高 豹 呂 恒 周東明 胡 丹 韓一芳 蔡旭燊 陸云軍 盧一辰 張錦海** 熊曉輝 操 敏,**

(1. 南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院; 江蘇南京 211816；2. 東部戰(zhàn)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江蘇南京 210002)

恙蟲病(tsutsugamushi disease)是由恙蟲病東方體Orientiatsutsugamushi人群引起的自然疫源性疾病，在我國(guó)流行歷史悠久。近年來(lái)隨著砍伐森林、興修水利、筑路、旅游、駐訓(xùn)等野外作業(yè)行為的增多，人群與自然疫源地的接觸越來(lái)越密切，從而導(dǎo)致病例不斷增多，恙蟲病已成為我國(guó)不容忽視的公共衛(wèi)生問(wèn)題(Luetal., 2010; 操敏等，2011)。迄今為止，我國(guó)已有22個(gè)省區(qū)報(bào)道該病的流行。由于該病的臨床癥狀與許多發(fā)熱性疾病的臨床癥狀相似，易引起誤診，因此，恙蟲病的早期診斷尤為重要。

恙蟲病東方體56 kDa是主要的外膜蛋白之一，已證實(shí)為良好的診斷抗原(Stoveretal., 1990)。我國(guó)恙蟲病疫區(qū)分布廣泛，不同疫區(qū)可能存在多種不同型別的東方體，且存在異型抗原抗體不發(fā)生結(jié)合反應(yīng)或反應(yīng)弱的現(xiàn)象(Kellyetal., 2009; Parketal., 2010)，因此制備多種型別的恙蟲病東方體抗原，以多種抗原混合作為診斷抗原，有利于提高診斷方法的敏感性，擴(kuò)大檢測(cè)譜。本研究選用我國(guó)東方體新型分離株SJ2株(Caoetal., 2016)為靶抗原，克隆表達(dá)了該株56 kDa 截短蛋白基因片段。重組蛋白通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行鑒定，活性通過(guò)蛋白印跡法進(jìn)行分析，為進(jìn)一步建立診斷方法提供備選診斷抗原。

1 材料與方法

1.1 毒株

在L929細(xì)胞中傳代保存的恙蟲病東方體SJ2株，來(lái)源于安徽省三界地區(qū)黑線姬鼠體表臨淮崗纖恙螨感染小白鼠獲得的恙蟲病東方體分離株。

1.2 試劑

引物由南京賽百勝生物公司合成；ExTaq、dNTP、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ均購(gòu)自大連寶生物工程公司，DNA Marker和蛋白Marker購(gòu)自Fermentas公司，PCR割膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司，IPTG購(gòu)自南京生興生物公司，PCR試劑盒購(gòu)自TAKARA公司，Ni-NTA Agarose、DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司，質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 DNA提取與目的片段PCR擴(kuò)增

采用DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒從感染恙蟲病東方體SJ2株的L929細(xì)胞中提取DNA。引物序列：上游引物 5′-G G G G A T C C C T T A A T A G T G C A T C T G T C G AA-3′；下游引物：5′-C G C G A A T T C C T A GA A G T T A T A G C G T AC-3′引物由生工生物(上海)股份有限公司提供。以提取的恙蟲病東方體DNA為模板，采用50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行目的片段PCR擴(kuò)增 ：10×Taq 0.5 μL，buffer 12.5 μL；上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，補(bǔ)加ddH2O至50 μL。采用以下步驟進(jìn)行PCR循環(huán)：預(yù)變性：95°C 5 min，然后94℃ 40 s，50℃ 60 s，72℃ 60 s，共36個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.4 序列測(cè)定及分析

擴(kuò)增目的基因片段送至英俊公司測(cè)序。序列采用軟件Bioedit與我國(guó)主要東方體流行株56 kDa蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析。

1.5 重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

PCR產(chǎn)物和pET-28a用BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，用Promega公司的PCR割膠回收試劑盒對(duì)目的DNA進(jìn)行回收，定量后用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取卡那霉素LB固體培養(yǎng)基平板上的菌落，放入含有卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，PCR 擴(kuò)增條件同1.3。

1.6 重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)

使用質(zhì)粒小提試劑盒提取鑒定后的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，通過(guò)熱激法將陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21中。挑取單菌落于LB培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；將菌液按1∶100接種于含有卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)4 h后，加IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4.5 h；取1.5 mL菌液離心后，加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液，置沸水浴中10 min。取制備好的樣本10 μL進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分析。

1.7 重組蛋白的純化

大量誘導(dǎo)表達(dá)目標(biāo)菌液，離心收集沉淀，用8 mol/L尿素裂解沉淀，離心取上清液過(guò)QIAGEN Ni-NTA Agarose，用5倍柱體積洗滌液清洗鎳柱2～3次，最后用洗脫液洗脫鎳柱上的蛋白。取10 μL純化后樣本進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析。

1.8 免疫印跡分析

將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，恒流120 mA轉(zhuǎn)移90 min。封閉液選用5%的脫脂奶粉，室溫封閉60 min。一抗選用3份病人血清混合為1份作為陽(yáng)性血清，3份正常人血清混合為1份作為正常人對(duì)照血清，病人血清和正常人血清各一份按照1∶3000進(jìn)行稀釋，室溫孵育2 h；二抗選用HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG按照1∶4000進(jìn)行稀釋，室溫孵育2 h，最后加入染色劑避光反應(yīng)5～10 min。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的PCR鑒定

成功從樣本DNA中擴(kuò)增出約708 bp的特異性抗原基因(圖1)。

圖1 目的基因片段PCR擴(kuò)增

2.2 基因測(cè)序及序列比對(duì)分析

將擴(kuò)增的基因片段送至英俊公司測(cè)序，序列遞交GenBank 獲得序列號(hào)為KM115577.1。用Bioedit軟件推導(dǎo)成氨基酸序列并進(jìn)行序列比對(duì)分析(圖2)。

圖2 東方體SJ2株56 kDa截短蛋白(sj-short)與國(guó)內(nèi)主要流行株序列比對(duì)圖

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒PCR鑒定及雙酶切鑒定

將PCR產(chǎn)物與pET-28a連接，轉(zhuǎn)入已制備好的DH5α感受態(tài)中。從轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定。凝膠電泳結(jié)果顯示，在1～3號(hào)樣品PCR鑒定泳道均出現(xiàn)一條大小約708 bp的特異條帶，與預(yù)期大小一致。(圖略)。進(jìn)一步用BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。凝膠電泳結(jié)果顯示(圖3)，在鑒定泳道5.6 kb和708 bp處分別出現(xiàn)特異條帶，與預(yù)期大小一致，表明成功地構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒。

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.4 重組蛋白的表達(dá)和純化

對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析，蛋白凝膠電泳圖顯示，在約為27 kDa處出現(xiàn)一條明顯的表達(dá)條帶，同預(yù)期的目標(biāo)蛋白的大小一致，表明56 kDa蛋白基因在原核系統(tǒng)內(nèi)得到了融合表達(dá)。收集從鎳柱上洗脫的重組蛋白，每管取10 μL樣本進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果顯示重組蛋白獲得單一的條帶，條帶大小約為27 kDa(圖4)。

圖4 重組蛋白的表達(dá)和純化

2.5 重組蛋白的抗原性鑒定

恙蟲病東方體56 kDa型特異性基因工程蛋白抗原經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜后，以恙蟲病東方體感染的病人多抗血清為抗體(正常人血清為對(duì)照)進(jìn)行 Western blot 反應(yīng)，結(jié)果顯示該多抗血清能夠特異性識(shí)別恙蟲病東方體56 kDa型特異性重組抗原蛋白(圖5)。

圖5 重組蛋白的抗原性鑒定

3 討論

恙蟲病是一種自然疫源性疾病，病原體是恙蟲病東方體(Orientiatsutsugamushi，Ot)，通過(guò)恙螨幼蟲叮咬傳播。恙蟲病診療重點(diǎn)在于及早明確診斷，臨床上應(yīng)用較為廣泛的是免疫學(xué)診斷方法，需要進(jìn)行抗原的制備。過(guò)去常用雞胚培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)等方式獲得抗原，但操作步驟繁瑣、培養(yǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低(操敏等，2003)。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的重組抗原取代天然抗原作為診斷抗原，達(dá)到了經(jīng)濟(jì)、方便的目的。

恙蟲病東方體56 kDa蛋白，包括4個(gè)保守區(qū)和4個(gè)可變區(qū)，保守區(qū)在同型抗體反應(yīng)中起重要作用，而可變區(qū)在異型抗體反應(yīng)中起作用(Ohashietal.,1992)，國(guó)內(nèi)外多針對(duì)該抗原研制診斷抗原(Stoveretal., 1990; Caoetal., 2007)。我國(guó)存在恙蟲病的不同疫區(qū)，存在多種不同東方體型別。安徽省三界地區(qū)是恙蟲病的新疫區(qū)，2007年11月進(jìn)駐三界的訓(xùn)練部隊(duì)發(fā)生恙蟲病暴發(fā)流行。恙蟲病東方體SJ2株是本課題組前期在安徽三界地區(qū)黑線姬鼠體表臨淮崗纖恙螨中首次分離到的，與韓國(guó)young-worl株親緣性高(Caoetal., 2016)。本研究克隆表達(dá)了恙蟲病東方體SJ2分離株56 kDa 截短蛋白約708 bp基因片段，包括2個(gè)保守區(qū)和1個(gè)可變區(qū)，推測(cè)可與同型及異型抗體均發(fā)生反應(yīng)。重組蛋白可被恙蟲病病人血清識(shí)別，與正常人血清不發(fā)生反應(yīng)，表明重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)活性，可作為診斷抗原,或與其他恙蟲病東方體型別重組抗原混合，用于恙蟲病診斷試劑的研制。