張靈芝

（合肥市口腔醫(yī)院；安徽醫(yī)科大學(xué)合肥口腔臨床學(xué)院，安徽 合肥230001）

隨著組織工程學(xué)的發(fā)展，干細胞領(lǐng)域一直是學(xué)者關(guān)注的熱點問題，干細胞較強的自我更新能力和定向分化潛能在組織工程中發(fā)揮著重要的作用[1]。人乳牙牙髓干細胞是一種間充質(zhì)干細胞，是再生醫(yī)學(xué)的理想細胞來源，它們具有最小的致癌風險、高增殖能力、高多向性和免疫抑制能力，研究表明人乳牙牙髓干細胞移植對小鼠肝纖維化具有抗纖維化作用[2]。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，乳牙牙髓干細胞與乳牙牙根生理性吸收的過程息息相關(guān)[3]，異常的乳牙牙根吸收會導(dǎo)致乳牙早失或乳牙滯留，乳牙牙髓干細胞在維系牙齒正常萌出的過程中有著重要的作用。

炎性微環(huán)境是牙髓疾病最常發(fā)生的一種病理狀態(tài)，嚴重影響著牙齒的健康，流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國兒童口腔衛(wèi)生狀況日趨嚴峻，罹患牙髓炎的患兒日趨增多，因此炎癥這種病理狀態(tài)是否會對乳牙牙根吸收造成影響？本實驗對炎性微環(huán)境下人乳牙牙髓干細胞促破骨細胞相關(guān)因子的表達進行了檢測，探索了炎癥對乳牙牙根吸收的影響，從而解釋了臨床上乳牙早失的原因之一。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、實驗儀器

主要試劑、實驗儀器如表1所示。

1.2 實驗方法

1.2.1 取材

乳牙牙髓組織取材于合肥市口腔醫(yī)院兒童口腔科門診就診的6～8歲兒童即將脫落的乳切牙，取材前征得家屬同意，要求兒童無全身系統(tǒng)性疾病，牙髓牙周組織健康。

表1 主要試劑、實驗儀器

1.2.2 細胞培養(yǎng)

酶消化結(jié)合組織塊法培養(yǎng)乳牙牙髓細胞，用含雙抗的PBS反復(fù)沖洗牙根冠表面，用無菌探針取出新鮮的牙髓組織放在預(yù)冷的含有雙抗和PBS比例為1∶100的PBS中，反復(fù)沖洗干凈后轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿中用手術(shù)刀輕輕分割牙髓組織。1000r/min離心5min。棄上清后，加入含1∶1的3mg/mLI型膠原酶和4mg/mLDispase酶混合液1mL，37.5℃每隔5min振蕩，消化70min，加入少量胎牛血清終止消化。離心后棄上清，加入2mL的α-MEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），將其置于CO2培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃恒溫）中孵育，每隔1d換液。待細胞匯集80%后采用有限稀釋法克隆分離培養(yǎng)，待克隆集落形成后正常消化傳代培養(yǎng)。

1.3 實驗分組

將乳牙牙髓細胞分為正常組和實驗組，正常組細胞用含有5%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，實驗組細胞用培養(yǎng)液含終濃度為10ng/mL的TNF-α培養(yǎng)。

1.4 成骨、成脂誘導(dǎo)

將第三代細胞接種于6孔板內(nèi)，待細胞匯合至60%～70%時，更換成骨、成脂誘導(dǎo)液，每隔3d換液，分別誘導(dǎo)3周后，當出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)和脂滴時停止誘導(dǎo)，茜素紅進行成骨染色，油紅進行成脂染色。

1.5 Real-timePCR檢測兩組細胞TRAP、CTSK基因表達

將正常組和對照組的牙髓細胞用TRIzol裂解，提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物設(shè)計由上海生工生物有限公司設(shè)計合成，引物序列如表2所示。

表2 引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，各實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間差異單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 人乳牙牙髓細胞的培養(yǎng)與純化

用酶消化+組織塊法培養(yǎng)原代細胞，3d左右組織塊周圍有牙髓細胞貼壁爬出，原代培養(yǎng)的牙髓干細胞如圖1所示。通過有限稀釋法挑選細胞，培養(yǎng)7d左右，可見細胞呈束狀排列，實驗選用細胞狀態(tài)良好的第三代細胞作為研究對象，第三代牙髓干細胞如圖2所示。

圖1 原代培養(yǎng)的牙髓干細胞

圖2 第三代牙髓干細胞

2.2 乳牙牙髓干細胞的多向分化能力

牙髓干細胞經(jīng)過21d成骨、成脂誘導(dǎo)后，用配置好的茜素紅溶液以及油紅O溶液分別對其進行染色，結(jié)果顯示成骨誘導(dǎo)組出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)，如圖3所示。成脂誘導(dǎo)組出現(xiàn)脂滴，如圖4所示，表明乳牙牙髓干細胞具有間充質(zhì)干細胞多向分化的能力。

圖3 成骨誘導(dǎo)21d后茜素紅染色

圖4 成脂誘導(dǎo)21d后油紅染色

2.3 炎癥微環(huán)境對乳牙牙髓干細胞促破骨細胞形成的影響

用TNF-α模擬炎癥微環(huán)境，以10ng/mL濃度的TNF-α刺激人乳牙牙髓干細胞，分別檢測對照組與實驗組促破骨細胞相關(guān)因子的表達情況，realtimePCR檢測結(jié)果顯示TNF-α刺激組破骨細胞特異性蛋白TRAP、CTSK的表達明顯上升，分別如圖5、圖6所示，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5刺激組TRAP表達明顯上升

圖6刺激組CTSK表達明顯上升

3 討論

替牙期兒童牙列處于乳恒牙交替的過程之中，乳牙根的生理性吸收對于恒牙的正常萌出至關(guān)重要，不同的外界微環(huán)境會對乳牙牙根吸收產(chǎn)生影響。本實驗檢測了炎癥微環(huán)境下破骨細胞特異性蛋白TRAP、CTSK的表達，結(jié)果顯示，炎癥微環(huán)境能促進破骨細胞形成增加，可能會導(dǎo)致乳牙根的病理性吸收。

骨重建包括骨吸收和骨形成兩個階段，兩個階段通常是平衡的。當骨吸收超過骨形成時，會導(dǎo)致骨質(zhì)破壞等病理過程。組織蛋白酶K是半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶家族的一員，通過活化破骨細胞高表達[4]，研究表明，CTSK通過降解骨基質(zhì)中的I型膠原調(diào)節(jié)骨吸收；在牙源性角化囊腫、成釉細胞瘤、牙周炎中，骨吸收機制可能與CTSK相關(guān)[5]，在病理狀態(tài)下，CTSK活性增強，導(dǎo)致骨質(zhì)的破壞與降解，而抑制CTSK的表達可以減少樹突狀細胞和T細胞的浸潤和炎性細胞因子的產(chǎn)生，緩解了牙周炎病變區(qū)的骨質(zhì)破壞[6-7]。本實驗檢測了炎癥微環(huán)境中乳牙牙髓干細胞中CTSK的表達，結(jié)果顯示，與對照組相比，CTSK的表達明顯上升，提示骨吸收活性增強，也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)IL-1α可通過NF-KB信號通路激活破骨細胞中CTSK的過度表達，引起牙周炎等骨吸收疾病。本實驗僅檢測了破骨細胞特異性蛋白TRAP、CTSK基因表達的水平，在一定程度上證明了炎癥微環(huán)境能促進破骨細胞形成增加，但通過何種分子機制調(diào)控了這一現(xiàn)象的發(fā)生，還有待后續(xù)的研究。