梁杰，鄧波，劉濤，汪秀妹，趙曉旭，汪少蕓

（1.莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點實驗室，福建莆田351100；2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州350108）

紫菜是重要的海洋經(jīng)濟海藻，品種豐富，主要以壇紫菜、條斑紫菜最為常見[1]。早在二十世紀(jì)中葉，我國長江以南就實現(xiàn)了壇紫菜的人工養(yǎng)殖[2]。壇紫菜是福建特有的栽培品種，以營養(yǎng)豐富、滋味鮮美著稱，富含蛋白質(zhì)、多酚、多糖、礦物元素等，素有“營養(yǎng)寶庫”的美稱[3]。壇紫菜可多次收割，4 次收割以后的殘次紫菜俗稱為末水紫菜，末水壇紫菜由于口感、色澤較差，常被作為農(nóng)產(chǎn)品下腳料隨意丟棄甚至腐爛在海水中，造成極大的資源浪費和環(huán)境污染[4-5]。據(jù)報道，2016 年福建省紫菜年產(chǎn)量已達到6.6 萬噸[6]，末水紫菜可占10%以上，雖然末水壇紫菜食用價值低，但仍然還有豐富的營養(yǎng)成分和藥用價值，如何從廢棄壇紫菜中提取有效成分以提升其經(jīng)濟附加值具有重要的經(jīng)濟意義[7-9]。

自由基（free radical）是化合物分子受到外界環(huán)境如光、熱、輻射等作用導(dǎo)致共價鍵發(fā)生均裂而形成的具有不成對電子的原子或基團，是需氧型動物機體內(nèi)正常生理代謝產(chǎn)生的如 O2-、OH-、NO 等基團[10]，機體內(nèi)處于動態(tài)平衡的自由基對人體有益，它們在幫助傳遞維持生命活力的能量的同時被用來殺滅細菌和寄生蟲，承擔(dān)重要的生物學(xué)功能。當(dāng)機體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除無法平衡時，自由基就會攻擊生物體細胞組織造成損傷，對核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、酶、生物膜及機體循環(huán)和免疫系統(tǒng)進行破壞，干擾體內(nèi)新陳代謝，以致產(chǎn)生更多自由基，惡性循環(huán)，導(dǎo)致衰老、炎癥和各種疾病，如老年癡呆、癌癥等[11]，甚至造成死亡。

本文以末水壇紫菜為原料，以DPPH 自由基清除率和抗氧化肽得率為指標(biāo)對其進行酶解，篩選最適的酶制劑。以抗氧化能力和得率為指標(biāo)，借助超聲波技術(shù)輔助提取，通過單因素和響應(yīng)面試驗確定最佳酶解工藝，得到具有較強抗氧化能力的水解肽并對其性質(zhì)進行分析，包括氨基酸含量和分子量分布組成，以期為末水壇紫菜高值化利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗原料

壇紫菜：福建莆田沃爾瑪超市。

1.1.2 試驗試劑

酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶：南京都萊生物技術(shù)有限公司；其它化學(xué)試劑均為分析純。試驗過程使用均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-10N 型冷凍干燥機：寧波新芝生物科技股份公司；UV2550 紫外/可見分光光度計：日本島津公司；DGG-9053A 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；FW-100 高速萬能粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；BCD-208K/A 型冰箱：中國海爾集團；MDFU333 型超低溫冰箱：日本三洋電機株式會社；STARTER-2100 型精密數(shù)顯酸度計：奧豪斯儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫菜活性肽制備方法

1.3.1.1 酶解工藝

干壇紫菜→剪碎用粉碎機打至細粉狀→加水?dāng)嚢柚镣耆芙狻罴衙附鈼l件，充分酶解→100 ℃下滅酶10 min→靜置冷卻后10 000 r/min 速率離心分離10 min，取上清液→酶解液，凍干備用

1.3.1.2 篩選最適酶制劑

選用5 種對壇紫菜酶解效率較高的酶制劑，以DPPH 自由基清除率和抗氧化肽得率為參考評價酶解效果，篩選最適蛋白酶。各酶的最適條件見表1。

表1 蛋白酶最適pH 值和溫度Table 1 Suitable hydrolysis pH value and temperature for proteases

反應(yīng)初始條件為：取0.25 g 紫菜粉末加入50 mL 的蒸餾水，分別在最適酶解條件水解紫菜粉末，酶用量為10 000 U/g，反應(yīng)10 h 后，滅酶活，酶解液凍干，測定。

以多肽的得率和酶解產(chǎn)物DPPH 自由基清除率為指標(biāo)，選擇最佳酶作為后續(xù)試驗的工具酶。

1.3.2 DPPH 自由基清除率的測定

參照文獻[12]的方法并加以改進測定DPPH 自由基清除率。將濃度為0.002 g/mL 的2 mL 樣品溶液加入試管中，在試管中加入濃度為0.004 g/L 的2 mL DPPH·無水乙醇溶液，放置在黑暗環(huán)境下反應(yīng)30 min，取出來后在517 nm 的波長下測定吸光度，記為Ai；再取濃度為0.002 g/mL 的2 mL 樣品溶液與2 mL 無水乙醇溶液混合，操作同上，其吸光度記為Aj；再取2 mL無水乙醇溶液與濃度為0.004 g/L 的2 mL DPPH·無水乙醇溶液混合，操作同上，吸光度記為Ao；重復(fù)3 次。酶解產(chǎn)物的DPPH 自由基清除計算公式如下：

1.3.3 紫菜多肽得率的計算

準(zhǔn)確稱量酶解反應(yīng)前的紫菜樣品粉末重量，記為Ae；酶解上清液冷凍干燥，準(zhǔn)確稱量品重量并記錄，記為At，計算多肽得率的公式為：

1.3.4 單因素試驗

參考文獻[13]并在前期預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，以多肽得率和DPPH 自由基清除率為指標(biāo)，設(shè)置初始條件為：pH7.0、底物濃度5%、溫度50 ℃、酶用量10 000 U/g，分別考察酶解溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、酶解時間（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h）、酶用量（5 000、10 000、15 000、20 000、25 000、30 000 U/g）、底物濃度（3 %、4 %、5%、6%、7%、8%）等條件對酶解效果的影響，確定各因素的適宜水平范圍。

1.3.5 響應(yīng)面試驗

通過分析單因素試驗結(jié)果，選取了酶解溫度（A）、酶解時間（B）、酶用量（C）和底物濃度（D）這 4 種因素進行Box-Behnken 試驗設(shè)計。以上述4 個因素為自變量，以酶解得到抗氧化肽的DPPH 自由基清除率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗因素與水平設(shè)計見表2。

表2 Box-Behnken 因素水平設(shè)計表Table 2 Factors and levels of the Box-Behnken experimental dsign

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用Excel2013，Design Expert8.05 軟件繪圖，每組試驗重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳酶制劑篩選

選擇酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、纖維素酶、胰蛋白酶對紫菜進行酶解，反應(yīng)初始條件設(shè)置為：底物濃度5%、酶用量10 000 U/g，酶解條件如表1所示為各蛋白酶的最適條件。以酶解產(chǎn)物的DPPH 自由基清除率和多肽得率為指標(biāo)篩選酶解壇紫菜的最佳工具酶，結(jié)果如圖1 所示。

當(dāng)各種蛋白酶分別處于各自最適溫度、pH 值，且底物濃度和加酶量一致的條件下，各種蛋白酶對紫菜蛋白的酶切位點和酶解產(chǎn)物性質(zhì)并不相同，酶解效果具有顯著的差異性[14]，各種酶解產(chǎn)物抗氧化能力強弱依次為：中性蛋白酶＞堿性蛋白酶＞酸性蛋白酶＞胰蛋白酶＞纖維素酶，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物DPPH 自由基清除能力最強為（43.25±0.14）%。雖然纖維素酶酶解產(chǎn)物多肽得率最高（70.42±0.12）%，但酶解產(chǎn)物對DPPH 自由基清除率較低，不適合作為后續(xù)研究的工具酶。中性蛋白酶是一種非特異性內(nèi)切酶，對海洋生物的酶解效率高，酶解切割肽段小，酶解最徹底。綜上所述，選擇中性蛋白酶為最適工具酶進行后續(xù)酶解工藝的研究，這與王小慧等對壇紫菜篩選最佳蛋白酶的研究結(jié)果一致[9，15-17]。

圖1 最佳工具酶的確定Fig.1 Fix the most suitable protease

2.2 單因素試驗結(jié)果

各因素對酶解效果的影響見圖2。

圖2 各因素對酶解效果的影響Fig.2 Effects of different factors on eymohydrolysis

2.2.1 酶解溫度的確定

由圖2A 可知，酶解產(chǎn)物的DPPH 自由基清除率隨著溫度的升高先增大后降低，當(dāng)酶解溫度為40 ℃時，DPPH 自由基清除率和多肽得率到達最大值（65.06±0.32）%、（68.02±0.58）%，由于高溫會使蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，造成酶活降力降低，影響酶促反應(yīng)的進行，酶解產(chǎn)物的活性成分降低[18]，選擇40 ℃為最佳酶解溫度。

2.2.2 酶解時間的確定

由圖2B 可知，多肽得率隨著時間的增大呈上升趨勢，酶解時間為4 h 時產(chǎn)物的DPPH 自由基清除能力最強為（72.67±0.27）%，此時繼續(xù)延長酶解時間產(chǎn)物的抗氧化能力開始下降，酶解12 h 多肽得率最高。綜合考慮時間成本和經(jīng)濟成本的實際情況，選擇最佳酶解時間為4 h。

2.2.3 酶用量的確定

由圖2C 可知，在一定范圍內(nèi)多肽得率隨酶用量的增加而增加，當(dāng)酶用量達到30 000 U/g 時，多肽的得率達到最大值（80.84±0.45）%。隨著加酶量的增加，增加了中性蛋白酶與紫菜蛋白的有效結(jié)合，提高了酶解效率，當(dāng)加酶量過飽和時，酶解進程減緩[19]。DPPH 自由基清除率在酶用量達到20 000 U/g 時達到最高值（74.44±0.32）%。綜合考慮，選擇酶用量 20 000 U/g 為最佳水平。

2.2.4 底物濃度的確定

由圖2D 可知，隨著底物濃度提高多肽得率和DPPH 自由基清除率都相應(yīng)提高，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時，清除率到達最高值（68.55±0.64）%，此時多肽得率為（59.20±0.31）%已接近最大值，此后底物濃度繼續(xù)提高酶解產(chǎn)物的自由基清除率反而下降，這是由于底物濃度太高導(dǎo)致酶促反應(yīng)體系過于黏稠，不利于酶的與底物有效結(jié)合，影響蛋白酶活力的釋放[20]。綜上所述，選擇底物濃度4%為最佳水平。

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 響應(yīng)面結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取了酶解溫度（A）、酶解時間（B）、酶用量（C）和底物濃度（D）這 4 個對酶解法關(guān)鍵的工藝參數(shù)為自變量，以酶解得到抗氧化肽的DPPH 自由基清除率（Y）為響應(yīng)值，進行Box-Behnken試驗設(shè)計。試驗結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 3 Results of response surface

2.3.2 響應(yīng)面方差分析

運用Design Expert8.06 軟件對數(shù)據(jù)分析并進行多元回歸擬合，得到的方程為Y=85.4+0.33A-0.03B-0.51C-9.51D+1.36AB+1.29AC-2.61AD+2.09BC+2.22BD+8.3CD-1.17A2-6.79B2-5.7C2-6.88D2。方差分析見表4。

表4 方差分析表Table 4 Results of variance analysis

回歸方程的模型P＜0.000 1，F(xiàn)=24.46，說明模型差異性顯著，失擬項的誤差值P 為0.266 7＞0.05，失擬不顯著，回歸方程的擬合度高，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.960 3，調(diào)整系數(shù)R2adj=0.920 6，該模型可以解釋92.06%的響應(yīng)值變化，該模型的DPPH 自由基清除率的實測值和預(yù)測值良好，可用來分析和預(yù)測酶解法制備壇紫菜抗氧化肽的DPPH 自由基清除率。

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析

響應(yīng)曲面坡度陡峭和等高線呈橢圓形表明兩因素交互作用影響顯著，若曲面坡度平緩且等高線呈圓形則表示酶解條件發(fā)生變化時對響應(yīng)值變化影響不顯著[21]。各因素之間的交互作用如圖3 所示，響應(yīng)曲面陡峭，等高線呈橢圓形，表明酶用量與底物濃度之間的交互作用影響顯著。

2.3.4 最佳酶解條件的確定和驗證

采用DesignExpert8.05 分析，最佳酶解條件為：酶解時間3.59 h、酶解溫度47.33 ℃、加酶量16 362.13 U/g、底物濃度3.0%、pH7.0 時，DPPH 自由基清除率可以達到92.61%，結(jié)合實際試驗條件設(shè)定酶解工藝參數(shù)：酶解時間3.6 h、酶解溫度47 ℃、酶用量16 362 U/g、底物濃度3.0%、pH7.0。在該工藝下做3 組平行試驗，測得壇紫菜抗氧化肽的DPPH 自由基清除率達到（91.83±0.80）%，與預(yù)測值相差0.84 %。表明該響應(yīng)面模型可靠。

圖3 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plots showing the effects of various factors

3 結(jié)論

結(jié)果表明中性蛋白酶為末水壇紫菜最佳水解酶制劑。采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化其最佳酶解條件為：酶解溫度47 ℃、酶解時間3.6 h、酶用量16 362 U/g、底物濃度3.0%、pH7.0。此條件下酶解末水壇紫菜制備的抗氧化肽DPPH 自由基清除率高達（91.83±0.81）%，較未優(yōu)化前的DPPH 自由基清除率提高52.90%，表明該優(yōu)化模型可靠，末水壇紫菜水解肽具有良好的抗氧化能力[22]。本研究為末水壇紫菜高值化利用提供了理論依據(jù)和試驗基礎(chǔ)，具有廣闊的經(jīng)濟效益和良好的環(huán)境效益。