白質(zhì)的含量，單位為g/100 g;V1為試液消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為mL;V2為試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為mL;C為硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，單位為mol/L;0.014 0為鹽酸[C（HCl）=1.000 mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，單位為g;m為試樣的質(zhì)量，單位為g;V3為吸取消化液的體積，單位為mL;F為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，板栗中氮轉(zhuǎn)換系數(shù)為5.30;100為換算系數(shù)。

3 結(jié)果與討論

以K12A全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定板栗種仁中粗蛋白含量，其中蒸餾（NH44）2SO4標(biāo)準(zhǔn)品的氮回收率見(jiàn)表1，板栗樣品中的蛋白質(zhì)含量見(jiàn)表2。板栗果實(shí)中粗蛋白質(zhì)含量平均為4.189 4%，該板栗樣品測(cè)定的粗蛋白符合《GH/T 1029—2002板栗》中蛋白質(zhì)理化要求≥3.4%的要求。本實(shí)驗(yàn)采用K12A全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定板栗果實(shí)中粗蛋白質(zhì)的含量具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、低耗、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，測(cè)定板栗果實(shí)中粗蛋白質(zhì)含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.28%（<10%，n=6），相對(duì)偏差小，是板栗果實(shí)中粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定的首選方法。

使用K12A全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定板栗果實(shí)中的粗蛋白質(zhì)所得結(jié)果誤差符合《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5—2016）標(biāo)準(zhǔn)要求的兩個(gè)測(cè)定值的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

4 結(jié)語(yǔ)

本文采用全自動(dòng)凱氏定氮法測(cè)定廣西百色地區(qū)板栗種仁的粗蛋白，測(cè)定板栗粗蛋白含量平均為4.189 4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.28%（<10%，n=6）。全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定食品中蛋白質(zhì)，具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、低耗、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，相對(duì)偏差小，是板栗種仁中粗蛋白測(cè)定的首選方法。

參 考 文 獻(xiàn)

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