楊東，楊宇，白云波，張同慶，張為遠(yuǎn)

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京100038；2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院

卵巢癌是女性第七大常見癌癥，也是癌癥死亡的第八大常見原因。近年來，卵巢癌的發(fā)病率明顯升高并呈年輕化趨勢[1]。卵巢癌早期癥狀隱匿，約70%患者就診時已進(jìn)展為晚期，錯過了最佳手術(shù)時機(jī)，預(yù)后較差，5年生存率不足45%[2]。目前，卵巢癌發(fā)病的確切分子機(jī)制尚不清楚。因此，探索與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子對其診斷和治療具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可與靶基因mRNA結(jié)合，通過翻譯水平抑制或斷裂靶基因mRNA而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miR-204是miRNA家族成員之一，可結(jié)合下游靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR)，通過改變靶基因mRNA的穩(wěn)定性，影響靶基因表達(dá)，繼而參與生長發(fā)育、代謝、衰老等生物學(xué)過程[3]。有研究表明，miR-204在黑色素瘤[4]、腦膠質(zhì)瘤[5]等腫瘤組織中存在異常表達(dá)現(xiàn)象；miR-204可通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、化療耐藥等機(jī)制，發(fā)揮腫瘤抑制作用[6]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是一種廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，屬于神經(jīng)生長因子蛋白家族成員，該蛋白與其同源受體的結(jié)合能夠調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)、情緒障礙等生物學(xué)過程[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，BDNF異常高表達(dá)能夠通過激活磷脂酰肌醇-3激酶信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖、浸潤和遷移[8]。但miR-204、BDNF表達(dá)變化與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的報道相對較少。為此，本研究觀察了卵巢癌組織miR-204、BDNF表達(dá)變化，并探討二者在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年5月～2016年5月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院收治的卵巢癌患者89例。所有患者經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合卵巢癌診斷；②初診；③接受卵巢癌全面分期手術(shù)或腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)；④術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療；⑤臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他器官或系統(tǒng)惡性腫瘤者；②合并急慢性感染性疾病者；③合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重功能不全者；④合并神經(jīng)、精神疾病，不能配合治療或完成隨訪者?；颊吣挲g29～72(54.1±6.4)歲；病理類型：黏液性癌37例，漿液性癌52例；組織分化程度：高中分化56例，低未分化33例；臨床分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期22例，Ⅲ期42例，Ⅳ期12例；有淋巴結(jié)或腹膜轉(zhuǎn)移39例，無淋巴結(jié)或腹膜轉(zhuǎn)移50例；血清CA125水平：≤35 μg/mL 41例，>35 μg/mL 48例；腹水量：≤100 mL 45例，>100 mL 44例。同期隨機(jī)選擇因子宮良性病變行子宮及附件切除手術(shù)且經(jīng)術(shù)后組織病理檢查證實卵巢正常患者20例，年齡28～73(53.6±6.7)歲，子宮肌瘤12例、子宮腺肌癥8例。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 miR-204、BDNF表達(dá)檢測 采用RT-qPCR法。手術(shù)獲取的卵巢癌組織和正常卵巢組織，立即置于凍存管內(nèi)，液氮轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃冰箱保存，待組織成批。取凍存組織約50 mg，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，可用于后續(xù)實驗。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，84 ℃ 5 s。以cDNA為模板，按SYBR?Premix Ex TaqTM說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。引物序列：miR-204上游引物5′-GCCAGATCTGGAAGAAGATGGTGGTTAGT-3′、下游引物5′-GGCGAATTCACAGTTGCCTACAGTATTCA-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物5′-ATTCCACCCATGGCAAATTC-3′，下游引物5′-TGGGATTTCCATTGATGACAAG-3′；BDNF上游引物5′-GGCTTGACATCATTGGCTGAC-3′、下游引物5′-CATTGGGCCGAACTTTCTGGT-3′，內(nèi)參β-actin上游引物5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′、下游引物5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。PCR反應(yīng)體系均為20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，Master Mix 10 μL，DEPC水7 μL(miR-204)；cDNA模板2 μL，TaqDNA聚合酶0.1 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR Premix Ex Taq 1 μL，dNTPs 0.4 μL，ddH2O 14.5 μL(BDNF)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 15 s、70 ℃ 30 s共40個循環(huán)(miR-204)；95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 10 s共40個循環(huán)(BDNF)。以GAPDH、β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3 隨訪 卵巢癌患者術(shù)后采用門診、電話等形式定期隨訪，每3個月隨訪1次，隨訪截至2019年5月，終點事件為患者死亡，統(tǒng)計患者生存情況，計算3年總體生存率。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織與正常卵巢組織miR-204、BDNF表達(dá)比較 卵巢癌組織與正常卵巢組織miR-204相對表達(dá)量分別為0.213±0.031、0.645±0.083，BDNF相對表達(dá)量分別為0.572±0.087、0.321±0.081。卵巢癌組織miR-204相對表達(dá)量低于正常卵巢組織，BDNF相對表達(dá)量高于正常卵巢組織(t分別為38.904、11.799，P均<0.01)。

2.2 卵巢癌組織miR-204表達(dá)與BDNF表達(dá)的關(guān)系 Pearson線性相關(guān)分析顯示，卵巢癌組織miR-204相對表達(dá)量與BDNF相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.603，P<0.01)。

2.3 卵巢癌組織miR-204、BDNF表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 卵巢癌組織miR-204、BDNF相對表達(dá)量均與組織分化程度、臨床分期有關(guān)(P均<0.05)，與年齡、病理類型、淋巴結(jié)或腹膜轉(zhuǎn)移、血清CA125水平及腹水量無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 卵巢癌組織miR-204、BDNF表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 卵巢癌組織miR-204、BDNF表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 至隨訪截至?xí)r間，所有患者隨訪1～36個月、中位隨訪時間26個月，死亡38例，無失訪病例。

以卵巢癌組織miR-204相對表達(dá)量的均數(shù)0.213為臨界值，將患者分為miR-204高表達(dá)者44例、低表達(dá)者45例。miR-204高表達(dá)者3年總體生存率為68.1%(30/44)，miR-204低表達(dá)者為46.6%(21/45)，miR-204低表達(dá)者3年總體生存率低于miR-204高表達(dá)者(χ2=3.901，P<0.05)。見圖1。

以卵巢癌組織BDNF相對表達(dá)量的均數(shù)0.572為臨界值，將患者分為BDNF高表達(dá)者43例、低表達(dá)者46例。BDNF高表達(dá)者3年總體生存率為41.9%(18/43)，BDNF低表達(dá)者為71.7%(33/46)，BDNF高表達(dá)者3年總體生存率低于BDNF低表達(dá)者(χ2=4.690，P<0.05)。見圖2。

圖1 卵巢癌組織不同miR-204表達(dá)者預(yù)后的生存曲線

圖2 卵巢癌組織不同BDNF表達(dá)者預(yù)后的生存曲線

3 討論

卵巢癌是一種臨床常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，每年全球新發(fā)病例約22.5萬例、死亡病例約14萬例[9]。卵巢癌主要以手術(shù)治療為主，輔以放療、化療和免疫治療等。但大部分患者就診時已進(jìn)展至中晚期，即使經(jīng)過手術(shù)、放療、化療等規(guī)范治療，腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的概率仍然較高，患者5年生存率較低[10]。目前，卵巢癌發(fā)生、發(fā)展確切的分子機(jī)制尚不完全清楚。近年隨著高通量測序等技術(shù)的不斷發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多種分子機(jī)制，如癌基因激活、抑癌基因失活及基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控異常等。因此，深入探索與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子對其診斷和治療具有重要意義。

miRNA是一類長度為20～25個核苷酸的非編碼RNA分子，由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉(zhuǎn)錄后形成具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體，再進(jìn)一步經(jīng)核糖核酸酶Ⅲ Dicer識別、剪切形成成熟miRNA并構(gòu)成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，通過堿基配對的方式結(jié)合靶基因mRNA的3′UTR，通過改變靶基因mRNA的穩(wěn)定性，影響靶基因表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在肺癌[11]、肝癌[12]等腫瘤組織中存在異常表達(dá)現(xiàn)象，其異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的無限增殖、凋亡抑制等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。miR-204是miRNA家族成員之一，定位于人染色體9q21.12，在乳腺癌、肺癌等腫瘤組織中存在表達(dá)下調(diào)現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-204通過結(jié)合并抑制叉頭盒A1基因的信使RNA表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖、遷移；在腫瘤組織中miR-204表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移，繼而引起腫瘤惡性進(jìn)展[13]。由此推測，miR-204可能在卵巢癌中發(fā)揮同樣的調(diào)控作用。但目前相關(guān)報道較少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織miR-204相對表達(dá)量明顯低于正常卵巢組織，證實在卵巢癌組織中miR-204低表達(dá)，其原因可能與長鏈非編碼RNA(LncRNA)轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)對miR-204的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。有研究表明，LncRNA MALAT1能夠作為分子海綿結(jié)合并抑制miR-204的表達(dá)與活性，當(dāng)腫瘤發(fā)生時LncRNA MALAT1表達(dá)增加，可導(dǎo)致miR-204表達(dá)降低，引起miR-204下游的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)增加，如SMAD4等，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織miR-204相對表達(dá)量與組織分化程度、臨床分期有關(guān)，與年齡、病理類型、淋巴結(jié)或腹膜轉(zhuǎn)移、血清CA125水平及腹水量無關(guān)。結(jié)果提示，miR-204低表達(dá)與卵巢癌的惡性進(jìn)展有關(guān)，其機(jī)制可能與miR-204能夠抑制EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail1表達(dá)有關(guān)。miR-204表達(dá)降低可導(dǎo)致Snail1表達(dá)上調(diào)，繼而引起下游E鈣黏素等上皮細(xì)胞表型蛋白表達(dá)降低和波形蛋白等間質(zhì)細(xì)胞表型蛋白表達(dá)升高，從而促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展[15]。本研究進(jìn)一步分析了不同miR-204表達(dá)者3年總體生存率的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-204低表達(dá)者3年總體生存率明顯低于miR-204高表達(dá)者，表明卵巢癌組織miR-204低表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)。因此，miR-204有可能成為評估卵巢癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

BDNF基因定位于人染色體11p14.1，其編碼蛋白在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，通過結(jié)合神經(jīng)元細(xì)胞表面的酪氨酸激酶受體，即原肌球蛋白受體激酶B(TrkB)，激活下游信號通路，發(fā)揮維持神經(jīng)元存活并促進(jìn)新的神經(jīng)元和突觸生長及促進(jìn)肌肉再生等生物學(xué)作用。近年研究表明，BDNF/TrkB信號通路在乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，即BDNF/TrkB信號通路的過度活化能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤和遷移等惡性生物學(xué)行為。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織BDNF相對表達(dá)量明顯高于正常卵巢組織，證實在卵巢癌組織中BDNF高表達(dá)，其原因可能與抑制其表達(dá)的miRNA表達(dá)下調(diào)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1、miR-10b、miR-191等通過與BDNF 3′UTR中相應(yīng)的位點結(jié)合，直接抑制BDNF信使RNA的穩(wěn)定性，降低BDNF表達(dá)；但在腫瘤發(fā)生時miR-1、miR-10b、miR-191等表達(dá)降低，導(dǎo)致BDNF/TrkB信號通路的過度活化，從而促進(jìn)腫瘤組織BDNF高表達(dá)[16，17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織BDNF相對表達(dá)量與組織分化程度、臨床分期有關(guān)，與年齡、病理類型、淋巴結(jié)或腹膜轉(zhuǎn)移、血清CA125水平及腹水量無關(guān)。結(jié)果提示，BDNF高表達(dá)與卵巢癌的惡性進(jìn)展有關(guān)，其機(jī)制可能是BDNF過表達(dá)通過誘導(dǎo)Ca2+依賴性酪氨酸激酶的402位點酪氨酸磷酸化，誘發(fā)Ca2+流動，從而介導(dǎo)相應(yīng)的信號通路激活，繼而促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展。同時，BDNF過表達(dá)還可通過激活下游磷脂酰肌醇-3激酶信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，BDNF過表達(dá)與膀胱癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌等患者預(yù)后不良有關(guān)[19]。本研究中，BDNF高表達(dá)者3年總體生存率低于BDNF低表達(dá)者，表明卵巢癌組織BDNF高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)。因此，BDNF有可能成為評估卵巢癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織miR-204相對表達(dá)量與BDNF相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明miR-204與BDNF可能存在一定的調(diào)控關(guān)系。有研究報道，在乳腺癌中miR-204能夠結(jié)合BDNF信使RNA，進(jìn)而促進(jìn)BDNF信使RNA的降解，而敲除miR-204表達(dá)后，BDNF表達(dá)升高，從而促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展[20]。但二者在卵巢癌中具體的調(diào)控關(guān)系尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，卵巢癌組織miR-204低表達(dá)、BDNF高表達(dá)，二者表達(dá)變化與臨床分期、組織分化程度和患者預(yù)后有關(guān)。miR-204、BDNF有可能成為卵巢癌分子診斷、靶向治療和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。