鄒 瑞，張 玥，楊自云，藍(lán)增全，吳 田*

（1.西南林業(yè)大學(xué)國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心/園林園藝學(xué)院，昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)西南綠色發(fā)展研究院，昆明 650224）

紫娟茶（Camellia sinensis var.Kitamura）屬于普洱茶變種，是云南大葉種茶中較為獨(dú)特的品種[1]，因其紫莖、紫葉和紫芽的特點(diǎn)，其中半木質(zhì)化莖呈紫紅色，木質(zhì)化的莖呈褐綠色；葉形長(zhǎng)橢圓形，色綠，微紫；芽葉紫色，茸毛多。紫娟具有抗寒、抗旱和抗病蟲能力強(qiáng)的特點(diǎn)[2]。2005 年紫娟茶獲國(guó)家林業(yè)局植物新品種保護(hù)權(quán)，品種權(quán)號(hào)為20050031[3]。

雖然紫娟茶已有一定的種植規(guī)模[4]，但是在種質(zhì)資源保存及擴(kuò)繁方面比較單一地使用扦插法，大部分的種子得不到有效利用。在以茶樹莖段[5-6]、莖尖[7-8]等為外植體的組織培養(yǎng)過(guò)程中，由于莖段等含有大量的酚類物質(zhì)，而傷口會(huì)激活其中的多酚氧化酶，將多酚類物質(zhì)氧化為褐色的醌類物質(zhì)，進(jìn)而擴(kuò)散到整個(gè)培養(yǎng)基，造成細(xì)胞褐變死亡[9]，并且由于茶樹內(nèi)生菌含量較為豐富[10-11]原因，污染率通常也很高，導(dǎo)致培養(yǎng)失敗。在本課題組前期的茶樹組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，茶樹種子作為外植體可大幅度降低褐化率及污染率。

ISSR 技術(shù)廣泛應(yīng)用于茶樹的種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析，例如：吳田等研究云南峨毛茶的遺傳相似系數(shù)介于0.45～0.64 之間，表明了同一地區(qū)的云南峨毛茶會(huì)產(chǎn)生遺傳分化[12]、滇中茶的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.58～0.80[13]、云南昭通小葉種茶的遺傳相似系數(shù)在0.55～0.76 之間[14]等；在茶樹的遺傳多樣性分析的研究中，吳清韓等[15]表明了鳳凰單叢茶樹的遺傳相似系數(shù)在0.59～0.97 之間、朱晨等[16]表明了福建省的53 份茶樹資源的遺傳相似系數(shù)在0.66～0.99 之間。茶樹屬于異花授粉植物，實(shí)生后代會(huì)發(fā)生一定程度的變異，王玉等[17]對(duì)黃山種茶樹實(shí)生子后代進(jìn)行抗寒評(píng)價(jià)，選育出幾個(gè)抗寒性較強(qiáng)的材料。但是在紫娟茶上尚未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)紫娟茶分子方面的研究大多集中于花青素的方面[18-19]。本試驗(yàn)擬采用紫娟茶種子自然雜交后的種子作為外植體進(jìn)行消毒，萌發(fā)無(wú)菌試管苗，用ISSR 分子標(biāo)記及花青素含量測(cè)量對(duì)隨機(jī)挑選的實(shí)生苗與紫娟母株進(jìn)行遺傳及特有特征的差異分析，為后續(xù)利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)紫娟茶種質(zhì)資源的保存、利用提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫娟種子于2017 年12 月采自西南林業(yè)大學(xué)樹木園（從云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所引種），隨機(jī)選擇果殼呈綠色、微現(xiàn)裂縫和無(wú)病蟲害的茶果50顆，帶回實(shí)驗(yàn)室，3 d 后待果殼脆硬、呈棕褐色時(shí)開(kāi)裂釋放種子，每個(gè)茶果選擇飽滿的茶籽1 顆用于無(wú)菌萌發(fā)。從無(wú)菌萌發(fā)的試管苗中隨機(jī)選擇15 份作為后續(xù) ISSR 檢測(cè)的材料，編號(hào)為 SS1～SS15（SS 為“實(shí)生”漢語(yǔ)拼音首字母縮寫）。ZJ（為“紫娟”漢語(yǔ)拼音首字母縮寫）是紫娟茶原種，從云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所引種。

1.2 紫娟茶種子無(wú)菌萌發(fā)

剝除紫娟茶種子的外種皮及內(nèi)種皮，于4% 的次氯酸鈉（NaClO）溶液消毒5 min，無(wú)菌水洗滌4次，75%的酒精消毒45 s，無(wú)菌水洗滌4 次，濾干水分，置于無(wú)糖 MS 培養(yǎng)基（pH 值為 5.7～5.75）上萌發(fā)，萌發(fā)條件：（25±2）℃，光照時(shí)間為 12 h/d。30 d 時(shí)統(tǒng)計(jì)污染率和萌發(fā)率，污染率=污染種子數(shù)/接種種子總數(shù)*100%。

1.3 紫娟茶花青素含量測(cè)量

將無(wú)菌試管苗的頂芽剪下用于擴(kuò)繁，植株的其余部分移栽至田間。3 個(gè)月后，用液氮研磨茶樹的頂芽，用酸性乙醇提取，定容到50 mL，2 000～2 500 rpm/min離心5 min。吸取4 mL 上清液于刻度試管中，加入6 mL 酸性乙醇，顯色30 min。以酸性乙醇為空白對(duì)照，測(cè)OD525。根據(jù)吸光值來(lái)計(jì)算花青素的含量，計(jì)算公式：花青素含量（mg/g）=[（A 液-A 照液）*101.83]/[吸取供液量（mL）* 樣品質(zhì)量（g）][20]。

1.4 基因組DNA提取

用TIANGEN DNA secure Plant Kit 試劑盒提取16 份紫娟茶的DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣本DNA 并成像觀察其電泳條帶，用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃度，同時(shí)，測(cè)量OD260/OD230、OD260/OD280。

1.5 ISSR引物的篩選及PCR擴(kuò)增

從100 個(gè)通用的ISSR 引物中隨機(jī)選出 28 個(gè)引物（見(jiàn)表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，參照張玥等[21]的方法。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)電泳圖中的條帶情況進(jìn)行觀察、統(tǒng)計(jì)，相同遷移位置下，無(wú)帶的標(biāo)記為0，相應(yīng)位置有帶的標(biāo)記為1。根據(jù)讀帶情況計(jì)算紫娟茶種質(zhì)的多態(tài)性：多態(tài)性=（總帶數(shù)-共有帶數(shù)）/總帶數(shù)×100%。

1.7 遺傳相似系數(shù)

根據(jù)0、1 讀帶結(jié)果計(jì)算其總擴(kuò)增帶數(shù)和總特異帶數(shù)，并將0、1 矩陣圖輸入計(jì)算機(jī)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Popgene l.23 計(jì)算樣品的觀測(cè)等位基因數(shù)（Na），有效等位基因數(shù)（Ne），基因多樣性指數(shù)（H）和Shannon 信息指數(shù)（I）；采用 NTsys 2.1 軟件分析，相似性系數(shù)（GS）采用Dice 系數(shù)及對(duì)16 份紫娟茶進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類分析樹狀圖[22]。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 紫娟茶種子的無(wú)菌萌發(fā)

50 顆紫娟茶種子經(jīng)消毒處理，置于MS 無(wú)糖培養(yǎng)基上萌發(fā)，30 d 時(shí)污染率為0，萌發(fā)率為82%，即得到紫娟無(wú)菌試管苗41 棵。從中隨機(jī)選擇15 棵作為后續(xù)ISSR 的材料。

圖1 SS1-SS15 號(hào)紫娟茶無(wú)菌試管苗Figure 1 The sterile seedlings of SS1-SS15 of Zijuan tea

2.2 紫娟茶花青素含量測(cè)量

移栽后紫娟茶的實(shí)生苗幼嫩部分顏色差異明顯（見(jiàn)圖2）。通過(guò)對(duì)紫娟茶自然雜交后代的花青素測(cè)量發(fā)現(xiàn)，距離原種較近的株系，顏色較接近紫紅色，花青素含量也較高于其他株系，反之距離較遠(yuǎn)原種的株系，顏色越接近綠色，花青素含量較低（見(jiàn)圖3）。

圖2 紫娟茶實(shí)生苗移栽后頂芽的顏色變化Figure 2 Color changes of terminal buds of seedlings of Zijuan tea after transplantation

圖3 紫娟茶花青素含量質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)比圖Figure 3 Contrast chart of anthocyanin content in Zijuan tea

2.3 ISSR引物的篩選

對(duì)隨機(jī)選擇的28 條ISSR 引物進(jìn)行篩選，觀察電泳條帶的形態(tài)和帶數(shù)，可篩選出11 條能擴(kuò)增出清晰條帶的引物、且這些條帶具有重復(fù)性好和多態(tài)性高的優(yōu)點(diǎn)，分別為 826、827、835、836、840、841、842、844、848、855 和 856。

2.4 紫娟茶的ISSR多態(tài)性分析

將篩選出的11 個(gè)引物，分別對(duì)16 份DNA 進(jìn)行ISSR-PCR 擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)條帶大部分集中在250 bp 以上。引物840 擴(kuò)增出9 條DNA，其中多態(tài)性條帶7條，多態(tài)率為77.8%；引物841 共擴(kuò)增出9 條DNA，其中多態(tài)性條帶為6 條，多態(tài)率為 66.7%（見(jiàn)圖4）；引物856 共擴(kuò)增出10 條DNA，其中多態(tài)性條帶為8 條，多態(tài)率為80%。篩選出的11 個(gè)ISSR 引物共擴(kuò)增出92 條DNA，其中多態(tài)性條帶72 條，最高的是引物855，最低的是引物835，平均多態(tài)性為78.3%（見(jiàn)表2）。

圖4 引物840 對(duì)紫娟茶DNA 進(jìn)行擴(kuò)增情況Figure 4 Primer 840 amplifies the DNA of Zijuan tea

2.5 紫娟茶聚類分析

16 份紫娟茶的 GS 值變化范圍為 0.53～0.79，平均為 0.66，其中，SS14 和紫娟原種之間的 GS 值（0.79）最大、遺傳相似程度最高；而SS12 與紫娟原種之間的GS 值（0.63）最小、遺傳相似程度最低。通過(guò)聚類分析表明，在0.66 水平上16 份紫娟茶可分為3 組（見(jiàn)圖5），遺傳距離較遠(yuǎn)的一組包括 SS3、SS4、SS5 和 SS6，SS9 和SS12 遺傳距離較為居中，可以聚為一組，其他包括紫娟原種在內(nèi)的歸為一組。遺傳相似水平最高是SS14 與紫娟原種，遺傳相似水平在0.79 處劃分。

表2 紫娟茶的ISSR 多態(tài)性分析Table 2 ISSR polymorphism analysis of Zijuan tea

3 討論與結(jié)論

本研究運(yùn)用ISSR 分子標(biāo)記方法，對(duì)紫娟茶16 份種質(zhì)資源進(jìn)行分析，共篩選出11 個(gè)具有多態(tài)性的引物，擴(kuò)增出DNA 條帶92 條，多態(tài)性條帶72 條，多態(tài)百分比為78.3%，遺傳相似系數(shù)分布在0.53～0.79，平均為0.66，觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）為1.76，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.55，基因多樣性指數(shù)（H）為0.31，Shannon 信息指數(shù)（I）為0.45。通過(guò)聚類分析表明，在0.66 水平上16 份紫娟茶樣分為3 組，遺傳距離較遠(yuǎn)的群體包括 SS3、SS4、SS5 和 SS6，SS9 和 SS12遺傳距離較為居中，可聚為一組，其他包括紫娟原種在內(nèi)的歸為一組。遺傳相似水平最高是SS14 與紫娟原種，遺傳相似水平在0.79 處劃分。對(duì)比相似系數(shù)的聚類分析，距離紫娟原種較近的株系花青素含量相對(duì)較高。范凱通過(guò)ISSR 方法對(duì)“黃山種”自然雜交后代的基因多樣性（H）為0.27，得出了“黃山種”自然雜交后代具有豐富的遺傳變異[23]。在本實(shí)驗(yàn)中研究發(fā)現(xiàn)紫娟茶的H 為0.31，高于“黃山種”，暗示了紫娟茶的自然雜交后代遺傳變異較豐富。

圖5 紫娟茶遺傳關(guān)系聚類Figure 5 Genetic relationship cluster of Zijuan tea

茶樹的種間雜交存在雜交不親和，雜種易夭亡不能結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)率低，幼胚易停止發(fā)育或中途死亡，雜種不萌發(fā)及幼苗中途夭亡等現(xiàn)象[24]。通過(guò)組培手段是解決這些問(wèn)題的主要方法。在本試驗(yàn)中通過(guò)外植體消毒，萌發(fā)無(wú)菌苗的試驗(yàn)中50 顆種子成活了41 棵無(wú)菌苗，成活率為82%，為幼胚組培提供了有效的途徑。

紫娟茶有自己獨(dú)特的品質(zhì)特征，特別是其高花青素含量，在降低三高方面療效顯著[25]，更有報(bào)道表明在治療癌癥方面有作用[26]。本研究對(duì)紫娟茶原種及后代的花青素進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)紫娟茶自然雜交后代花青素含量與原種存在一定差異，可能是因?yàn)樽暇瓴枳匀浑s交后代移栽時(shí)間較短，只有3 個(gè)月，處于幼苗期，而田間的紫娟茶原種種植時(shí)間是2 年齡[27]。按照邵宛芳等[28]對(duì)云南茶樹資源保存的理論，可以構(gòu)建紫娟茶的核心種質(zhì)群，并種植在相對(duì)獨(dú)立的空間，有利于保證紫娟茶的優(yōu)良性狀，利于種質(zhì)資源的管理和保存。后續(xù)在利用紫娟茶其他實(shí)生苗時(shí)，建議先用ISSR 引物855 進(jìn)行一次篩選，然后根據(jù)需要選擇合適的株系。