薛 瑞，劉守川，趙坤坤，王迎迎，劉 杰*，閆文朝

（1.洛陽中科基因檢測診斷中心有限公司，河南洛陽 471000；2.河南科技大學(xué)，河南洛陽 471000）

2019 年4 月河南某豬場出現(xiàn)部分豬發(fā)燒、呼吸困難等癥狀，發(fā)病豬四肢、耳朵背后、臀部有大片的紅斑，剖檢發(fā)現(xiàn)皮下出血，腹股溝淋巴結(jié)腫大出血，下頜淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié)也均有出血現(xiàn)象；肺有實變，間質(zhì)增寬；心臟的心尖呈現(xiàn)鈍圓狀，心肌有輕微出血；腎表面有針尖狀出血點，髓質(zhì)有出血；四肢關(guān)節(jié)腫大，剖開關(guān)節(jié)，有清亮的膠凍樣滲出物；腦膜剪開后，有少量積液。病理變化較為符合副豬嗜血桿病癥狀，為確定病原，為臨床治療提供幫助，無菌采取肺臟樣品進行實驗室細(xì)菌分離，經(jīng)實驗室檢測結(jié)果分離到了副豬嗜血桿菌，血清型鑒定結(jié)果為9 型。

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）可引起豬的格氏病，是目前養(yǎng)豬生產(chǎn)中重要的細(xì)菌性呼吸道疾病。HPS 為上呼吸道常棲菌，只有在特定條件下才可能侵入機體并引起全身性疾病[1]，現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)，在同一豬在不同時間或空間引起副豬嗜血桿菌病的病原血清型都不一樣，需要對其血清型進行鑒定，以利于預(yù)防副豬嗜血桿菌。此外副豬嗜血桿菌通常作為繼發(fā)的病原存在[2-4]，通常由豬繁殖與呼吸綜合征、圓環(huán)病毒、豬流感和豬呼吸道冠狀病毒引起。

1 材料和方法

1.1 剖檢取樣

根據(jù)臨床癥狀和病理特征，無菌選取肺臟心葉部分進行細(xì)菌分離鑒定。

1.2 主要培養(yǎng)基和試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），購自青島海博試劑有限公司；新生牛血清，購自浙江天杭生物科技有限公司；氧化型輔酶I（NAD），購自上海生工生物工程股份有限公司；哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)，購自青島海博試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌微量生化管及藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；病毒核酸提取試劑盒，購自臺灣旭基；10×PCR Buffer、dNTPs、DNA Taq 酶、DNAmarker、6×loading buffer 等購自寶生物（大連）工程有限公司。

1.3 細(xì)菌分離

無菌剪取肺臟樣品，分別接到血平板和TSA+血清+NAD 培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長形態(tài)，挑取單菌落進行純化培養(yǎng)。

對純化培養(yǎng)后的菌株進行革蘭氏染色鏡檢和常規(guī)細(xì)菌生化試驗，挑取單菌落涂抹于載玻片上，滴加3%H2O2，觀察有無氣泡產(chǎn)生。

1.4 衛(wèi)星試驗生化鑒定

取一塊沒有添加NAD 的TSA 血清平板，在平板中間沿直徑線涂劃接種金黃色葡萄球菌，然后將可疑單菌落垂直金黃色葡萄球菌線劃線接種，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察是否出現(xiàn)靠近金黃色葡萄球菌線的菌落長勢較好、遠(yuǎn)離金黃色葡萄球菌線的地方無菌落生長的衛(wèi)星現(xiàn)象。

選取生化鑒定試管進行試驗時特別注意在生化鑒定管內(nèi)添加適量NAD。

1.5 分子鑒定及測序

根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA 基因，張盼峰等[5]設(shè)計了一對特異性引物，引物序列為：P1:5’-GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3’，P2：5’-GTG ATG AGG AAG GGT GT-3’，擴增出的目的片段大小為821 bp，該引物由英濰捷基（北京）貿(mào)易有限公司合成。

PCR 采用 25 μL 反應(yīng)體系，即 10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP 2.0 μL、DNA Taq 酶 0.5 μL，上下游引物各 1.0 μL（10 pmol/μL），DNA 模板 2.0 μL（25 ng/μL），ddH2O 16.0 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 5min，94 ℃60 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，剩余產(chǎn)物送通用生物公司測序。

對測序結(jié)果用DNASTAR 軟件處理，并與NCBI中已發(fā)表的基因序列進行同源性比較，選取同源性最高菌株的基因序列，采用DNASTAR-MEGALIGN軟件進行多重序列比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.6 多重PCR血清型分型

參照K.J.Howell 等[6]報道提供的引物進行血清型分型，引物序列見表1。

挑取單個菌落進行血清型分型，多重PCR 采用25 μL 反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP 2.0 μL、DNA Taq 酶 0.5 μL，各引物上下游 0.25 μL，DNA 模板 2.0 μL，ddH2O 11.0 μL。

多重 PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，共 30 個循環(huán)；68 ℃ 5min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 血清型多重PCR 引物序列Table 1 The sequences of multiplex PCR on serotype

1.7 藥敏試驗

挑取疑似單個菌落接種于TSB+血清+NAD 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)5～6 h，取100 μL均勻涂布于TSA+血清+NAD 培養(yǎng)基上。用紙片瓊脂擴散法（K-B 法）[7]進行藥敏試驗，選取頭孢噻呋、阿莫西林、阿米卡星、硫酸黏菌素、甲砜霉素、恩諾沙星、卡那霉素、慶大霉素、多西環(huán)素和氟苯尼考為試驗藥物，37 ℃培養(yǎng)16～18 h 后，記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小，根據(jù)說明書敏感和耐藥性的最小抑菌圈直徑判定菌株對所選藥物的敏感程度。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

肺臟有實變，間質(zhì)增寬；四肢關(guān)節(jié)腫大，剖開關(guān)節(jié)，有清亮的膠凍樣滲出物（見圖1）。

TSA+血清+NAD 平板上生長有表面光滑、小而透明的菌落（見圖2），革蘭氏染色為陰性桿菌（見圖3），呈多形性，觸酶陽性。心葉支氣管內(nèi)容物直接觸片革蘭氏染色可見陰性桿菌（見圖4）。

2.2 衛(wèi)星試驗及生化鑒定結(jié)果

分離株在血清平板上不生長，由圖5 可知分離株在靠近金黃色葡萄球菌直線處生長較好，而遠(yuǎn)離直線的地方基本沒有細(xì)菌生長。

從表2 得到，分離到的菌株不發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖，氧化酶和尿素酶陰性，硝酸鹽還原酶和接觸酶陽性，靛基質(zhì)和VP 試驗陰性。與副豬嗜血桿菌的生化特性一致。

2.3 分子鑒定結(jié)果

取單個純化且具有典型特點的菌落進行PCR鑒定，并設(shè)陽性和陰性對照。由圖6 可知陽性對照電泳條帶大小為821 bp，樣品擴增出了821 bp 左右的特異性條帶，陰性對照無條帶，與16SrRNA 引物擴增的基因片段長度相符，根據(jù)結(jié)果可判定為副豬嗜血桿菌。

圖1 病豬病理形態(tài)Figure 1 Pig pathological morphology

圖2 TSA+血清+NAD 平板上菌落形態(tài)Figure 2 The colony morphology of TSA+NBCS+NAD plate

圖3 革蘭氏染色鏡檢（1 000×）Figure 3 Microscopic morphology of HPS（1 000×）

圖4 心葉支氣管內(nèi)容物染色(1 000×)Figure 4 Bronchial contents in cardiac lobe（1 000×）

圖5 衛(wèi)星現(xiàn)象Figure 5 The result of Satellite test

表2 生化鑒定結(jié)果Table 2 The result of biochemical test

圖6 副豬嗜血桿菌PCR 鑒定結(jié)果Figure 6 The molecular identification result of HPS

2.4 細(xì)菌16SrRNA測序、系統(tǒng)進化樹構(gòu)建及同源性分析

由圖7 和圖8 可知，樣品與副豬嗜血桿菌NR_118757.1 的同源性為98.6%，說明該菌株為副豬嗜血桿菌。

2.5 血清型多重PCR結(jié)果

經(jīng)鑒定為副豬嗜血桿菌后，取單個菌落進行多重PCR 血清型鑒定，由圖9 可知樣品擴增出了700bp 左右的特異性條帶，陰性對照無條帶，將PCR產(chǎn)物送去測序，序列如下：

序列經(jīng)過比對后與GenBank 公布的KC795429.1副豬嗜血桿菌funV 同源性達99.85%，根據(jù)表1 所示判斷是9 型血清型。

圖7 系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 7 The phylogenetic tree

2.6 藥敏試驗結(jié)果

分離到的細(xì)菌對頭孢噻呋、阿米卡星、硫酸黏菌素、甲砜霉素、卡那霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考高敏；對阿莫西林、恩諾沙星耐藥，如表3。

3 討論

副豬嗜血桿菌病是豬的一種常見疫病，主要癥狀為呼吸困難，關(guān)節(jié)腫大，少數(shù)豬有神經(jīng)癥狀，臨床上病理變化主要以胸腔、腹腔和關(guān)節(jié)等部位出現(xiàn)纖維素性滲出為主。實驗室選擇根據(jù)采樣條件及運輸條件以肺臟為主，但是由于其臨床病理變化與豬肺疫、傳染性胸膜肺炎、鏈球菌等很難明確區(qū)分，所以應(yīng)以實驗室結(jié)果為最終判斷標(biāo)準(zhǔn)。目前，副豬嗜血桿菌的分離較難以進行主要原因有：1）樣品選擇和保存條件，副豬嗜血桿菌在4 ℃條件下僅能存活1天，而樣品從采集到實驗室，因為保存問題使其極難分離，肺臟底緣薄，為從第6 根骨肋軟骨交界處至第11 肋骨上端的弧線，在臨床診斷上具有重要意義，故而以肺臟為主要分離樣品；2）樣品原因，肺臟屬于開放性器官，而且呼吸道中細(xì)菌較雜，而在實驗室條件下能生長的菌也較多，對細(xì)菌分離有巨大的干擾；3）人員因素，細(xì)菌分離操作方法較為簡單，但是對操作人員素質(zhì)要求較高，需要對樣品中的菌群和疫病有較深認(rèn)識，且對細(xì)菌知識需要有系統(tǒng)性學(xué)習(xí)，尤其細(xì)菌形態(tài)學(xué)和基本生化條件有簡單認(rèn)知；4）細(xì)菌鑒定方法不正確，目前對于細(xì)菌鑒定，各實驗室基本只是通過PCR 的方法進行，這個方法嚴(yán)重影響副豬嗜血桿菌的分離，因為PCR 的方法因為敏感度和細(xì)菌結(jié)構(gòu)等因素的影響極容易出現(xiàn)假陰性的情況。針對以上因素建立了副豬嗜血桿菌分離鑒定的初步方法，以完整肺臟的心葉為主要操作對象，以國際通用的《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[8]為主要參考依據(jù)，發(fā)現(xiàn)其菌落形態(tài)基本為光滑透明菌落與在同樣條件下的巴氏桿菌菌落形態(tài)完全不一樣，觸酶陽性又可快速區(qū)分鏈球菌和傳染性胸膜肺炎放線桿菌，革蘭氏染色陰性桿菌排除陽性菌的可能，“衛(wèi)星現(xiàn)象”進行區(qū)分傳染性胸膜肺炎放線桿菌，根據(jù)肺臟的菌群和培養(yǎng)條件，極大地提高了副豬嗜血桿菌的分離鑒定效率，降低了操作人員的技術(shù)要求，節(jié)約了成本。

隨著對抗生素使用的約束，細(xì)菌病的預(yù)防成了臨床關(guān)注的重點。目前副豬嗜血桿菌的血清型鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是通過使用陽性血清進行血清型分型[9-11]，但是這種方法對于臨床有較大的限制，需要有標(biāo)準(zhǔn)菌株和熟練的操作人員，以降低交叉性反應(yīng)的可能和提供穩(wěn)定的陽性血清。隨著分子方法的不斷發(fā)展和對基因序列研究的加深，現(xiàn)階段使用較多的方法主要是腸桿菌基因重復(fù)序列PCR（ERIC-PCR）和限制性片段長度多態(tài)性PCR（PCR-RFLP）。ERICPCR 技術(shù)是建立在重復(fù)序列PCR（Rep-PCR）基礎(chǔ)上的一種方法，利用ERIC 中的保守序列設(shè)計一對反向引物，擴增細(xì)菌基因組中的未知序列并產(chǎn)生具有特異性的指紋圖譜，達到對不同菌株分型的目的[12]。但是ERIC-PCR 指紋圖譜方法對人員素質(zhì)的要求比較高，不利于在臨床中推廣。PCR-RFLP 指紋圖譜是在PCR 和DNA 序列分析基礎(chǔ)上產(chǎn)生的限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)，通過PCR 擴增一段DNA 片段，然后選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶，消化PCR 產(chǎn)物，經(jīng)電泳得到特異性的電泳譜帶，達到鑒定不同基因型的目的，但是此方法成本高，人員素質(zhì)要求高。而本文提到的多重PCR 方法能夠降低了技術(shù)要求和成本，提高了日常檢測的效率，對于豬場或存在多種血清型的情況，可以快速地檢測，操作簡單，容易普及推廣，適用于臨床快速檢測診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

圖9 多重PCR 分型結(jié)果Figure 9 The result of multiplex PCR

表3 藥敏試驗結(jié)果Table 3 The results of antibiotic sensitivity tests