熊關(guān)慶，馮 楊，楊玉涔，段惠民，黃彥博，李泉汐，李志洪，石存斌，汪開(kāi)毓，黃小麗*

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院水產(chǎn)系，成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130）

厚樸（Mangnolia officinalis）為木蘭目（Magnoliales）木蘭科（Magnoliaceae）木蘭屬（Mangnolia）植物，其樹(shù)皮為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，具有濕滯傷中、脘痞吐瀉、食積氣滯、腹脹便秘及痰飲喘咳等功效。厚樸酚（Magnolol）與和厚樸酚（Honokiol）作為厚樸主要有效成分，二者互為異構(gòu)體，均具有與厚樸類似的藥理作用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)和厚樸酚的藥理學(xué)研究較多，且認(rèn)為其藥理作用強(qiáng)于厚樸酚。廖國(guó)桐報(bào)道和厚樸酚可以減少心肌梗死面積，并在改善局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)的腦梗死大鼠中表現(xiàn)出抗心律失常作用[1]。研究還發(fā)現(xiàn)和厚樸酚能誘導(dǎo)小鼠乳腺癌細(xì)胞[2]、A549 人肺癌細(xì)胞[3]和 Lewis 小鼠肺癌細(xì)胞[4]等腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，并減緩其在活體中的實(shí)體瘤形成。此外，和厚樸酚對(duì)于神經(jīng)、心血管疾病、白內(nèi)障和糖尿病等均具有良好的治療效果。作為人類疾病治療當(dāng)中的有效藥物成分，和厚樸酚具有良好的藥物開(kāi)發(fā)前景。

不僅在人類疾病中有廣泛的藥理作用，和厚樸酚在水生動(dòng)物疾病的治療中亦有顯著的功效。近年來(lái)，關(guān)于和厚樸酚治療魚(yú)類疾病的報(bào)道越來(lái)越多。陳曉慧等發(fā)現(xiàn)和厚樸酚抗草魚(yú)呼腸孤病毒（grass carp reovirus，GCRV）作用中，對(duì) GCRV 的抑制率超過(guò)70%[5]；鐘志宏等發(fā)現(xiàn)和厚樸酚對(duì)于刺激隱核蟲(chóng)（Cryptocaryon irritans 鲹）導(dǎo)致的卵形鯧 白點(diǎn)病有良好的防治效果[6]。Feng Y.等研究還發(fā)現(xiàn)和厚樸酚能較好殺滅水霉菌（Saprolegnia spp.），在魚(yú)類水霉病的防治中具有作用[7]。這些結(jié)果表明，和厚樸酚在水生動(dòng)物藥物開(kāi)發(fā)中具有較好的前景，目前對(duì)于和厚樸酚的毒性研究相對(duì)較少，和厚樸酚在疾病治療中的安全性還有待進(jìn)一步評(píng)估。

斑馬魚(yú)（Danio rerio）為輻鰭魚(yú)綱（Actinopterygii）鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）魚(yú)類，是一種理想的脊椎動(dòng)物模型。研究表明，斑馬魚(yú)在分子、細(xì)胞和組織水平上和哺乳動(dòng)物高度相似，并在發(fā)育方式[8-9]、疾病發(fā)生[10-11]等過(guò)程均具有與人類類似的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于人類疾病模型和藥物篩選領(lǐng)域[12]。此外，斑馬魚(yú)的分類地位也證明其在水生動(dòng)物藥物的毒性評(píng)估中的重要地位。作為從厚樸中提取的主要藥物成分，和厚樸酚是人類及水生動(dòng)物疾病治療當(dāng)中重要的候選藥物。本試驗(yàn)擬使用斑馬魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象，探究和厚樸酚對(duì)斑馬魚(yú)的毒性影響，旨在為和厚樸酚在藥物開(kāi)發(fā)中的安全性評(píng)估提供參考借鑒。

1 材料和方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

試驗(yàn)藥品：和厚樸酚購(gòu)自廣州晶晶生物有限公司，采用超臨界CO2萃取技術(shù)提取，純度≥98%；其他藥品如乙醇、甲醛等均為分析純。

試驗(yàn)動(dòng)物：試驗(yàn)用健康斑馬魚(yú)200 尾，體長(zhǎng)（2.91±0.11）cm，體質(zhì)量（0.3±0.023）g，購(gòu)自廣東省某斑馬魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)，購(gòu)回后于600 L 暫養(yǎng)池中暫養(yǎng)一周。暫養(yǎng)期間養(yǎng)殖用水為自來(lái)水（使用前曝氣1 d），每日換水量 1/3～1/2，水溫（25±2）℃，pH 7～8，日∶夜比為12 h∶12 h，其間投喂斑馬魚(yú)商用飼料。

1.2 動(dòng)物分組及處理

試驗(yàn)開(kāi)始前1 d 對(duì)斑馬魚(yú)停止喂食，選擇無(wú)傷、健壯的健康斑馬魚(yú)165 尾，用于本次和厚樸酚毒性評(píng)估。由于和厚樸酚難溶于水，參照保志娟等[13]的方法，試驗(yàn)前用無(wú)水乙醇溶解和厚樸酚配置1 g/L 的母液（現(xiàn)配現(xiàn)用），并按不同濃度將母液溶于曝氣自來(lái)水中配制成試驗(yàn)用液。試驗(yàn)分預(yù)試驗(yàn)和急性毒性研究?jī)刹糠帧?/p>

預(yù)試驗(yàn)：試驗(yàn)設(shè)立空白組（曝氣自來(lái)水）、助溶劑乙醇組（1%）、和厚樸酚組（0.1、1、10 和 100 mg/L）共6 組，每組10 尾魚(yú)。將受試斑馬魚(yú)放入1.5 L 試驗(yàn)用液中浸泡喂養(yǎng)，試驗(yàn)期間保持試驗(yàn)條件與暫養(yǎng)條件（水體/環(huán)境）相同。試驗(yàn)期間不投喂飼料，并記錄各試驗(yàn)組中斑馬魚(yú)的死亡情況，并確定和厚樸酚的急性攻毒濃度。

急性毒性研究：試驗(yàn)設(shè)立空白組（曝氣自來(lái)水）、乙醇組（1%）和厚樸酚組（根據(jù)預(yù)試驗(yàn)設(shè)置和厚樸酚濃度為 0.1、0.2、0.4、0.6 和 0.8 mg/L）共 7 組（3 平行/組，5 尾魚(yú)/平行）。將受試斑馬魚(yú)放入1.5 L 試驗(yàn)用液中浸泡喂養(yǎng)，試驗(yàn)期間保持試驗(yàn)條件與暫養(yǎng)條件（水體/環(huán)境）相同。試驗(yàn)期間不投喂飼料，每12 h 更換清水/藥液1 次，整個(gè)試驗(yàn)周期為96 h。其間記錄各試驗(yàn)組中斑馬魚(yú)的臨床癥狀以及死亡情況，并及時(shí)撈出死魚(yú)。

1.3 病理學(xué)觀察

攻毒試驗(yàn)結(jié)束后，取各濃度組的存活斑馬魚(yú)，MS-222 麻醉后首先檢查病魚(yú)體表完整性及其他體表癥狀，體視顯微鏡（永新，中國(guó)）下觀察內(nèi)臟器官的大體病理表現(xiàn)。剪除斑馬魚(yú)尾部，并將剩余全魚(yú)在腹腔開(kāi)矢狀切口后固定于10%中性緩沖福爾馬林固定液中48 h。接著，將樣品脫鈣24 h，水洗過(guò)夜，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片（3 μm），蘇木精-伊紅（H&E）染色，中性樹(shù)膠封片。電子顯微鏡下（Nikon，日本）觀察各試驗(yàn)組中斑馬魚(yú)的鰓、眼、腦、心臟、肝臟、脾臟、中腎、腸道、性腺、皮膚及肌肉等器官的組織病理?yè)p傷情況，并拍照記錄。

參照D.Bernet[14]等設(shè)計(jì)評(píng)分體系，對(duì)充血和壞死的程度進(jìn)行打分。根據(jù)器官充血和壞死程度，使用從0 到6 的分?jǐn)?shù)對(duì)其病變程度（α）進(jìn)行評(píng)估：0 表示無(wú)變化；2 表示輕度發(fā)生；4 表示中度發(fā)生；6 表示嚴(yán)重發(fā)生。此外，不同類型的病變對(duì)器官功能和魚(yú)類生存的影響能力不同，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)充血和壞死的重要因子（ω），即充血為可逆性變化“1”，壞死為不可逆性變化“2”。不同試驗(yàn)組中每尾魚(yú)的各器官指數(shù)（Sorg）：Sorg=∑病變類型α*ω，不同試驗(yàn)組中每尾魚(yú)的總病變指數(shù)為：S總=Sorg。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0（IBM，美國(guó)）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。采用Log-rank 檢驗(yàn)不同濃度和厚樸酚對(duì)斑馬魚(yú)致死率的差異性（*P＜0.05 為差異顯著，**P＜0.01為差異極顯著）。此外，采用單因素方差（one-way ANOVA）分析t 檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)不同試驗(yàn)組中斑馬魚(yú)的器官指數(shù)和總病變指數(shù)差異（不同小寫字母表示差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 和厚樸酚濃度對(duì)斑馬魚(yú)的死亡率影響

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，在（25±2）℃下，最高濃度100 mg/L 的和厚樸酚能導(dǎo)致斑馬魚(yú)在6 h 內(nèi)出現(xiàn)全部死亡，而10 mg/L 和厚樸酚也能在12 h 內(nèi)導(dǎo)致斑馬魚(yú)出現(xiàn)全部死亡。此外，1.0 mg/L 和厚樸酚組中斑馬魚(yú)在24 h 內(nèi)全部死亡，0.1 mg/L 厚樸酚組中斑馬魚(yú)在96 h 內(nèi)仍未出現(xiàn)死亡。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選用0.1～1.0 mg/L 和厚樸酚濃度進(jìn)行斑馬魚(yú)急性毒性研究（圖1），以分析和厚樸酚半數(shù)致死濃度（LC50）和藥物安全濃度（SC）。

圖1 不同和厚樸酚濃度對(duì)斑馬魚(yú)的生存率影響（n=15）Figure 1 Effect of honokiol on survival rate of zebrafish （n=15）

急性毒性研究結(jié)果顯示，0.1～1.0 mg/L 時(shí)和厚樸酚對(duì)斑馬魚(yú)的毒性呈濃度-時(shí)間依賴性關(guān)系。其中，與對(duì)照組和乙醇組相比，0.4 mg/L 和厚樸酚能導(dǎo)致斑馬魚(yú)在96 h 內(nèi)出現(xiàn)顯著死亡，而0.6 和0.8 mg/L和厚樸酚能造成斑馬魚(yú)在96 h 內(nèi)出現(xiàn)極顯著死亡，并以0.8 mg/L 和厚樸酚造成的死亡最為顯著，在96 h時(shí)致死率達(dá)93.3%（14/15）（圖1），而空白組及乙醇組中斑馬魚(yú)均未出現(xiàn)死亡。參照寇氏（Kochi）法[15][lgLC50=1/2（mi+mi+1）×（pi+1-pi）；mi為和厚樸酚濃度對(duì)數(shù)，pi為死亡率]，根據(jù)死亡情況計(jì)算和厚樸酚對(duì)斑馬魚(yú)的 96 h 半致死濃度（96 h-LC50）為（0.530±0.014）mg/L，72 h-LC50為（0.679±0.013）mg/L，48 h-LC50為（0.758±0.012）mg/L，24 h-LC50為（0.816±0.01）mg/L。此外，根據(jù)Reed-Muench 法[16-17]（SC=48-LC50×0.3×（24-LC50/48-LC50）2）計(jì)算 SC 為（0.264±0.003）mg/L。

2.2 和厚樸酚濃度對(duì)斑馬魚(yú)的毒性病理學(xué)損傷

試驗(yàn)期間，各試驗(yàn)組斑馬魚(yú)并未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，死亡的斑馬魚(yú)無(wú)明顯大體病理表現(xiàn)，僅有少量死魚(yú)表現(xiàn)為鰓蓋向外擴(kuò)張的現(xiàn)象。由于試驗(yàn)期間0.8 mg/L 和厚樸酚濃度組斑馬魚(yú)死亡后組織有自溶現(xiàn)象，因此未對(duì)其進(jìn)行組織病理學(xué)分析，而選擇 0.2 mg/L（≈SC）和 0.6 mg/L（≈LC50）和厚樸酚組斑馬魚(yú)進(jìn)行分析，以期了解不同和厚樸酚濃度對(duì)斑馬魚(yú)各器官的影響。與對(duì)照組相比，乙醇組及和厚樸酚組斑馬魚(yú)出現(xiàn)了多器官組織變化（圖2～5，表1），主要表現(xiàn)為乙醇組鰓、腸道、肝臟、中腎和心臟等器官小血管及毛細(xì)血管輕微充血，而和厚樸酚組斑馬魚(yú)除了表現(xiàn)為多器官充血外，還出現(xiàn)鰓小片呼吸上皮壞死、以及腦嚴(yán)重充血。此外，乙醇及和厚樸酚組中斑馬魚(yú)的眼、脾臟、性腺、皮膚和肌肉等器官均未出現(xiàn)明顯病理變化。斑馬魚(yú)在不同藥物處理下各器官的組織病理學(xué)變化如下：

不同濃度藥液浸泡過(guò)程中，斑馬魚(yú)鰓為主要損傷部位（表1）?？瞻捉M中斑馬魚(yú)鰓未出現(xiàn)明顯病理變化（圖2A）。然而，乙醇組中斑馬魚(yú)鰓出現(xiàn)充血癥狀，其鰓小片增粗、頂端明顯腫大（圖2B）。相比之下，0.2 和0.6 mg/L 和厚樸酚組中斑馬魚(yú)鰓絲均出現(xiàn)腫大、充血加重的情況，鰓小片頂部形成動(dòng)脈瘤樣變（圖2C～D）。此外，0.6 mg/L 和厚樸酚組中鰓小片上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯脫落、壞死的癥狀（圖2C～D）。組織病理學(xué)結(jié)果表明，以乙醇為溶劑會(huì)導(dǎo)致鰓出現(xiàn)充血現(xiàn)象，而和厚樸酚加重了乙醇引起的斑馬魚(yú)鰓絲充血腫大的情況。此外，和厚樸酚對(duì)斑馬魚(yú)鰓呼吸上皮具有毒性作用，高濃度下能導(dǎo)致其出現(xiàn)壞死。

相對(duì)于其他器官，腦可能也是和厚樸酚毒性的靶器官之一（表1）。雖然空白組及乙醇組中斑馬魚(yú)腦均未出現(xiàn)明顯病理變化（圖3A～B），然而和厚樸酚組中斑馬魚(yú)腦部靜脈血管及毛細(xì)血管出現(xiàn)中度至重度充血（圖3C～D），說(shuō)明和厚樸酚可能通過(guò)改變血管通透性最終透過(guò)斑馬魚(yú)的血腦屏障。

圖2 和厚樸酚對(duì)斑馬魚(yú)鰓組織的毒性評(píng)估Figure 2 Toxicity assessment of honokiol to zebrafish gill

腸道的病理變化較輕（表1），空白組中斑馬魚(yú)腸道未出現(xiàn)明顯病理變化（圖4A），而乙醇組中少量試驗(yàn)魚(yú)腸道固有層及肌層內(nèi)血管出現(xiàn)輕度充血癥狀（圖4B）。相比之下，0.2 和0.6 mg/L 和厚樸酚組中斑馬魚(yú)腸道內(nèi)無(wú)明顯充血癥狀及其他明顯病理變化（圖4C；0.6 mg/L 和厚樸酚組）。組織病理學(xué)結(jié)果表明，和厚樸酚對(duì)于斑馬魚(yú)腸道并不具有明顯毒性作用。

圖3 和厚樸酚對(duì)斑馬魚(yú)腦組織的毒性評(píng)估Figure 3 Toxicity evaluation of honokiol on zebrafish brain

圖4 和厚樸酚對(duì)斑馬魚(yú)腸道的毒性評(píng)估Figure 4 Toxicity assessment of honokiol on the zebrafish intestine

此外，乙醇組中斑馬魚(yú)肝臟（圖5B）、中腎（圖5E）及心臟（圖5H）均出現(xiàn)明顯的充血癥狀；與乙醇組相比，0.2 和0.6 mg/L 和厚樸酚組中斑馬魚(yú)相應(yīng)部位（圖5C，F(xiàn)，I；這里僅列出 0.6 mg/L 和厚樸酚處理組）雖然亦出現(xiàn)明顯充血，但并未出現(xiàn)充血加重的情況及其他病理變化（圖6）。結(jié)果表明，和厚樸酚可能未對(duì)斑馬魚(yú)肝臟、腎臟及心臟等器官產(chǎn)生明顯毒性影響。

此外，乙醇及和厚樸酚組中斑馬魚(yú)的眼、脾臟、性腺、肌肉和皮膚等器官均未出現(xiàn)明顯病理變化。

圖5 和厚樸酚對(duì)斑馬魚(yú)肝、腎及心臟的毒性評(píng)估Figure 5 Toxicity evaluation of honokiol on liver， kidney and heart of zebrafish

圖6 各組組織病理學(xué)評(píng)分（數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3）Figure 6 Histopathological scores of each group（mean±SD， n=3）

3 討論與結(jié)論

和厚樸酚作為厚樸提取物，其抗腫瘤、抗菌等藥理作用已被廣泛研究，無(wú)論在人類還是水生動(dòng)物疾病的藥物開(kāi)發(fā)中均具有重要前景。然而，目前對(duì)于和厚樸酚的安全性研究較少，對(duì)于其藥物開(kāi)發(fā)中可能產(chǎn)生的毒性知之甚少。本研究通過(guò)和厚樸酚對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性病理學(xué)研究，確定高濃度的和厚樸酚對(duì)斑馬魚(yú)有致死作用，其96 h-LC50為（0.530±0.014）mg/L，72 h-LC50為（0.679±0.013）mg/L，48 h-LC50為（0.758±0.012）mg/L，24 h-LC50為（0.816±0.01）mg/L，而 SC 為（0.264±0.003）mg/L。此外，鰓可能為和厚樸酚的主要毒性靶器官，在和厚樸酚浸泡處理下能夠?qū)е脉w呼吸上皮出現(xiàn)壞死。和厚樸酚對(duì)于斑馬魚(yú)其他器官無(wú)明顯損傷作用，證明了其適宜濃度在藥物開(kāi)發(fā)當(dāng)中所具有的安全性。

呼吸系統(tǒng)是魚(yú)類與水環(huán)境最重要的接觸界面，鰓小片是魚(yú)類進(jìn)行氣體交換的場(chǎng)所[18]。本研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚浸泡可引起斑馬魚(yú)鰓充血，鰓小片增粗、頂端腫大膨脹以及鰓呼吸上皮壞死等病理變化。有報(bào)道和厚樸酚能夠?qū)е录?xì)胞膜通透性改變并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[19]，其可能具有損傷鰓上皮的能力。鰓的損傷可能導(dǎo)致斑馬魚(yú)呼吸系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡被打破，與外界氣體交換受阻，最終造成魚(yú)體死亡。雖然和厚樸酚對(duì)于殺滅魚(yú)體表面病原微生物具有良好的效果[6-7]，但根據(jù)本研究結(jié)果表明，魚(yú)類并不適應(yīng)長(zhǎng)期暴露于高濃度和厚樸酚的環(huán)境當(dāng)中，以免導(dǎo)致鰓出現(xiàn)不可逆的損傷。

腦作為生物機(jī)體的神經(jīng)中樞，在調(diào)控機(jī)體活動(dòng)與生命代謝中發(fā)揮著重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚雖未造成腦部明顯損傷，但會(huì)引起腦部血管出現(xiàn)明顯充血癥狀。和厚樸酚作為一種小分子多元酚化合物，能夠通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接穿越血腦屏障[20]。此外，研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚具有良好的腦保護(hù)作用，可縮小腦梗死范圍，降低腦含水量和減輕腦組織壞死[1，21]。于妮娜等發(fā)現(xiàn)和厚樸酚還能顯著改善犬腦缺血再灌注模型中腦部血流量和血壓[22]。因此，和厚樸酚可能通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦部，提高腦部血壓，最終保護(hù)腦免受缺血性損傷。然而，對(duì)于健康生物腦部，和厚樸酚可能引起腦血管充血，在使用和厚樸酚進(jìn)行全身性給藥時(shí)，可能需要注意其對(duì)腦部產(chǎn)生的副作用影響。

此外，作為一種有效的模式生物模型，斑馬魚(yú)在人類及魚(yú)類藥物篩選模型中發(fā)揮著重要作用。急性攻毒條件下，和厚樸酚對(duì)于斑馬魚(yú)無(wú)明顯視毒性、腎毒性、心臟毒性、肝毒性、腸道毒性以及生殖毒性，表明其在急性毒性評(píng)價(jià)中的安全性較高。因此，無(wú)論對(duì)于人類還是水生動(dòng)物進(jìn)行和厚樸酚藥物的開(kāi)發(fā)或許均具有巨大潛力。前期的研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚對(duì)水霉菌有較好的抑制效果，本研究通過(guò)和厚樸酚對(duì)斑馬魚(yú)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果確定和厚樸酚對(duì)魚(yú)類毒性較小。因此，在后期魚(yú)類藥物研制中可根據(jù)安全濃度和藥效結(jié)果來(lái)選擇最佳濃度，開(kāi)發(fā)一種新的水產(chǎn)中藥。