蘇容容，熊蝶，袁嵐玉，馮武，陳加平

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070)

亞硝酸鹽在食品加工中普遍存在，對人體有一定潛在的危害，過量食用會導(dǎo)致體內(nèi)攝入的亞硝酸鹽含量超標(biāo)，引發(fā)一系列的安全問題。亞硝酸鹽可與胺和酰胺反應(yīng)生成N-亞硝基化合物，將增加胃癌、食道癌、鼻咽癌和膀胱癌的患病患病風(fēng)險[1-3]。同時，亞硝酸鹽還可將血紅蛋白中的Fe2+氧化成Fe3+，導(dǎo)致高鐵血紅癥[4]。因此，有效控制食品中亞硝酸鹽含量，提高其食用安全性已經(jīng)成為人們研究的熱點問題。

目前報道的降解亞硝酸鹽的方法有很多種，但最簡單、安全、有效的方法是利用乳酸菌控制發(fā)酵食品和腌制品中的亞硝酸鹽[5]。近些年來，國內(nèi)外不少學(xué)者從泡菜和肉制品中分離出了具有降解亞硝酸鹽作用的乳酸菌[6-10]。Dodds和Collins-Thompson從商業(yè)肉制品中分離出乳酸菌，經(jīng)鑒定后基本為同型發(fā)酵乳酸菌，并發(fā)現(xiàn)乳酸的產(chǎn)生和pH的降低可能是培養(yǎng)基中亞硝酸鹽降解的主要原因。楊晶等人研究發(fā)現(xiàn)從泡菜中分離的植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸對亞硝酸鹽具有降解作用。張慶芳等人研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌產(chǎn)生的酸和亞硝酸鹽還原酶對亞硝酸鹽的降解起著重要作用。不同種類的乳酸菌降解亞硝酸鹽效果和降解機理存在差異性。因此，本文研究從泡菜中分離的植物乳桿菌P51降解亞硝酸鹽的影響因素，分析其降解亞硝酸鹽的作用機制，為乳酸菌發(fā)酵制品的應(yīng)用和控制生產(chǎn)過程中亞硝酸鹽含量提供了重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基

植物乳桿菌P51：實驗室前期從重慶、四川、陜西和湖北四地家庭自制泡菜中分離篩選出來的菌株。

MRS肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉浸粉8.0 g，酵母浸粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.04 g，吐溫-80 1.0 g，蒸餾水1000 mL，pH值5.7±0.2，121 ℃滅菌20 min，備用。

1.1.2 試劑

氯化鈉、磺胺、鹽酸萘乙二胺、鹽酸、亞硝酸鈉(均為分析純)：上海國藥集團化學(xué)試劑公司；乳酸(分析純)：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250型生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Microfuge 20R型高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；M200 Pro型光吸收酶標(biāo)儀 瑞士帝肯集團公司；VD-1320型超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；YX-24LDJ型手提式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；UV1800型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；PHS-3C型數(shù)顯pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 亞硝酸鹽含量測定

采用格力斯反應(yīng)比色法測定培養(yǎng)基中亞硝酸鹽含量，將發(fā)酵液離心(10000 r/min，5 min，4 ℃)，取上清液稀釋到合適的濃度后取1 mL于具塞比色管中，分別加入顯色劑0.2%磺胺溶液、0.1%鹽酸萘乙二胺溶液、44.5%鹽酸溶液各1 mL，搖勻，在暗處反應(yīng)5 min，用超純水定容至10 mL，混勻，在538 nm下測定吸光值[11]。亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線也采用類似的方法進行繪制，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液中的亞硝酸鹽含量，并計算降解率。

降解率(%)=(初始培養(yǎng)基中NaNO2含量-發(fā)酵液中NaNO2含量)/初始培養(yǎng)基中NaNO2含量×100%。

1.3.2 菌懸液的制備

取保存于4 ℃冰箱中植物乳桿菌P51的斜面，用接種環(huán)在MRS瓊脂培養(yǎng)基上劃線，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，然后取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)16 h。經(jīng)冷凍離心(10 ℃，20 min，6000 r/min)棄去上清液，用生理鹽水重懸2次后調(diào)整到菌濃度為1×108CFU/mL。

1.3.3 溫度對植物乳桿菌P51降解亞硝酸鹽的影響

將植物乳桿菌P51活化后，用0.85%的生理鹽水制備成菌懸液。按照2%的接種量，分別接種于50 mL含200 μg/mL NaNO2的MRS肉湯培養(yǎng)基中，分別于25，28，30，35，37 ℃下厭氧培養(yǎng)，并在0，4，8，12，24，36，48 h取樣，測定發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量和pH值。同時以不接種的培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3.4 NaCl濃度對植物乳桿菌P51降解亞硝酸鹽的影響

將植物乳桿菌P51活化后，用0.85%的生理鹽水制備成菌懸液。按照2%的接種量，分別接種于50 mL含200 μg/mL NaNO2的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中分別添加NaCl含量為0%、2%、4%、6%、8%、10%，于37 ℃下厭氧培養(yǎng)，并在0，4，8，12，24，36，48 h取樣，測定發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量和pH值。同時以不接種的培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3.5 亞硝酸鹽濃度對植物乳桿菌P51降解亞硝酸鹽的影響

將植物乳桿菌P51活化后，用0.85%的生理鹽水制備成菌懸液。按照2%的接種量，分別接種于50 mL含100，150，200，250，300 μg/mL NaNO2的MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃下厭氧培養(yǎng)，并在0，4，8，12，24，36，48 h取樣，測定發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量和pH值。同時以不接種的培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3.6 培養(yǎng)基初始pH值對植物乳桿菌P51降解亞硝酸鹽的影響

將植物乳桿菌P51活化后，用0.85%的生理鹽水制備成菌懸液。按照2%的接種量，分別接種于50 mL含200 μg/mL NaNO2的不同pH值的MRS肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的pH分別用乳酸調(diào)節(jié)為4，4.5，5，5.5，6，于37 ℃下厭氧培養(yǎng)，并在0，4，8，12，24，36，48 h取樣，測定發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量和pH值。同時以不接種的培養(yǎng)基作為空白對照。

1.3.7 乳酸降解亞硝酸鹽的變化

將MRS肉湯培養(yǎng)基的pH分別用乳酸調(diào)節(jié)為4，4.5，5，5.5，6，然后加入亞硝酸鈉溶液使培養(yǎng)基的NaNO2濃度為200 μg/mL，于37 ℃下培養(yǎng)，并在0，4，8，12，24，36，48 h取樣，測定培養(yǎng)液中亞硝酸鹽含量。

1.3.8 植物乳桿菌P51發(fā)酵上清液降解亞硝酸鹽的效果

將植物乳桿菌P51活化后，用0.85%的生理鹽水制備成菌懸液。將植物乳桿菌P51菌懸液加入到MRS肉湯培養(yǎng)基中，在不同時段分別取pH 4.5和pH 4的發(fā)酵液，將不同pH值的發(fā)酵液離心后過0.22 μm的濾膜，得到發(fā)酵上清液，再將亞硝酸鈉溶液分別加入到pH 4.5和pH 4的發(fā)酵上清液中使其NaNO2濃度為200 μg/mL，于37 ℃下厭氧培養(yǎng)，并在0，4，8，12，24，36，48 h取樣，測定培養(yǎng)液中亞硝酸鹽含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010處理數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析，采用Origin 8.0進行繪圖。實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，以p<0.05表示有顯著差異，具有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌P51在不同溫度下降解亞硝酸鹽的變化

圖1 不同溫度下接種植物乳桿菌P51后培養(yǎng)液pH的變化Fig.1 Changes of pH values in culture solution afterinoculation with Lactobacillus plantarumP51 at different temperatures

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間的增加，25，28，30，35，37 ℃ 5個溫度下接種植物乳桿菌P51后培養(yǎng)液的pH呈現(xiàn)先快速下降后趨于穩(wěn)定的趨勢。其中，37 ℃時培養(yǎng)液的pH下降速度最快，其次是35，30，28 ℃，25 ℃下降最慢。在8 h內(nèi)37 ℃從5.83下降到4.01， 35 ℃從5.83下降到4.05，30 ℃從5.84下降到4.55，28 ℃從5.83下降到4.59，25 ℃僅僅從5.83下降到5.43。這可能是由于植物乳桿菌P51的最適生長溫度為37 ℃，溫度越高，植物乳桿菌P51的生長情況越好，代謝情況越好，產(chǎn)酸又多又快，溫度越低越不利于植物乳桿菌P51的生長代謝，從而導(dǎo)致其產(chǎn)酸量下降，發(fā)酵液的pH變化緩慢。

圖2 不同溫度下植物乳桿菌P51降解亞硝酸鹽的變化Fig.2 Changes of nitrite degradation by Lactobacillus plantarum P51 at different temperatures

由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，不同溫度下亞硝酸鹽的降解率在不斷增加，48 h內(nèi)5個溫度下的亞硝酸鹽降解率達到99%以上。其中，接種植物乳桿菌P51在37 ℃溫度下降解亞硝酸鹽的速度最快，其次是35，30，28，25 ℃降解亞硝酸鹽的速度最慢。這與發(fā)酵液中pH變化是一致的，且當(dāng)發(fā)酵液的pH在4左右時亞硝酸鹽的降解率在急速上升，與林浩等人的研究結(jié)果一致[12]。這可能是由于溫度的變化導(dǎo)致植物乳桿菌P51產(chǎn)酸和產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶發(fā)生改變，溫度越低，亞硝酸鹽還原酶活性越低，還原的亞硝酸鹽越少，溫度越低，產(chǎn)酸量越少，發(fā)酵液的pH值越高，越不利于分解亞硝酸鹽[13]。而溫度越高越接近植物乳桿菌P51的最適生長溫度，產(chǎn)酸和酶活都會大大提高，從而更快地降解培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽。

2.2 植物乳桿菌P51在添加不同含量NaCl的培養(yǎng)基中降解亞硝酸鹽的變化

圖3 不同食鹽含量下接種植物乳桿菌P51后培養(yǎng)液中pH的變化Fig.3 Changes of pH values in culture solution afterinoculation with Lactobacillus plantarum P51under different salt content

由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，添加不同NaCl含量的培養(yǎng)液中pH值呈不斷下降趨勢，且NaCl含量越低，培養(yǎng)液中pH值下降越快。在0%～6%范圍內(nèi)，NaCl含量越低，培養(yǎng)液的pH值越低，且在4～24 h發(fā)酵液的pH值下降速率明顯高于其他時間段，48 h發(fā)酵液的pH值接近3.7。這可能是由于此時植物乳桿菌處于對數(shù)生長期，產(chǎn)酸量大使得培養(yǎng)液的pH值下降快。當(dāng)NaCl含量為8%和10%時，培養(yǎng)液的pH值在48 h內(nèi)變化緩慢，48 h發(fā)酵液的pH值分別為5.03和5.31。這可能是由于高含量的NaCl使得植物乳桿菌P51的生長受到抑制，從而導(dǎo)致培養(yǎng)液的pH值變化緩慢。

圖4 不同食鹽含量下植物乳桿菌P51降解亞硝酸鹽的變化

由圖4可知，植物乳桿菌P51在不同NaCl含量的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中亞硝酸鹽含量不斷減少。其中，低濃度的NaCl(0%～4%)對植物乳桿菌P51降解亞硝酸鹽的效果沒有很大影響，說明從泡菜中分離的植物乳桿菌P51具有一定的耐食鹽能力，具備應(yīng)用到發(fā)酵食品和腌制食品中的潛力。當(dāng)NaCl含量為6%時，該菌株降解亞硝酸鹽的效果不如低濃度，而當(dāng)NaCl含量高于8%，植物乳桿菌P51降解亞硝酸鹽的效果受到明顯抑制。這可能是由于高濃度的NaCl抑制了植物乳桿菌P51的生長繁殖，影響其生成亞硝酸鹽還原酶的量[14]。

2.3 植物乳桿菌P51在含有不同亞硝酸鹽濃度的培養(yǎng)基中降解亞硝酸鹽的變化

由圖5可知，隨著發(fā)酵時間的延長，含有不同濃度的亞硝酸鹽培養(yǎng)液中的pH值呈不斷下降趨勢，且亞硝酸鹽濃度越低，培養(yǎng)液中pH下降越快。在亞硝酸鹽濃度低于200 μg/mL時，培養(yǎng)液的pH值從最初的5.8下降到3.7左右，而當(dāng)亞硝酸鹽濃度為250 μg/mL和300 μg/mL時，培養(yǎng)液的pH值從最初的5.8分別降低至4.01和4.42。這可能是由于當(dāng)亞硝酸鹽濃度高于200 μg/mL時植物乳桿菌的生長受到抑制，產(chǎn)酸速率比較慢，從而導(dǎo)致培養(yǎng)液的pH變化緩慢。此外，在4～12 h，培養(yǎng)液的pH下降速率明顯高于其他的時間段，可能是由于植物乳桿菌P51在該時間段處于對數(shù)生長期，生長繁殖速度加快，產(chǎn)酸速率加快，導(dǎo)致培養(yǎng)液的pH迅速降低。

圖5 不同NaNO2濃度下接種植物乳桿菌P51后培養(yǎng)液pH的變化Fig.5 Changes of pH values in culture solution afterinoculation with Lactobacillus plantarum P51under different nitrite concentration

圖6 不同NaNO2濃度下植物乳桿菌P51降解亞硝酸鹽的變化Fig.6 Changes of nitrite degradation by Lactobacillus plantarum P51 under different nitrite concentration

由圖6可知，接種植物乳桿菌P51可以降低不同濃度的亞硝酸鹽，當(dāng)亞硝酸鹽濃度低于200 μg/mL時，該菌株能夠很好地降解亞硝酸鹽，最終亞硝酸鹽的降解率達到99%以上，說明植物乳桿菌P51在亞硝酸鹽濃度為200 μg/mL時降解亞硝酸鹽速率最快，當(dāng)高于該濃度時菌株的生長會受到抑制，亞硝酸鹽降解率會變低。

2.4 植物乳桿菌P51在不同初始pH值的培養(yǎng)基中降解亞硝酸鹽的變化

圖7 不同起始pH下接種植物乳桿菌P51后培養(yǎng)液pH的變化Fig.7 Changes of pH values in culture solution afterinoculation with Lactobacillus plantarum P51at different initial pH values

由圖7可知，隨著發(fā)酵時間的延長，當(dāng)培養(yǎng)基的起始pH≥4.5時發(fā)酵過程中pH值呈現(xiàn)先快速下降后趨于平緩的趨勢；當(dāng)培養(yǎng)基的起始pH為4時，發(fā)酵過程中pH值基本沒有變化。其中，在12 h內(nèi)培養(yǎng)基起始pH為6，5.5，5時發(fā)酵液的pH值變化明顯， pH為6時發(fā)酵液的pH降低速度最快，其次是pH為5.5，最慢的是pH為5，培養(yǎng)基起始pH為6時發(fā)酵液的pH值由6迅速降低至4.16，培養(yǎng)基起始pH為5.5時發(fā)酵液的pH值由5.5迅速降低至4.19，培養(yǎng)基起始pH為5時發(fā)酵液的pH值由5迅速降低至4.26，而當(dāng)培養(yǎng)基起始pH為4.5，4時發(fā)酵液的pH值基本不改變。這可能是由于該菌株最適的pH為6，培養(yǎng)基的起始pH值越低越不利于植物乳桿菌P51的生長，導(dǎo)致其不能正常產(chǎn)酸，從而導(dǎo)致發(fā)酵液的pH變化緩慢。在48 h時培養(yǎng)基起始pH為6，5.5，5，4.5時發(fā)酵液的pH值趨于3.7，而培養(yǎng)基起始pH為4時發(fā)酵液的pH值波動很小，pH值不發(fā)生變化。由圖7可知，發(fā)酵液的pH值可以降低到3.7左右，但在pH為4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)液卻沒有變化，這可能是由于高濃度的亞硝酸鹽含量和低pH值雙重影響導(dǎo)致植物乳桿菌P51在起始pH為4的培養(yǎng)基上不能生長，從而不能產(chǎn)酸，降低培養(yǎng)液的pH值。

由圖8可知，接種植物乳桿菌P51在不同起始pH的培養(yǎng)基培養(yǎng)時，發(fā)酵液中的亞硝酸鹽降解速率曲線不同，在起始pH為6，5.5時該菌株降解亞硝酸鹽的速率相當(dāng)，pH 5時該菌株降解亞硝酸鹽速率相比pH 6和pH 5.5時緩慢一些，在8～24 h之間亞硝酸鹽的降解率明顯高于其他時間段。這可能是由于在這個時間段植物乳桿菌P51處于對數(shù)生長期，其生長繁殖快，產(chǎn)酶、產(chǎn)酸量大，導(dǎo)致培養(yǎng)液中亞硝酸鹽被大量降解，使得最終的降解率接近100%。當(dāng)培養(yǎng)基起始pH為4，4.5時發(fā)酵前8 h植物乳桿菌P51的生長受到抑制，但亞硝酸鹽的降解率呈直線式增加，亞硝酸鹽的降解率分別為78.28%和53.69%，在8 h內(nèi)亞硝酸鹽的降解率高于其他時間段。這可能是由于在較低的酸性環(huán)境下，H+可以和NO2-發(fā)生歧化反應(yīng)使得亞硝酸鹽被大量分解，且pH值越低，亞硝酸鹽的降解率越高[15]。隨著亞硝酸鹽底物的減少，降解率逐漸變緩。24 h時亞硝酸鹽的降解率分別為93.57%和85.51%，48 h時亞硝酸鹽的降解率分別為98.54%和96.86%。

圖8 不同起始pH下植物乳桿菌P51降解亞硝酸鹽的變化Fig.8 Changes of nitrite degradation by Lactobacillus plantarum P51 at different initial pH values

2.5 乳酸降解亞硝酸鹽的變化

圖9 不同起始pH下未接菌的培養(yǎng)液中亞硝酸鹽的變化Fig.9 Changes of nitrite in culture solution withoutinoculating bacteria at different initial pH values

由圖9可知，隨著培養(yǎng)基起始pH值不斷降低，亞硝酸鹽的降解率在不斷增大。當(dāng)培養(yǎng)基的起始pH為4，4.5時，亞硝酸鹽的降解率隨著時間的變化非常顯著，而培養(yǎng)基的起始pH為6，5.5，5時，亞硝酸鹽的降解率隨著時間的變化不明顯。培養(yǎng)基起始pH為4，4.5時，發(fā)酵前12 h發(fā)酵液中亞硝酸鹽降解率分別達到88.28%和59.66%，最終48 h時亞硝酸鹽降解率為95.92%和93.84%。而培養(yǎng)基起始pH為6，5.5，5時，在發(fā)酵48 h亞硝酸鹽的降解率分別為16.6%、21.46%和31.44%。在不接種植物乳桿菌P51時，當(dāng)培養(yǎng)基的起始pH為4，4.5時培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽還能夠不斷被降解，最終的降解率超過90%，可以進一步印證乳酸可以和亞硝酸鹽發(fā)生歧化反應(yīng)使培養(yǎng)液中亞硝酸鹽被大量降解。而培養(yǎng)基起始pH>4.5時亞硝酸鹽的降解率不到35%，也可以進一步印證植物乳桿菌P51具有很強的降解亞硝酸鹽的能力。

2.6 植物乳桿菌P51發(fā)酵上清液降解亞硝酸鹽效果

表1 不同pH值的發(fā)酵上清液在不同時間內(nèi)降解亞硝酸鹽效果Table 1 Effect of fermented supernatant with different pHvalues on nitrite degradation at different time

注：同一行中不同的字母表示相同培養(yǎng)時間不同處理間存在顯著性差異(p<0.05)。

由表1可知，隨著培養(yǎng)時間的不斷增加，不同pH值的發(fā)酵上清液降解亞硝酸鹽的速率在上升，且pH 4.5的發(fā)酵上清液和pH 4的發(fā)酵上清液降解亞硝酸鹽的速率具有顯著性差異。說明接種植物乳桿菌P51所得的發(fā)酵液pH值越低，降解亞硝酸鹽的效果越好，再根據(jù)前面亞硝酸鹽的降解率和pH的變化可以進一步印證植物乳桿菌P51降解亞硝酸鹽主要依靠酸降解。

3 結(jié)論

從泡菜中分離得到植物乳桿菌P51，研究溫度、NaCl含量、NaNO2濃度以及培養(yǎng)基起始pH值對其降解亞硝酸鹽的影響。根據(jù)實驗結(jié)果分析可知植物乳桿菌P51能夠高效降解培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽，在培養(yǎng)溫度為37 ℃，起始pH為6時降解亞硝酸鹽效果最好，且其對食鹽和亞硝酸鹽具有較好的耐受性，其中添加4%的食鹽含量，亞硝酸鹽濃度為200 μg/mL時植物乳桿菌P51降解亞硝酸鹽效果最佳。分析植物乳桿菌P51高效降解亞硝酸鹽的原因主要是通過酸降解。

通過對泡菜中分離得到的植物乳桿菌P51的研究可以發(fā)現(xiàn)其具有良好的應(yīng)用價值，將其應(yīng)用到泡菜和發(fā)酵肉制品中可以大大提高這些產(chǎn)品的安全性。同時本結(jié)果也為深入研究乳酸菌降解亞硝酸鹽機理提供了參考依據(jù)。最后，該研究可以為家庭制作泡菜中亞硝酸鹽含量安全問題提供一條便捷的解決途徑，即在泡菜中添加醋也可以很好地降解泡菜中亞硝酸鹽，可以讓人們吃上放心、安全的泡菜食品。