丁霄霄，李鳳偉，商曰玲，王篤軍，王杰，卜雯麗，余曉紅，*

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.鹽城工學院海洋與生物工程學院，江蘇鹽城224051）

靈芝（Ganoderma Lucidum），又名赤芝、紅芝、丹芝、瑞草等，是擔子菌綱、多孔菌科、靈芝屬（Ganoderma）真菌，常用其子實體，是一種藥用真菌[1]。靈芝在我國有上千年的藥用歷史，富含靈芝多糖、三萜、甾醇、蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素、礦質元素等多種生物活性物質和營養(yǎng)物質。其中，靈芝多糖是靈芝的主要活性成分之一，具有抗氧化、清除自由基、刺激胰島素分泌以促進葡萄糖在外周組織的利用來降低血糖[2]、抗疲勞、促進核酸和蛋白質的合成[3]等多種藥理活性，可通過清除自由基、抑制脂質過氧化損傷和增強抗氧化酶的活性對機體起到保護作用；另外，體內(nèi)自由基過多是誘發(fā)炎癥、衰老以及腫瘤等疾病的主要因素，因此多糖在抑制腫瘤、免疫調節(jié)[4]和消炎[5]等方面也有極其重要的作用；而近些年來有關靈芝多糖對腸道微生物的影響的報道逐漸增多[6]。靈芝子實體主要由纖維素、半纖維素和木質素3 種成分構成，三者可形成木素結合層，纖維素自身也可形成束狀結晶區(qū)域，致使靈芝子實體具有較好的維持力和緊密的結構，而靈芝子實體多糖存在于子實體緊密的細胞壁內(nèi)，導致靈芝多糖不容易被提取出來[7-8]。采用酶法提取靈芝多糖，條件溫和，能使幾丁質、半纖維素等與靈芝多糖分離，不會破壞多糖的結構有利于獲得生物活性多糖，從而提高多糖的提取率，同時可以大規(guī)模用于工業(yè)化生產(chǎn)[9-10]。但與其他傳統(tǒng)方法相比，采用復合酶法提取靈芝多糖的研究起步相對較晚，研究報道相對較少，為此，本研究在正交試驗確定復合酶比例的基礎上，利用響應面法對復合酶法提取靈芝多糖的提取條件進行了優(yōu)化，以期獲得較高的多糖提取率的提取工藝，為靈芝多糖的深入研究和進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝子實體：江蘇德芝林生態(tài)農(nóng)業(yè)有限責任公司。

纖維素酶（20 000 U/g）：鄭州萬博化工產(chǎn)品有限公司；半纖維素酶（20 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（＞2 000 U/mg）：生工生物工程（上海）股份有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀：上?；瘜W試劑有限公司；葡萄糖（分析純）、苯酚（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純）、硫酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV752N 紫外可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；PB-20 型pH 計：德國賽多利斯公司；FA1104電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；DNP 電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海金宏實驗設備有限公司；SHZ-D循環(huán)水真空泵、RE52CS 旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋、SK-1 型快速混勻器：江蘇省金壇市瑞爾電器有限公司；85-2 型恒溫磁力攪拌器：金壇市城東新瑞儀器廠；FD-1A-50 型冷凍干燥機：北京博醫(yī)康有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復合酶法提取靈芝多糖

靈芝子實體預處理：洗凈后干燥至恒重，粉碎，過20 目篩，用石油醚80 ℃于循環(huán)裝置中水浴熱處理2 d～3 d，除去脂類；干燥至恒重，密封保存待用。

稱取靈芝子實體樣品1.00 g 置于100 mL 燒杯中，各分別稱取一定質量分數(shù)的纖維素酶、木瓜蛋白酶和半纖維素酶（相對底物濃度）[11]加入pH 值為5.70 的磷酸鹽緩沖溶液配置成酶解液，按照1 ∶30（g/mL）的料液比加入酶解液，于40 ℃恒溫水浴中酶解100 min。酶解結束后90 ℃熱水中滅酶10 min，趁熱減壓抽濾后，將所得濾液濃縮至原體積的1/5，緩緩加入4 倍體積的無水乙醇，4 ℃下醇沉過夜。離心取沉淀，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌之后，用蒸餾水溶解，定容至100 mL 容量瓶，測定糖含量，計算多糖提取率。

1.3.2 糖含量的測定

采用苯酚硫酸法，以葡萄糖為對照品，參照文獻[12]并加以改進制作標準曲線。以葡萄糖含量c 為橫坐標（μg），吸光度A 為縱坐標繪制標準曲線，得線性方程A=0.006 7c+0.000 5，相關系數(shù)R2=0.999 2。取1 mL多糖溶液，同法顯色后測吸光度A，代入方程即可進一步計算出靈芝多糖提取率。

1.3.3 復合酶法提取靈芝多糖工藝條件確定

1.3.3.1 各單酶最佳添加量確定

分別以纖維素酶、半纖維素酶和木瓜蛋白酶的添加量為自變量，保持酶解條件不變，按照1.3.1 的試驗步驟進行試驗，并分別記錄相應吸光度，計算出靈芝多糖提取率，進而分析各單酶添加量對其影響，得各最佳添加量。

1.3.3.2 復合酶配比確定

根據(jù)上述1.3.3.1 試驗結果，按照表1 進行三因素三水平正交試驗，以復合酶配比為自變量，保持酶解條件不變，按照1.3.1 的試驗步驟進行試驗，以靈芝多糖提取率為指標，分析確定最佳復合酶配比。

表1 復合酶法提取靈芝多糖的正交試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design for extraction of Ganoderma lucidum polysaccharide by complex enzymatic method

1.3.3.3 響應面法優(yōu)化復合酶法提取條件的確定

分別以其中一個提取條件的因素水平為自變量，保持上述所得最佳酶配比以及其他條件不變，按照1.3.1 步驟進行試驗并記錄相關數(shù)據(jù)。如研究不同酶解時間對靈芝多糖提取率影響時，僅改變時間40、60、80、100、120 min，保持酶配比、酶解溫度和 pH 值不變；研究不同溫度對提取率影響時，僅改變溫度35、40、45、50、55 ℃時，保持酶配比、時間和 pH 值不變；研究不同pH 值對提取率影響時，僅改變pH 值4.30、4.65、5.00、5.35、5.70、6.05，保持酶配比、酶解溫度和時間不變。

通過提取條件的單因素試驗結果，分別得各最佳水平；在此基礎之上，以酶解時間（A）、酶解溫度（B）、酶解pH 值（C）為自變量，依據(jù)Box-Behnken 試驗設計的原理，以靈芝多糖的提取率為響應值，按照表2 三因素三水平的試驗設計[13-14]及1.3.1 的試驗方法進行對提取靈芝多糖條件的優(yōu)化。

表2 三因素三水平的Box-Behnken 試驗設計Table 2 Three-level three-factors of experimental Box-Behnken Design

1.4 數(shù)據(jù)處理

按照表1 和表2 的試驗設計進行試驗，計算得到一系列的靈芝多糖提取率數(shù)據(jù)，分別采用軟件正交試驗設計助手和Design-Expert version 8.0 軟件對其做進行進一步處理分析后，分別得出最佳酶配比和提取工藝條件。

2 結果與分析

2.1 復合酶添加量配比優(yōu)化

2.1.1 各單酶添加量對靈芝多糖提取效果的影響

纖維素酶、半纖維素酶和木瓜蛋白酶添加量對靈芝多糖提取效果的影響見圖1。

由圖1 可知，不同種類以及不同添加量的酶對靈芝多糖提取率有明顯的影響，原因在于靈芝子實體主要由纖維素、半纖維素和木質素3 種成分構成的木素結合層，子實體多糖存在于緊密的細胞壁內(nèi)，而不同種類及添加量的酶能使幾丁質、半纖維素等與靈芝多糖分離，有利于多糖的溶出，增加了多糖在溶劑中的溶解度。其中纖維素酶添加量達到3.0%時的多糖含量最高，提取率達到了2.94%，當添加量大于3.0%時提取率反而降低；而半纖維素酶添加量在1.0%～4.5%的范圍內(nèi)，多糖得率隨著添加量的升高而增加，此后繼續(xù)增加后多糖得率得變化趨勢較平緩，最高提取率為2.34%；木瓜蛋白酶在添加量為2.5%時提取率達到最高1.66%，之后添加量大于2.5%時得率反而降低。因此3 種酶的最佳添加量為纖維素酶添加量3.0%，半纖維素酶添加量4.0%，木瓜蛋白酶添加量2.5%。

2.1.2 復合酶添加量配比的正交試驗結果

復合酶添加量配比對靈芝多糖提取效果的影響見表3、表4。

表3 酶配比L9（34）正交試驗結果Table 3 Enzyme ratio L9（34）orthogonal experimental results

由表3 極差分析結果可知，極差RA（0.52）＞RC（0.13）＞RB（0.10），因此改變纖維素酶添加量對靈芝多糖提取率影響最大。以K 值最佳選擇最優(yōu)方案為A3B2C3，即提取靈芝粗多糖的最佳復合酶的比例為：纖維素酶3.5%、半纖維素酶4.0%、木瓜蛋白酶3.0%，在此最佳復合酶比例下進行驗證試驗，測得靈芝多糖提取率為3.32%，達到最高；而由表4 方差分析表可知，與另外兩種酶相比，纖維素酶添加量對靈芝多糖提取率的影響最為顯著，其他兩個因素對提取率的影響均不顯著。

表4 正交試驗結果方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.2 響應面優(yōu)化復合酶法提取條件

2.2.1 提取條件單因素試驗結果

2.2.1.1 酶解時間對靈芝多糖提取率的影響

按照正交試驗結果選用最佳復合酶的比例，參照張?zhí)煨Φ萚15]的試驗并加以改進，保持酶解溫度40 ℃、pH 5.70 不變，改變酶解時間，按照1.3.1 的方法進行試驗，分析結果得出時間對靈芝多糖提取效果的影響見圖2。

圖2 酶解時間對靈芝多糖提取率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

圖2 表明，隨著酶解時間的延長，多糖提取率在酶解時間為80 min 時靈芝多糖提取率達到最大提取率3.55%，此后呈下降的趨勢。原因可能是由于用于酶解時間過長導致靈芝多糖結構發(fā)生變化，致使提取率降低。因此選擇80 min 為試驗最佳酶解時間。

2.2.1.2 酶解溫度對靈芝多糖提取率的影響

按照上述的試驗結果選用最佳復合酶的比例以及上述酶解時間單因素試驗結果，參照翟為等[16]的試驗并加以改進，保持酶解時間80 min、pH 5.70 不變，改變酶解溫度，按照1.3.1 的方法進行試驗，分析結果得溫度對靈芝多糖提取效果的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對靈芝多糖提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

圖3 表明，隨著酶解溫度的升高，靈芝粗多糖的提取率逐漸增大，當溫度為50 ℃時，復合酶分解靈芝細胞壁效果最佳，大量的多糖類物質迅速地釋放出來，此時靈芝多糖提取率達到最大值3.57%；當溫度超過50 ℃時，多糖提取率逐漸下降。原因可能是由于溫度過高降低了復合酶的活性，酶解細胞壁效果降低，使多糖提取率下降。試驗結果與梁姍等運用復合酶提取胭脂蘿卜花青素的結果一致[17]，且其中纖維素酶的最適溫度為50 ℃左右，因此復合酶采用50 ℃也是較適宜的。

2.2.1.3 酶解pH 值對靈芝多糖提取率的影響

按照上述單因素試驗結果，參照劉曉艷等[18]的試驗并加以改進，保持酶解時間80 min、溫度時間50 ℃不變，改變酶解pH 值，分析結果得pH 值對靈芝多糖提取效果的影響見圖4。

圖4 pH 值對靈芝多糖提取率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis pH on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

由圖4 可知，靈芝多糖提取率隨pH 值升高呈顯著上升趨勢；在pH 值為5.35 時，靈芝多糖提取率最大，達到3.67%；而pH 值超過5.35，靈芝多糖提取率逐漸降低。這說明復合酶體系的pH 值為5.35 左右，在這一特定的pH 值，酶的的空間結構較為穩(wěn)固，從而對酶的構象和酶活的相應變化影響較小[18]；低于或高于5.35 時，酶的空間結構會遭到不同程度的破壞，從而引起酶構象和酶活的相應變化，導致酶活性下降，影響酶與底物的結合，導致多糖提取率下降，也可能是某些酶反應不充分，提取率不高[19]。所以最佳pH 值確定為5.35。

2.2.2 響應面法試驗設計及結果

2.2.2.1 響應面法優(yōu)化試驗結果

基于單因素試驗結果，選取酶解時間（A）、溫度（B）、pH 值（C）進行響應面分析，結果見表5。

表5 響應面試驗設計及結果Table 5 Experimental design and results for response surface methodology

以靈芝多糖提取率為響應值（Y），使用軟件Design-Expert versi 進行多元回歸擬合，計算回歸系數(shù)，可以得到靈芝多糖提取率對酶解時間（A）、酶解溫度（B）和酶解pH 值（C）的多項回歸方程：Y=3.574＋0.089×A+0.00125×B+0.22×C－0.22×AB－0.063×AC－0.0075×BC－0.31×A2－0.15×B2－0.017×C2。

2.2.2.2 模型顯著性檢驗

模型顯著性檢驗見表6。

從表6 的模型方差分析中可以看出，本試驗的回歸方程模型P＜0.05，表明模型具有顯著性，說明該回歸模擬合理，可以很好地解釋響應值；失擬項不顯著（P=0.528 7＞0.05），說明該模型對復合酶法提取靈芝多糖工藝的分析和預測是可靠的。模型的一次項C 即酶解pH 值的影響顯著，A、B 的影響不顯著；二次項中酶解時間的影響顯著，酶解pH 值、酶解溫度的影響不顯著；交互項中酶解時間和酶解溫度的影響顯著，酶解時間和酶解pH 值的影響不顯著，酶解pH 值和酶解溫度影響不顯著。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Analysis of variance of the regression model

圖5～圖7 是根據(jù)多元回歸程所得到的不同因素之間的交互作用對靈芝多糖提取率影響的響應面圖及等高圖。從3D 響應面可以直觀地看出各變量之間的相互作用關系，而根據(jù)2D 等高線圖是圓形或者橢圓形則可以看出各變量之間的顯著水平[18]。通過3D 圖可知，3 個因素的相互作用對靈芝多糖提取率的影響都是先隨著數(shù)值的增加，響應值緩慢增大，當響應值達到極值后，隨著因素的繼續(xù)增加，響應值逐漸減?。挥蓤D5 中的2D 等高線圖是橢圓形圖可知，酶解溫度和酶解時間兩個因素交互作用顯著，結果與表6 回歸模型方差表中的AB 兩因素分析結果顯著一致。

根據(jù)Box-Behnken 試驗所得到的數(shù)據(jù)結果和回歸方程，利用Design Expert8.0 軟件進行分析靈芝多糖最佳提取工藝，得到回歸方程的最大值點是：酶解時間為81.33 min，酶解溫度為49.67 ℃，酶解pH 值為5.70，考慮到實際操作性將工藝參數(shù)修正為：酶解時間為 81 min、溫度為 50 ℃、pH 值為 5.70，模型預測的靈芝多糖提取率最高為3.78%。為了驗證其可行性，在此條件下進行3 組驗證性試驗，靈芝多糖提取率為3.73%，與模型預測值相差0.05%，說明響應面法得到的靈芝多糖提取工藝條件真實可靠。

圖5 酶解時間和酶解溫度交互作用對靈芝多糖提取率影響的響應面及等高線圖Fig.5 Enzymolysis temperature and enzymolysis time as well as their interaction on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

圖6 酶解pH 值和酶解時間交互作用對靈芝多糖提取率影響的響應面及等高線圖Fig.6 Enzymolysis time and pH as well as their interaction on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

圖7 酶解pH 值和酶解溫度交互作用對靈芝多糖提取率影響的響應面及等高線圖Fig.7 Enzymolysis temperature and pH as well as their interaction on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

3 結論

本研究結果發(fā)現(xiàn)，復合酶法提取靈芝多糖優(yōu)于單酶提取，復合酶用量最佳配比為纖維素酶3.5 %、半纖維素酶4.0 %和木瓜蛋白酶3.0 %；然后采用響應面法分析得最佳提取條件：酶解時間為81 min、溫度為50 ℃、pH 值為5.70，驗證得靈芝多糖的最大提取率為3.73%。本研究結果為較高的粗多糖得率提取工藝提供了理論依據(jù)。