林聽聽，劉 鑫，王昌勃，張 東

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海與遠洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090）

魚類行為學(xué)是一門古老而又年輕的學(xué)科，是探索和研究魚類對外界誘導(dǎo)或刺激所產(chǎn)生的反應(yīng)行為和行為變化規(guī)律的基礎(chǔ)學(xué)科。魚類行為學(xué)廣泛應(yīng)用于漁業(yè)生產(chǎn)中［1-2］。例如，魚類正趨向行為特征在養(yǎng)殖中有助于魚類馴養(yǎng)，在捕撈上有助于誘集魚群；而負(fù)趨向行為特征在漁業(yè)上可作為指示魚類受到環(huán)境應(yīng)激或者生物干擾的先兆，從而達到早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防的目的。近些年，隨著人類對海洋開發(fā)的深入，人為的水下噪聲源也日益增多。這些水下噪聲源主要來自航運船只、聲吶和沿海港口、航道、隧道的施工建設(shè)，以及海上鉆井和海上風(fēng)電場的施工作業(yè)等。水下噪聲嚴(yán)重威脅著許多魚類及海洋哺乳動物的健康和生殖能力，尤其是一些高強度的噪聲會導(dǎo)致海洋動物聽覺缺失甚至死亡［3-4］。

大黃魚（Larimichthyscrocea）是我國目前養(yǎng)殖規(guī)模最大的海水魚類，是我國出口八大優(yōu)勢養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一，在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有重要的地位［5］。但是，由于過度捕撈，野生大黃魚種群受到嚴(yán)重破壞。雖然近年來大力開展休漁和人工增殖放流等措施，以期恢復(fù)大黃魚的漁業(yè)資源，但收效甚微，大黃魚的種質(zhì)資源恢復(fù)緩慢，至今仍無法形成有規(guī)模的漁汛。導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因之一可能與日益增長的水下噪聲有關(guān)：噪聲污染可能將大黃魚驅(qū)離其棲息地而導(dǎo)致低成活率；也有可能是噪聲直接對大黃魚尤其是幼魚產(chǎn)生物理性傷害而導(dǎo)致低成活率。施慧雄等［6］就報道了大黃魚經(jīng)船舶噪聲干擾后其體內(nèi)的皮質(zhì)醇激素響應(yīng)極為迅速，20 min就出現(xiàn)了峰值；另外，翁朝紅等［7］也報道了大黃魚無論是魚苗還是成魚對外界驚擾特別敏感和激烈，只要有異常的驚擾就會四處背離急游，而致體力耗竭或撞壁損傷等，嚴(yán)重時倒浮水中。

鑒于以上研究背景，本文以養(yǎng)殖大黃魚幼魚為研究對象，以產(chǎn)卵場附近常見船舶航行時所致的噪聲為刺激源，確立幼魚對噪聲的敏感閾值，觀測不同聲壓級強度刺激下幼魚的游泳、攝食行為及部分免疫生理指標(biāo)的變化，以期為制定大黃魚產(chǎn)卵場的保護措施提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 船舶噪聲源的錄制

船舶噪聲源于2015年10月在浙江岱山港，用水聽器（C55；Cetacean Research Technology，Seattle，WA，USA；frequency range：20 Hz-44 kHz±3 dB；sensitivity：-165 dB re 1V·μPa-1）在1 500 t貨輪滿載經(jīng)過時現(xiàn)場錄制而成。水聽器置于水下4 m，距船舶水平距離約50 m。錄制的聲信號經(jīng)水聽器由聲壓變電壓信號，經(jīng)電壓前置放大器放大和濾波之后，以.wav的格式存儲于高頻數(shù)字錄音機。經(jīng)DTDiskTM軟件和SIGNALTM軟件分析得出，船舶噪聲頻譜范圍為50 Hz～10 kHz，其主峰位于430 Hz處，水聽器錄制點船舶經(jīng)過時的噪聲聲壓級為98.6 dB，無船舶經(jīng)過時的噪聲聲壓級為62.2 dB（圖1）。根據(jù)大部分石首魚科的聽覺閾值（90～100 dB）［8-10］，本文所錄制的船舶噪聲不在大黃魚的聲信號遮蔽之內(nèi)，能干擾到大黃魚。

1.2 實驗用魚

本研究于2016—2017年期間在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所福鼎試驗基地進行。實驗所用的大黃魚幼魚［體長（10.5±0.8）cm］分批次購自寧德市官井洋大黃魚養(yǎng)殖有限公司。運至基地后，將幼魚暫養(yǎng)于直徑為6 m、深度為1 m的玻璃鋼養(yǎng)殖桶中，每桶200尾，養(yǎng)殖水溫23～24℃。暫養(yǎng)期間，每天換水1/2，早、中、晚各投喂一次浮性膨化顆粒配合飼料。投喂時，將飼料投于固定在養(yǎng)殖桶水面圓心處的浮筐（直徑為60 cm）中，以防止飼料漂散。投喂1 h后，未攝食完的飼料用撈網(wǎng)撈出。待幼魚攝食和排便均正常后（暫養(yǎng)馴化約3～4周），開始用于實驗。

圖1 浙江省岱山港貨輪滿載經(jīng)過時的水下聲音頻譜圖Fig.1 Sound pressure spectrum level of cargo ship passing by and ambient noise in Daishan Port，Zhejiang Province

1.3 噪聲聲壓級對幼魚游泳行為的影響

實驗在直徑為6 m、深度為1 m的玻璃鋼養(yǎng)殖桶中進行。養(yǎng)殖桶水面圓心處設(shè)有一個浮筐，用于投餌；養(yǎng)殖桶桶邊12點鐘方向安有連接于噪聲源的水下?lián)P聲器；養(yǎng)殖桶頂部距水面3 m處安有攝像頭（圖2）。共有8個養(yǎng)殖桶，每個養(yǎng)殖桶有80尾幼魚，這些幼魚均經(jīng)過24 h的饑餓。這8個養(yǎng)殖桶分別進行 40、60、80、100、120、140、160和200 dB的聲壓級刺激。實驗開始前，噪聲播放器、信號放大器和水下?lián)P聲器先在未放幼魚的養(yǎng)殖桶中調(diào)試，用水聽器實測聲壓級，調(diào)到所設(shè)定的聲壓級后，關(guān)閉噪聲源，將水下?lián)P聲器移至所對應(yīng)聲壓級的養(yǎng)殖桶。實驗開始時，先用飼料將幼魚誘集至圓心處，然后瞬間開啟噪聲源，觀察幼魚的游泳行為。

圖2 實驗裝置示意圖Fig.2 Diagram of experimental device

1.4 短期單次和多次噪聲刺激對幼魚部分生理指標(biāo)的影響

實驗裝置同1.3。根據(jù)1.3所得的噪聲聲壓級敏感范圍，選取120 dB和150 dB這2個刺激聲壓級。實驗共分4組，分別進行120 dB&1次（A組）、150 dB&1次（B組）、120 dB&3次（C組）、150 dB&3次（D組）的處理。每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾魚。每次刺激持續(xù)5 min，每次刺激間隔2 h。刺激結(jié)束后0.5 h，往養(yǎng)殖桶里加丁香酚麻醉幼魚。以未刺激的幼魚為對照組（control）。

用含肝素鈉抗凝劑的5 mL注射器從麻醉的幼魚尾部脊椎取血，5 000 r·min-1離心取血漿，置于-80℃超低溫冰箱中保存，用于檢測皮質(zhì)醇（cortisol）、血 糖 （blood glucose）、血 紅 蛋 白（hemoglobin）和乳酸（lactic acid）這 4個生理指標(biāo)。檢測方法為從南京建成生物工程研究所購買適合魚類檢測的試劑盒并按其說明書進行。

1.5 長期噪聲刺激對幼魚存活、生長、腸道菌落及部分免疫指標(biāo)的影響

實驗裝置同1.3。實驗分對照組和噪聲組，對照組不進行刺激；而噪聲組刺激聲壓級值為120 dB，每天早、中、晚刺激3次，每次刺激持續(xù)5 min。每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾幼魚。對照組和噪聲組每天投喂3次浮性膨化顆粒配合飼料，每次在噪聲刺激前0.5 h投喂；每天及時撈出并記錄死亡的幼魚。實驗共持續(xù)30 d。實驗結(jié)束后清點各組存活幼魚，并往養(yǎng)殖桶里加丁香酚麻醉幼魚。

每個重復(fù)取8條幼魚用于取血和取腸道。用含肝素鈉抗凝劑的5 mL注射器從麻醉的幼魚尾部脊椎取血，5 000 r·min-1離心取血漿，-80℃凍存用于檢測免疫指標(biāo)。取血后，無菌解剖幼魚取其腸道，置于DNAse/RNAse-Free凍存管，-80℃凍存用于檢測腸道菌落。每個重復(fù)剩余的幼魚用于測量體質(zhì)量，計算特定生長率（specific growth rate，SGR）。SGR=100 ×（lnWfinal-lnWinitial）/T，其中Winitial為魚體實驗前初始體質(zhì)量，Wfinal為魚體實驗結(jié)束后的最終體質(zhì)量，T為實驗時間。

所檢的免疫指標(biāo)包括：免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM），干擾素-α（interferon-α，IFN-α），白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）。檢測方法為從南京建成生物工程研究所購買適合魚類檢測的酶聯(lián)免疫試劑盒并按其說明書進行。腸道菌落檢測采用16SrDNA高通量測序分析技術(shù)，由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司協(xié)助完成。

1.6 噪聲刺激對幼魚攝食行為的影響

實驗同樣在直徑為6 m、深度為1 m的玻璃鋼養(yǎng)殖桶中進行。每桶200尾幼魚作為1個重復(fù)，共設(shè)3個重復(fù)。每桶設(shè)2個定點投喂點，即6點鐘方向和12點鐘方向，其中6點鐘方向無噪聲源；12點鐘方向設(shè)有噪聲刺激源，聲壓級為120 dB，每隔1 h刺激一次，每次刺激持續(xù)5 min。第一次刺激時間為07∶00，0.5 h后，往2個定點投喂點各一次性投放200粒顆粒飼料。之后觀察各刺激時間（08∶00、09∶00、10∶00）后，幼魚的行為、分布及投喂點的飼料剩余量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。噪聲組和對照組以及各個處理組之間的差異顯著性用軟件Origin 8.0進行單因素方差（One-way ANOVA）分析。若有顯著差異，則繼續(xù)進行Tukey多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 噪聲聲壓級對幼魚游泳行為的影響

在不同梯度噪聲聲壓級刺激下，幼魚的游泳行為見表1和圖3。

表1 不同梯度噪聲聲壓級刺激下幼魚的游泳行為Tab.1 Swimming behaviors of L.crocea juveniles stressed by different levels of ship noise intensities

圖3 攝像儀所觀測到的幼魚在不同梯度噪聲聲壓級刺激下的游泳行為Fig.3 The camera-observed swimming behaviors of L.crocea juveniles under different levels of ship noise intensities

2.2 短期單次和多次噪聲刺激對幼魚部分生理指標(biāo)的影響

短期內(nèi)單次和多次噪聲刺激下，幼魚血漿中4個與應(yīng)激相關(guān)的生理指標(biāo)均表現(xiàn)出不同程度地上升，其中皮質(zhì)醇、血糖和乳酸上升幅度尤為顯著（圖4）。變化趨勢方面，皮質(zhì)醇不同于另外3個指標(biāo)，其具體表現(xiàn)為：單次刺激后，即達到峰值；而多次刺激后，反而較單次刺激有所下降。血糖、血紅蛋白和乳酸這3個指標(biāo)則呈現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，均表現(xiàn)為多次刺激要高于單次刺激。另外，無論是單次刺激還是多次刺激，120 dB和150 dB這兩個聲壓級強度均未表現(xiàn)出明顯差異。

圖4 短期單次和多次噪聲刺激下幼魚血漿中皮質(zhì)醇、血糖、血紅蛋白和乳酸含量的變化Fig.4 Changes of cortisol，glucose，hemoglobin and lactic acid in plasma of L.crocea juveniles stimulated by short-term single and multiple ship noises

2.3 長期噪聲刺激對幼魚存活、生長、腸道菌落及部分免疫指標(biāo)的影響

經(jīng)過30 d的噪聲刺激，幼魚的存活情況與對照組無顯著差異，但生長表現(xiàn)則明顯減緩，其SGR值僅為0.72±0.08，遠低于對照組的1.23±0.16（圖5）。免疫指標(biāo)方面，免疫球蛋白M、干擾素-α、白介素-1β和腫瘤壞死因子-α的含量均顯著低于對照組（圖6）。另外，噪聲刺激后，幼魚的腸道菌群組成與對照組發(fā)生了很大的變化，其中變化之一是噪聲組的腸道益生菌，如芽孢桿菌（Bacillus）、乳桿菌（Lactobacillus）等相對豐度顯著降低（圖7）。另外，噪聲組的弧菌（Vibrio fortis）相對豐度（75.2% ±3.6%）也顯著高于對照組（15.8% ±2.8%）。

2.4 噪聲刺激對幼魚攝食行為的影響

實驗發(fā)現(xiàn)：幼魚能準(zhǔn)確識別噪聲源的位置，刺激1次后就對噪聲源具有了一定的記憶性。先吃無噪聲源的投餌點餌料（6點鐘方向），基本很少吃有噪聲源的投餌點餌料（12點鐘）。只有等到無噪聲源的投餌點（6點鐘）餌料量很少了，才試探性地去吃有噪聲源的投餌點餌料（09∶30—09∶50）。第4次刺激（10∶00）一啟動，幼魚又趨避到6點鐘方向（10∶05），但刺激一結(jié)束，幼魚在6點鐘方向逗留的時間很短，很快就游往12點鐘方向進行攝食（圖8）。

圖5 噪聲刺激30 d后大黃魚幼魚的存活和生長表現(xiàn)Fig.5 Survival and growth performance of L.crocea juveniles after 30 days of noise stimulation

圖6 噪聲刺激30 d后大黃魚幼魚血漿中免疫指標(biāo)（免疫球蛋白M、干擾素-α、白介素-1β和腫瘤壞死因子-α）的變化Fig.6 Changes of immune indexes（immunoglobulin M，interferon-α，interleukin-1βand tumor necrosis factor-α）in plasma of L.crocea juveniles after 30 days of noise stimulation

圖8 噪聲刺激下各時段幼魚的游泳和攝食行為示意圖Fig.8 Diagram of swimming and feeding behaviors of L.crocea juveniles stimulated by noise in different periods

3 討論

研究顯示，全世界大概有800多種魚具有發(fā)聲能力。魚類的發(fā)聲行為對它們的種群溝通，如索餌、避敵、繁殖、洄游、集群等具有非常重要的作用［11］。然而，隨著人類對海洋開發(fā)的深入，人類制造的水下噪聲與日俱增。這些噪聲嚴(yán)重地干擾了魚類的發(fā)聲行為，或輕或重地影響到了它們的生存和生活［12］。大黃魚是典型的具發(fā)聲能力的魚類，對外界聲響相當(dāng)敏感。20世紀(jì)50—60年代中國盛行的敲罟作業(yè)和過度捕撈，正是利用了大黃魚對水中聲音較敏感這一特性，導(dǎo)致野生大黃魚幾乎陷入滅絕的窘境。雖然近些年休漁和人工放流等措施不斷推行，以期恢復(fù)大黃魚的漁業(yè)種質(zhì)資源，但進展十分緩慢，至今仍無法形成有規(guī)模的漁汛。原因之一就可能與日益增長的水下噪聲有關(guān)。大黃魚對噪聲十分敏感，水下噪聲嚴(yán)重影響到了它們的索餌、集群和繁殖等，進而危及到了種群的繁衍。在眾多水下噪聲中，船舶噪聲是對大黃魚影響最常見、最直接、最頻繁的噪聲。

3.1 不同梯度噪聲聲壓級對幼魚游泳行為的影響

本文研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)噪聲聲壓級＞60 dB時，幼魚就開始呈現(xiàn)出不同程度的應(yīng)激和趨避行為。這一噪聲敏感閾值低于多數(shù)石首魚科魚類的敏感閾值（90～100 dB）［8-10］，佐證了大黃魚對聲音非常敏感的事實。但在殷雷明等［8］研究中發(fā)現(xiàn)，大黃魚的船舶噪聲敏感閾值約為88 dB。兩者研究結(jié)果的差異可能源于幼魚的個體大小以及幼魚所處的環(huán)境，殷雷明等［8］的實驗幼魚體長約為20 cm，大于本文的 10 cm；另外，殷雷明等［8］的實驗幼魚長期處于大水面的網(wǎng)箱養(yǎng)殖環(huán)境中，頻繁的水下噪聲刺激，可能增強了幼魚對船舶噪聲的耐受性。

此外，本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著聲壓級的增大，大黃魚幼魚的應(yīng)激趨避行為越來越強烈，依次表現(xiàn)出：游泳速度加快，魚與魚之間、魚與桶壁之間發(fā)生碰撞，瞬間反應(yīng)無序，跳躍等行為；當(dāng)聲壓級＞200 dB時，刺激2 min后就有死亡個體出現(xiàn)。劉貞文等［13］也報道了相似的結(jié)果：大黃魚幼魚（體長約10 cm，8月齡），在聲波頻率600 Hz、聲壓級130 dB刺激下，趨避行為變得遲鈍和無序，還伴有跳躍行為；當(dāng)聲壓級達到168 dB時，噪聲源正上方的幼魚直接致死。

3.2 短期單次和多次噪聲刺激對幼魚部分生理指標(biāo)的影響

魚類的應(yīng)激受控于下丘腦—垂體—腎臟髓質(zhì)（HPI軸）［14］。魚類的應(yīng)激首先表現(xiàn)為生理指標(biāo)的波動，造成魚體外與體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的變化。魚類對應(yīng)激的短期生理反應(yīng)可分為兩個階段：第一階段是神經(jīng)系統(tǒng)接受外界應(yīng)激信號并迅速分泌腎上腺素，刺激魚類頭腎組織釋放皮質(zhì)醇，皮質(zhì)醇調(diào)動體內(nèi)儲備的能量以提供調(diào)節(jié)滲透壓所需的氧氣和能量；第二階段主要涉及生理生化方面的代謝反應(yīng)，包括血漿和組織中代謝產(chǎn)物、血液學(xué)指標(biāo)的變化以及應(yīng)激蛋白/基因的激活等［15］。因此，血漿皮質(zhì)醇、滲透壓、乳酸、血紅蛋白、血糖、血氨等指標(biāo)已被作為魚類的應(yīng)激指示指標(biāo)被廣泛、頻繁地用于評估魚類所受的各種環(huán)境脅迫、操作脅迫和運輸脅迫等［16-19］。

本文研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)船舶噪聲短暫的刺激后，大黃魚幼魚血漿中皮質(zhì)醇、乳酸、血紅蛋白和血糖顯著升高，但120 dB和150 dB的響應(yīng)幅度之間未見明顯差異。此外，皮質(zhì)醇單次刺激后即達到峰值，而多次刺激后反而有所下降，這一結(jié)果佐證了皮質(zhì)醇為魚類應(yīng)激第一階段中響應(yīng)最靈敏的指標(biāo)之一，也說明了皮質(zhì)醇的響應(yīng)可能不具有累加效益，多次的刺激反而可能增加耐受性［6］。但是，不同于皮質(zhì)醇，另外 3個指標(biāo)（血糖、血紅蛋白和乳酸）的變化規(guī)律則是響應(yīng)速度要滯后于皮質(zhì)醇，并且多次刺激要高于單次刺激，這一結(jié)果也佐證了血糖、血紅蛋白和乳酸這些指標(biāo)主要在應(yīng)激過程中第二階段響應(yīng)，也說明了這些指標(biāo)具有累加效益，重復(fù)的刺激加劇幼魚的生理代謝負(fù)擔(dān)［15］。除了本文所述的大黃魚外，船舶噪聲對其他水生動物的生理影響也常有報道。在 鯉 （Cyprinuscarpio）［20］和 鮈 魚 （Gobio gobio）［20］中，船舶噪聲同樣引起血漿皮質(zhì)醇急劇升高；而在灰海馬（Hippocampuserectus）［19］和金頭鯛（Sparusaurata）［21］中，船舶噪聲可引起皮質(zhì)醇、促腎上腺皮質(zhì)激素、血糖、乳酸、紅細胞壓積、熱休克蛋白70、總蛋白、膽固醇、甘油三酯和滲透壓等一系列生理指標(biāo)發(fā)生劇烈波動。

3.3 長期噪聲刺激對幼魚存活、生長、腸道菌落及部分免疫指標(biāo)的影響

本文研究發(fā)現(xiàn)，長期處于噪聲刺激，大黃魚幼魚的生長減緩，免疫水平下降。這可能歸因于應(yīng)激過程是個高耗能的過程。應(yīng)激狀態(tài)下，魚體內(nèi)分泌大量腎上腺素和皮質(zhì)醇等物質(zhì)，機體合成代謝處于高強度水平，大量耗能，導(dǎo)致沒有足夠的能量用于分配生長和免疫。此外，合成分泌的腎上腺素和皮質(zhì)醇本身也能對機體產(chǎn)生毒害作用，如影響食物攝入、消化和吸收；損傷機體部分組織器官；抑制機體免疫功能等［21-24］。所以，一是魚體把大量的能量用于腎上腺素和皮質(zhì)醇的合成代謝，導(dǎo)致用于生長和免疫的能量分配減少；二是過多合成的腎上腺素和皮質(zhì)醇會對機體產(chǎn)生攝食和吸收減少、抑制免疫等不良影響，是大黃魚幼魚在噪聲長期刺激下生長變緩、免疫低下的主要原因。類似的結(jié)果也同樣出現(xiàn)在其他水生動物中，如海馬（Hippocampuserectus）［18］，金魚（Carassiusauratus）［25］和 虹鱒 （Oncorhynchus mykiss）［26］，噪聲刺激同樣使它們生長變緩，免疫下降，抗病力減退。

腸道菌群是非常重要的菌群，對維持機體的健康具有重要的作用。腸道菌群的失調(diào)容易引發(fā)機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的紊亂，進而誘發(fā)各種疾病。多種疾病目前已被研究證實是因為腸道菌群的失調(diào)所致［27-28］。關(guān)于環(huán)境脅迫對魚體腸道菌群的影響至今未見報道。本文研究發(fā)現(xiàn)，在長期的噪聲刺激下，大黃魚幼魚腸道菌群與未刺激幼魚相比，無論是菌群組成還是相對豐度，都發(fā)生了很大的變化。其中最明顯的變化之一是刺激幼魚的腸道益生菌如芽孢桿菌、乳桿菌等明顯缺失。這些益生菌已被廣泛證明在維持魚體的穩(wěn)態(tài)、促進魚體的消化、改善魚體的免疫等方面發(fā)揮著重要的作用［29］。為此，在噪聲長期刺激下，大黃魚幼魚生長減緩、免疫力下降的原因除了上述的兩個原因外，還跟噪聲刺激導(dǎo)致魚類腸道益生菌失衡有著直接的關(guān)系。