褚宏亮 吳治明 田 野 高 劍 周明浩** 趙彤言**

(1.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇南京 210009；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京市蟲媒病與自然疫源性疾病重點實驗室，北京 100071)

三帶喙庫蚊Culextritaeniorhynchus是亞洲的常見蚊種，能夠傳播多種蟲媒病毒，如裂谷熱病毒、西尼羅病毒和登革熱病毒等，更是日本腦炎病毒(Japanese encephalitis，JE)的主要傳播媒介(Selfetal., 1973)。三帶喙庫蚊偏向孳生于富含植物的水體中，其中稻田是其主要孳生地(李春曉等，2007)。中國作為一個糧食大國，在過去的幾十年中，水稻的種植范圍在全國范圍內(nèi)大幅度地增長，成為了世界第二大糧食種植基地(Ghose, 2014)。由此，引起的三帶喙庫蚊種群密度的增長也引起了人們對相關(guān)蟲媒傳染病流行的擔(dān)憂。

微衛(wèi)星標(biāo)記(simple sequence repeats, SSRs)是一類廣泛存在于原核和真核生物基因組非編碼區(qū)中的短重復(fù)序列，該序列一般由6個以內(nèi)堿基組成，且由于序列在不同個體中重復(fù)次數(shù)的差異而表現(xiàn)出高度的多態(tài)性(Vieiraetal., 2016)。目前，對于埃及伊紋Aedesaegypti、白紋伊蚊Aedesalbopictus和尖音庫蚊復(fù)合組CulexpipiensComplex微衛(wèi)星標(biāo)記的研究等均有大量報道，而在三帶喙庫蚊研究方面仍為空白(Julieetal., 2005；Lovinetal., 2009; Renkeetal., 2020)。為便于今后開展三帶喙庫蚊種群的遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性的動態(tài)檢測，本研究應(yīng)用磁珠富集法進(jìn)行三帶喙庫蚊微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)，同時對所得的遺傳標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性評估。

1 材料與方法

1.1 蚊蟲采集

2015年7—8月，在江蘇省16個不同地區(qū)豬圈、牛棚或稻田等適宜區(qū)域，采用誘蚊燈法或二氧化碳誘蚊燈法進(jìn)行三帶喙庫蚊采集，采集時間為6:00 pm～8:00 pm。采集完成后用乙醚麻醉并分類鑒定。最后將挑選的三帶喙庫蚊按地區(qū)編號后放入-70℃冷凍保存，用于后續(xù)的基因組提取。

1.2 實驗試劑和儀器

實驗試劑：Qiagen blood and tissue kit (69504)、Taq酶(Takara)、EcoRⅠ、MseⅠ、MagneSphere Magnetic Separation Products kit (Promega)、用生物素標(biāo)記的探針(AG)15和(GT)15、無水乙醇以及瓊脂糖等。

實驗儀器：超凈工作臺(SW-CJ-1D)、全自動制冰機(jī)(SANYO SIM-F14)、立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-40B)、高速臺式冷凍離心機(jī)(TGL-16G)、電泳儀(DYY-6B)、凝膠成像分析儀(GELl-DOC2000)、Bio-Rad PCR擴(kuò)增儀、3730XL測序儀(Applied Biosystems, USA)等。

1.3 三帶喙庫蚊基因組提取及質(zhì)量檢測

隨機(jī)選取5個地理株用作微衛(wèi)星引物開發(fā)及多態(tài)性驗證。蚊蟲基因組提取按照DNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行(Shietal., 2017)，而后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop核酸檢測儀分別對三帶喙庫蚊基因組DNA的完整性、濃度以及純度進(jìn)行檢測。

1.4 三帶喙庫蚊SSR引物開發(fā)和驗證

1.4.1基因組酶切和接頭連接 在37℃下利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和MseⅠ對三帶喙庫蚊基因組DNA進(jìn)行雙酶切處理，處理時間為3 h，酶切體系為50 μL，其中包含基因組DNA 1 μg、10×T4 DNA ligase Buffer 5 μL、EcoRⅠ(10 U/μL) 1 μL 以及MseⅠ(10 U/μL) 1 μL，剩余部分用水補(bǔ)齊。基因組酶切產(chǎn)物與EcoRⅠ接頭和MseⅠ接頭于4℃連接過夜，連接體系為20 μL，其中包括酶切產(chǎn)物7 μL，EcoRⅠ接頭75 pmol、MseⅠ接頭75 pmol、T4 DNA ligase 1.5 U、10×T4 DNA ligase Buffer 2 μL以及ddH2O 10.5 μL。

1.4.2連接產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系為20 μL，含連接接頭的酶切DNA 2 μL、2×PCRmix 10 μL、E00 10 pmol、M00 10 pmol、Taq酶0.2 U，其他用水補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s、50℃退火45 s、72℃延伸45 s、30次循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.4.3(AG)15和(GT)15探針雜交和磁珠捕捉 用生物素標(biāo)記的探針(AG)15和(GT)15進(jìn)行雜交：將200 pmol探針與100 μL PCR產(chǎn)物在沸水中變性5 min后，立即置于冰上10 min，加入2.5 μL 20×SSC混合液，在62℃水浴鍋中雜交30 min，取出于室溫冷卻。將雜交混合液和平衡好的磁珠混勻，在室溫放置10 min，每2～3 min輕輕搖動一下，使生物素充分吸附在包被親和素的磁珠上，而后用0.1×SSC清洗磁珠4次，最后加入100 μL滅菌ddH2O進(jìn)行洗脫。

1.4.4富集產(chǎn)物的擴(kuò)增、克隆以及陽性克隆的篩選 富集產(chǎn)物擴(kuò)增反應(yīng)程序為：94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環(huán)5次；72℃延伸10 min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物純化并冷凍干燥濃縮至約6 μL，產(chǎn)物與pMD18-T(TaKaRa, D103 A)載體連接，連接體系為12 μL，其中含5.5 μL PCR產(chǎn)物，1 μL pMD18-T載體(50 ng/ μL)，6 μL Solution I，于16℃連接過夜。而后將12 μL連接產(chǎn)物加入150 μL感受態(tài)細(xì)胞于42℃水浴中熱激90 s，迅速移入冰中，靜置5 min，加入900 μL LB培養(yǎng)液，放入37℃恒溫箱搖床，150 r/min培養(yǎng)1 h。分別取100、200、300以及400 μL恢復(fù)培養(yǎng)液涂于含氨卞青霉素的LB培養(yǎng)皿上，倒置于37℃培養(yǎng)過夜。用pMD18-T載體的通用引物M13-47(C G C C A G G G T T T T C C C A G T CA-CGAC)或RV-M(G A G C G G A T A A C A A T TT C A C A CAGG)分別與重復(fù)序列(AG)9組成的雙引物對AG富集文庫菌落進(jìn)行篩選檢測。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環(huán)33次；72℃延伸10 min，4℃保存；取5 μL PCR產(chǎn)物用于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對擴(kuò)增出清晰電泳條帶的菌落進(jìn)行質(zhì)粒測序。

1.4.5序列分析和SSR引物篩選 利用Chromas軟件對序列峰圖進(jìn)行手工校正，并篩選出含有SSR位點的序列。而后利用DNAman軟件去除載體和接頭序列，CodonCode Aligner軟件進(jìn)行序列比對分析，去除重復(fù)序列后，用Primers 5.0軟件進(jìn)行SSR引物設(shè)計。采用丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)對初篩合格引物進(jìn)行復(fù)篩，檢測樣本數(shù)量為5，篩選具有擴(kuò)增多態(tài)性的引物為復(fù)篩合格引物。

2 結(jié)果

2.1 三帶喙庫蚊基因組檢測

三帶喙庫蚊基因組DNA的電泳結(jié)果顯示：基因組DNA條帶單一且明亮，同時，基因組DNA的吸光度值檢測結(jié)果顯示：所有檢測樣本DNA的OD260/280值均位于1.6～2.0之間，且DNA濃度值為60～100 ng/μL，這表明本研究提取的三帶喙庫蚊基因組較完整且濃度較高；基因組DNA雙酶切產(chǎn)物的電泳圖呈現(xiàn)彌散狀，這表明獲得的SSR短基因組DNA質(zhì)量適合后續(xù)的實驗(圖1)。

2.2 微衛(wèi)星位點檢測和多態(tài)性驗證

本實驗共挑選了100個陽性克隆進(jìn)行測序(圖2-a)，測序結(jié)果經(jīng)SSR Hunter軟件分析共獲得了40個含有微衛(wèi)星位點的序列，這些微衛(wèi)星位點的PAGE多態(tài)性驗證結(jié)果表明：有24個位點在不同三帶喙庫蚊地理株間呈現(xiàn)高度的多態(tài)性，這些位點引物的GenBank登記號為：MW340914 ～ MW340937 (圖2-b～f,表1)。

圖1 三帶喙庫蚊基因組和基因組酶切產(chǎn)物電泳圖

表1 三帶喙庫蚊微24個衛(wèi)星位點及序列信息

2.3 微衛(wèi)星位點遺傳多樣性分析

本研究從24個微衛(wèi)星多態(tài)性位點中選取10個進(jìn)行了遺傳多樣性評估，結(jié)果表明：這些位點的等位基因數(shù)(Na)在9～27之間，平均等位基因數(shù)為18；觀察雜合度(Ho)在0.437～0.823之間，平均觀察雜合度為0.653，而期望雜合度(He)在0.530～0.857之間，平均期望雜合度為0.752。各位點的平均多態(tài)信息含量(PIC)和香農(nóng)指數(shù)(SI)結(jié)果基本一致，其中P17最高(PIC=0.853，SI=2.281)，最低的為P40(PIC=0.503，SI=1.195)，都屬于高度多態(tài)性位點(表2)。

圖2 三帶喙庫蚊微衛(wèi)星位點多態(tài)性驗證

表2 三帶喙庫蚊10個微衛(wèi)星位點遺傳多樣性分析

3 討論

在傳統(tǒng)研究中，研究人員常通過文獻(xiàn)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫檢索以及近緣物種交叉擴(kuò)增的方法獲取微衛(wèi)星引物，然而，對于三帶喙庫蚊微衛(wèi)星位點研究仍為空白。因此，為了獲得高效的微衛(wèi)星位點，本研究從基因組出發(fā)，進(jìn)行三帶喙庫蚊微衛(wèi)星位點的重新開發(fā)。目前，微衛(wèi)星位點開發(fā)的方法有很多，如磁珠富集法和高通量測序法。而相比于高通量測序法，傳統(tǒng)的磁珠富集法在兼具準(zhǔn)確度高的同時，費(fèi)用相對低廉且操作簡單(Senanetal., 2014)，因此本研究選用該法進(jìn)行微衛(wèi)星位點的開發(fā)。

多態(tài)信息位點值(PIC)最早由Botstein等(1980)提出，用以評估微衛(wèi)星位點多態(tài)性的高低，以確定其是否適用于種群遺傳連鎖分析。而根據(jù)Ditta等(2018)對于PIC值的判定，本研究測試的10個微衛(wèi)星位點均呈現(xiàn)高度多態(tài)性，即PIC>0.50；同時，基于微衛(wèi)星位點的三帶喙庫蚊雜合度分析結(jié)果也表明：這10個微衛(wèi)星位點能夠準(zhǔn)確地分辨種群觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)的差異，從而評估三帶喙庫蚊種群結(jié)構(gòu)受外來選擇和近交等因素影響的大小(孫潔茹等, 2011)。因此，本研究開發(fā)的三帶喙庫蚊微衛(wèi)星位點能夠適用于后續(xù)三帶喙庫蚊種群遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)研究。