孫亞蘭，蔡伊娜，任冰雪，彭池方,*

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.深圳海關(guān) 食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045)

銅是人體內(nèi)含量第三的金屬元素，但攝入過量的銅離子(Cu2+)也會(huì)影響人體機(jī)能，損傷器官[1-2]。因此，對(duì)環(huán)境和食品中Cu2+的檢測(cè)受到關(guān)注。目前，Cu2+的檢測(cè)方法主要有原子吸收光譜法(AAS)[3]、共振散射光譜法[4]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[5]等，但這些方法需專業(yè)人員操作,成本高。因此，開發(fā)操作簡(jiǎn)單、成本低廉的Cu2+檢測(cè)方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

近年來，金屬納米簇以其低毒性、高熒光強(qiáng)度和良好的生物相容性引起了人們的極高興趣。至今，已有多種金屬納米簇(包括金、銀、銅等)在細(xì)胞成像、醫(yī)療診斷、小分子檢測(cè)和離子檢測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[6]。同時(shí)，人們還發(fā)現(xiàn)雙金屬納米簇(NCs)，如Au/AgNCs[7]、Cu/AgNCs[8-9]等也具有許多優(yōu)異的特性。Li等[9]利用DNA-Cu/AgNCs建立了一種高靈敏度的乙酰膽堿酯酶檢測(cè)方法，該法檢測(cè)乙酰膽堿酯酶的線性范圍為0.05～2.0 mU/mL，檢出限為0.05 mU/mL。

與傳統(tǒng)熒光材料相比，金屬納米簇的熒光強(qiáng)度相對(duì)較弱，因此，增強(qiáng)納米簇的熒光強(qiáng)度也是研究者關(guān)注的重點(diǎn)之一。2010年，Martinez課題組[10]通過DNA分子雜交將富含鳥嘌呤(Guanine，G)的DNA序列放置在DNA-AgNCs附近，發(fā)現(xiàn)DNA-AgNCs的熒光增強(qiáng)了500倍。Li等[11]通過“TTTTT”環(huán)將含G序列的適配體與合成銀納米簇的DNA序列直接連接，利用連接后的核酸序列作為模板DNA合成了熒光增強(qiáng)型的AgNCs，并將DNA-AgNCs應(yīng)用于細(xì)胞成像中。在此基礎(chǔ)上，Wang等[12]提出G-四聯(lián)體可以作為DNA模板的一部分，尤其是作為C3A(CCCA)結(jié)構(gòu)的DNA模板的一部分合成熒光增強(qiáng)型的DNA-AgNCs。綜上所述，將G堿基插入到鄰近C序列的位置時(shí)會(huì)使AgNCs出現(xiàn)熒光增強(qiáng)現(xiàn)象。Guo等[13]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將G堿基插入到連續(xù)的C序列模板中間位置時(shí)也可使AgNCs出現(xiàn)熒光增強(qiáng)現(xiàn)象。而雙金屬Cu/Ag納米簇(Cu/AgNCs)是否存在G堿基鄰近或插入增強(qiáng)效應(yīng)尚未見報(bào)道。

本文選擇常見的富C堿基序列制備DNA-Cu/AgNCs，探究了鄰近或插入G堿基序列對(duì)的DNA序列對(duì)DNA-Cu/AgNCs的熒光增強(qiáng)效應(yīng)，以及對(duì)不同金屬離子的選擇性；并基于此建立了快速高靈敏的Cu2+熒光檢測(cè)新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

紫外分光光度計(jì)(UV-2802pcs，優(yōu)尼柯公司)；高分辨透射電子顯微鏡(JEM-2100，日本電子株式會(huì)社)；分析天平(MS105DU，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；熒光分光光度計(jì)(F97Pro，上海棱光技術(shù)有限公司)。

硝酸銅(Cu(NO3)2)、硝酸銀(AgNO3)、硝酸鐵(Fe(NO3)3)、硫酸鎳(NiSO4)、硝酸鋁(Al(NO3)3)、氯化錳(MnCl2)、硝酸鉛(Pb(NO3)2)、硝酸鋅(Zn(NO3)2)溶液和硝酸汞(Hg(NO3)2)、硼氫化鈉(NaBH4)均為分析純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甘氨酸、5-嗎啉丙磺酸(MOPS)、九水合硝酸鐵(Fe(NO3)3·9H2O)、六水合硫酸鎳(NiSO4·6H2O)、九水合硝酸鋁(Al(NO3)3·9H2O)、四水合氯化錳(MnCl2·4H2O)、硝酸鉛(Pb(NO3)2)、六水合硝酸鋅(Zn(NO3)2·6H2O)、硝酸汞(Hg(NO3)2)均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為Millipore制備的18.2 MΩ·cm的超純水。

相關(guān)的DNA序列均由生工生物工程(上海)有限公司合成，7條不同模板DNA序列見表1。

表1 制備銅/銀納米簇的DNA模板序列

1.2 DNA-Cu/AgNCs的制備

DNA-Cu/AgNCs的合成方法根據(jù)文獻(xiàn)[14]方法稍作調(diào)整，具體如下：將45 μL AgNO3(1.0 mmol/L)、45 μL Cu(NO3)2(1.0 mmol/L)和10 μL不同序列的DNA(500 μmol/L)模板加入到90 μL磷酸鹽緩沖液(40 mmol/L，pH 7.0)中混合均勻，然后置于冰浴中孵育15 min后立即加入30 μL NaBH4(2.0 mmol/L)，置于暗處，室溫下孵育9.0 h。將所得DNA-Cu/Ag NCs溶液置于4 ℃下保存待用。

1.3 選擇性分析

分別配制20 μmol/L的硝酸鐵(Fe(NO3)3)、硫酸鎳(NiSO4)、硝酸鋁(Al(NO3)3)、氯化錳(MnCl2)、硝酸鉛(Pb(NO3)2)、硝酸鋅(Zn(NO3)2)和硝酸汞(Hg(NO3)2)溶液。取上述金屬離子溶液各50 μL，分別與50 μL DNA-Cu/AgNCs溶液室溫下孵育15 min后測(cè)定熒光發(fā)射光譜。

1.4 銅離子(Cu2+)檢測(cè)方法

首先將30 μL NaBH4(100 μmol/L)與20 μL汞離子(5.0 μmol/L)(含不同濃度銅離子)溶液室溫下混合均勻并孵育20 min，屏蔽汞離子。取用MOPS緩沖溶液(10 mmol/L，pH 8.0)稀釋2 000倍的DNA-Cu/AgNCs溶液30 μL，與20 μL上述含不同濃度銅離子的溶液室溫下孵育15 min,取該孵育后溶液100 μL加入石英比色皿，檢測(cè)反應(yīng)液在500 nm激發(fā)波長(zhǎng)處的熒光發(fā)射光譜。

1.5 樣品分析

收集實(shí)驗(yàn)室的自來水和湖水(取自無錫太湖)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。在自來水樣品中加入不同濃度(0.2、2.0、5.0 μmol/L)的Cu2+，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得到用于檢測(cè)的加標(biāo)自來水樣品。按照“1.4”方法測(cè)定加標(biāo)樣品的熒光發(fā)射光譜并計(jì)算回收率。類似地，在湖水中分別加入濃度為1.0、10.0、25.0 μmol/L的Cu2+，經(jīng)微孔濾膜過濾，用超純水稀釋5倍，按上述方法測(cè)試計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA-Cu/AgNCs的制備與表征

根據(jù)Guo等[13]的研究得知，在DNA模板中鄰近C堿基的位置添加G堿基可以增強(qiáng)銀納米簇?zé)晒?，由此，本文設(shè)計(jì)了3種在C堿基鄰近位置添加G堿基的方式，共得到7條不同序列，編號(hào)2～8，對(duì)照模板為合成銀納米簇的常用模板，編號(hào)為1，如表1所示。

圖1 DNA1-Cu/AgNCs～DNA8-Cu/AgNCs的熒光光譜圖

將使用DNA1～8合成的DNA-Cu/AgNCs分別編號(hào)為DNA1-Cu/AgNCs～DNA8-Cu/AgNCs，由熒光光譜圖(圖1)可見，DNA1-Cu/AgNCs在最大激發(fā)波長(zhǎng)為472 nm時(shí)，最大發(fā)射波長(zhǎng)為566 nm；DNA2-Cu/AgNCs在最大激發(fā)波長(zhǎng)為500 nm時(shí)，最大發(fā)射波長(zhǎng)為583 nm；DNA3-Cu/AgNCs～DNA8-Cu/AgNCs在最大激發(fā)波長(zhǎng)為465～469 nm時(shí)，最大發(fā)射波長(zhǎng)為550～560 nm；其中，DNA2-Cu/AgNCs相對(duì)于使用對(duì)照模板合成的銅/銀納米簇(DNA1-Cu/AgNCs)來說，不僅最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移了17 nm，而且在最大發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，這也與之前報(bào)道的將G序列插入C堿基的鄰近位置會(huì)導(dǎo)致銀納米簇?zé)晒庠鰪?qiáng)的結(jié)果一致[12]。

如圖2A所示，DNA2-Cu/AgNCs的紫外吸收光譜僅在262 nm處有最強(qiáng)吸收峰，這表明所制備的納米簇顆粒尺寸超??；而在最大激發(fā)波長(zhǎng)500 nm下，DNA2-Cu/AgNCs于583 nm處有最強(qiáng)吸收峰。由圖2B可知，DNA2-Cu/AgNCs的粒徑約3.0 nm，在水溶液中呈均勻分散狀態(tài)。由圖2C可見,DNA2-Cu/AgNCs主要由C、N、O、P、Cu、Ag 6種元素組成，其中Cu元素含量顯著高于Ag元素；元素面掃描分析(圖2D)也與此結(jié)果一致。

2.2 選擇性分析

為了考察DNA2-Cu/AgNCs對(duì)Cu2+檢測(cè)的選擇性，研究了該方法對(duì)常見的10種金屬離子(Fe2+、Ni2+、Al3+、Mn2+、Pb2+、Zn2+、 Hg2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+)的響應(yīng)。結(jié)果如圖3A所示(IF0為初始熒光強(qiáng)度,IF為加入Cu2+的熒光強(qiáng)度)，10 μmol/L的其他陽離子對(duì)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度無顯著影響，而1.0 μmol/L的Hg2+和10 μmol/L的Cu2+使DNA-Cu/AgNCs的熒光強(qiáng)度明顯猝滅。說明該納米簇對(duì)Hg2+和Cu2+均存在響應(yīng)。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)Cu2+的高選擇性測(cè)定，探討通過Hg2+的屏蔽來實(shí)現(xiàn)單一離子的檢測(cè)。如圖3B所示，5 μmol/L的NaBH4使被Hg2+猝滅的DNA2-Cu/AgNCs熒光強(qiáng)度得到完全恢復(fù)。已有研究表明，AgNCs表面存在許多Ag+，而Hg2+與Ag+之間存在強(qiáng)烈的親金屬作用。因此，推測(cè)Hg2+對(duì)DNA-Cu/AgNCs的猝滅效應(yīng)主要來自Hg2+與Ag+之間的親金屬作用。NaBH4可將Hg2+快速還原為Hg0，這將破壞Hg2+與Ag+之間的親金屬作用[14]，使DNA2-Cu/AgNCs的熒光恢復(fù)。

如圖3C所示，對(duì)比a、b、c和d 4組實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)NaBH4可以使DNA2-Cu/AgNCs被Hg2+猝滅的熒光得到恢復(fù)。e與f組實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說明掩蔽劑可以屏蔽Hg2+的影響。同時(shí)，NaBH4對(duì)Cu2+的檢測(cè)也基本無影響(圖3C中f、g)。上述結(jié)果表明，NaBH4可以在此傳感體系中作為Hg2+的掩蔽劑。

圖2 DNA2-Cu/AgNCs的熒光光譜與紫外吸收光譜(A)、TEM圖(B)、EDX譜圖(C)及元素面掃描圖(D)

圖3 檢測(cè)方法對(duì)不同金屬離子的選擇性(A)、不同濃度的NaBH4對(duì)Cu2+檢測(cè)的影響(B)以及不同反應(yīng)體系對(duì)DNA2-Cu/AgNCs熒光性能的影響(C)

Fig.3 Selectivity of the assay for different metal ions(A)，effect of NaBH4on Cu2+detection(B) and effect of different reaction system on the fluorescence intensity of DNA2-Cu/AgNCs(C)cHg2+:1.0 μmol/L,cother ions:10 μmol/L;NCs:DNA2-Cu/AgNCs

圖4 EDTA對(duì)DNA2-Cu/AgNCs(NCs)熒光的影響

2.3 Cu2+與DNA-Cu/AgNCs之間的作用

由圖4可見，DNA2-Cu/AgNCs的熒光被Cu2+猝滅后加入乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，其熒光強(qiáng)度可基本恢復(fù)；而EDTA對(duì)DNA2-Cu/AgNCs的熒光強(qiáng)度僅有較小影響。因此推測(cè)，Cu2+對(duì)于納米簇的熒光猝滅主要是通過核酸模板分子的絡(luò)合作用而發(fā)生。研究顯示，鳥嘌呤(G)可由其N7和O6原子以及胞嘧啶(C)上的N3和O2原子與Cu2+發(fā)生絡(luò)合作用[15]。另外，在DNA2-Cu/AgNCs的熒光被Hg2+猝滅后加入EDTA，其熒光強(qiáng)度無任何變化(圖e，f)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Hg2+主要通過和Ag+間的親金屬相互作用導(dǎo)致納米簇?zé)晒忖?。由于EDTA對(duì)Hg2+的絡(luò)合作用難以破壞Hg2+-Ag+鍵合作用，因此納米簇?zé)晒怆y以恢復(fù)。

2.4 Cu2+熒光檢測(cè)的條件優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線

為了提高DNA2-Cu/AgNCs檢測(cè)Cu2+的靈敏性，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定DNA2-Cu/AgNCs與Cu2+溶液的最適孵育時(shí)間為15 min，DNA2-Cu/AgNCs的最適稀釋倍數(shù)為2 000倍(圖5A,B)。在最優(yōu)反應(yīng)條件下，利用NaBH4掩蔽Hg2+，Cu2+濃度(x)在0.01～5.0 μmol/L范圍內(nèi)與熒光猝滅率IF/IF0(y)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.740 17-0.084 77x，r2=0.982 55，最低檢出限為5.0 nmol/L(根據(jù)3σ/s計(jì)算，其中σ為空白對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)偏差，s為指線性方程的斜率)。該方法的檢出限遠(yuǎn)低于《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749-2006)中規(guī)定的Cu2+的限量1.0 mg/L(15.6 μmol/L)。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法測(cè)定自來水和湖水樣品中的Cu2+含量并與原子吸收光譜(AAS)方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的自來水進(jìn)行0.2、2.0、5.0 μmol/L 3個(gè)水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，對(duì)湖水進(jìn)行1.0、2.0、5.0 μmol/L 3個(gè)水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。該方法對(duì)Cu2+的回收率為89.6%～107%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.7%～8.6%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

表2 自來水和湖水樣品中Cu2+的檢測(cè)(n=3)

(續(xù)表2)

SampleAdded(μmol/L)Found(nmol/L)Recovery(%)RSD(%)AAS(μmol/L)Lake water0239.0--223.71.0964.396.47.9 -2.02 1081055.3 -5.05 3101065.4-

3 結(jié) 論

基于雙金屬DNA-Cu/AgNCs存在的G堿基鄰近增強(qiáng)效應(yīng)以及由此產(chǎn)生的對(duì)Cu2+的特異性響應(yīng)，建立了測(cè)定Cu2+的熒光傳感方法。該方法的線性范圍為0.01～5.0 μmol/L，檢出限低至5.0 nmol/L。方法可用于實(shí)際樣品檢測(cè)，且具有簡(jiǎn)單快速、選擇性高、成本低等優(yōu)點(diǎn)。