曾真，徐之良，程衍陽

武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430000

急性淋巴細胞白血病(ALL)是兒童時期最常見的惡性腫瘤，根據(jù)淋巴細胞類型可進一步分為急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)和急性T淋巴細胞白血病，以B-ALL最多見[1]。近年隨著對B-ALL發(fā)病機制的深入研究和新型靶向藥物的發(fā)現(xiàn)，臨床化療方案得到不斷改進，加之造血干細胞移植技術(shù)的廣泛應(yīng)用，B-ALL患兒完全緩解率明顯提高、無病生存時間明顯延長[2]。但仍有部分B-ALL患兒治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)，其原因可能與微小殘留病灶有關(guān)[3]。加強化療雖然能在一定程度上降低復(fù)發(fā)率，卻增加了治療相關(guān)死亡和繼發(fā)第二腫瘤的風(fēng)險，使總體治愈率并未明顯提高[4]。因此，進一步深入研究B-ALL發(fā)生、發(fā)展確切的分子機制，尋找新的分子診斷標(biāo)志物和治療靶點具有重要意義。WT1基因是最早發(fā)現(xiàn)與Wilm′s腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的基因，由Haber等學(xué)者于上世紀(jì)90年代首次發(fā)現(xiàn)。WT1基因定位于染色體11p13區(qū)域，其編碼產(chǎn)生的WT1蛋白在C末端為含有4個鋅指基序的DNA結(jié)合區(qū)、在N末端為含有富含脯氨酸/谷氨酰胺的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，能夠通過識別、結(jié)合特異的目標(biāo)DNA來調(diào)控下游基因表達，從而在神經(jīng)系統(tǒng)和心、肝、腎等重要臟器的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，多種實體瘤組織WT1基因異常高表達，并通過調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡等，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。姜麗等[6]研究發(fā)現(xiàn)，老年急性髓系白血病患者外周血WT1基因表達明顯升高，有可能成為微小殘留病灶監(jiān)測的有效靶點之一。鑒于此，本研究觀察了B-ALL患兒外周血單個核細胞WT1基因表達變化，并探討其表達變化與患兒臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月～2014年4月武漢大學(xué)人民醫(yī)院收治的B-ALL患兒83例(觀察組)。所有患兒符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會血液學(xué)組制定的《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議(第三次修訂草案)》[7]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合B-ALL診斷；②年齡≤12歲；③臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他血液系統(tǒng)疾病者；②合并其他部位惡性腫瘤者；③合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重功能不全者；④合并肺炎、腦炎等感染性疾病者。其中，男41例、女42例，年齡0～12(5.23±1.32)歲(≤2歲22例、>2歲61例)；流式亞型：Com-B-ALL型54例，Pro-B-ALL型8例，Pre-B-ALL型21例；危險程度(SCMC-ALL-2005方案)[8]：高危18例，中危20例，標(biāo)危45例；染色體核型：正常核型61例，異常核型22例；治療前WBC計數(shù)：<50×109/L 70例，≥50×109/L 13例。83例B-ALL患兒中，初發(fā)46例、復(fù)發(fā)37例，根據(jù)全國小兒白血病協(xié)作組推薦的VDLP(長春新堿+柔紅霉素+左旋門冬酰胺酶+潑尼松)方案予誘導(dǎo)緩解治療。同期選擇在武漢大學(xué)人民醫(yī)院擇期手術(shù)的非B-ALL患兒40例(對照組)，男19例、女21例，年齡0～12(5.41±1.51)歲。擇期手術(shù)的非B-ALL患兒既往無血液系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)疾病，無激素類藥物用藥史等。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象父母或其監(jiān)護人知情同意。

1.2 外周血單個核細胞WT1基因表達檢測 ①單個核細胞提?。核醒芯繉ο笕朐捍稳?，采集清晨空腹肘靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝，用D-Hanks液按1∶1稀釋，混勻。在50 mL離心管中預(yù)先加入10 mL淋巴細胞分離液，將稀釋后的抗凝血沿管壁緩慢加于分離液面上，保持兩液面分層清晰，然后2 000 r/min離心20 min，離心后管內(nèi)液體分層清晰，第一層為血漿層，第二層為環(huán)狀乳白色淋巴細胞層，第三層為淋巴細胞分離液層，第四層為紅細胞層。用吸管小心收集第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞，置于另一離心管中，采用密度梯度離心法獲取單個核細胞。②總RNA提?。翰捎肨RIzol法提取外周血單個核細胞總RNA，經(jīng)超微量分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格，可用于后續(xù)實驗。③逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：按PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min、84 ℃ 5 s。④PCR擴增：以cDNA為模板，按SYBR Premix Ex Taq說明進行PCR擴增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。引物序列：WT1基因上游引物5′-CGACTCTTGTACGGTCGGC-3′，下游引物5′-TCACAGTCCTTGAAGTCACACT-3′；GAPDH上游引物5′-TCTCTCAGATGTAACTGAGCTG-3′，下游引物5′-TAGCTCATCAACCGATCT-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA模板2 μL，Taq DNA聚合酶0.1 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR Premix Ex Taq 1 μL，dNTPs 0.4 μL，ddH2O 14.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 10 s共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有B-ALL患兒自確診之日開始，采用門診、電話等形式定期隨訪，每3個月隨訪1次。隨訪截至2019年4月或患兒死亡，記錄患兒生存時間，計算5年總體生存率。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血單個核細胞WT1基因表達比較 觀察組與對照組外周血單個核細胞WT1基因相對表達量分別為7.16±2.23、0.36±0.12。觀察組外周血單個核細胞WT1基因相對表達量明顯高于對照組(t=19.231，P<0.01)。

2.2 外周血單個核細胞WT1基因表達與B-ALL患兒臨床病理特征的關(guān)系 外周血單個核細胞WT1基因相對表達量與B-ALL患兒年齡、流式亞型、危險程度有關(guān)(P均<0.05)，而與B-ALL患兒性別、染色體核型、發(fā)病狀態(tài)和WBC計數(shù)無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 外周血單個核細胞WT1基因表達與B-ALL患兒臨床病理特征的關(guān)系

2.3 外周血單個核細胞WT1基因表達與B-ALL患兒預(yù)后的關(guān)系 至隨訪截至日期或患兒死亡，共隨訪2～60個月，中位隨訪時間37個月，隨訪期間死亡18例，無失訪病例。

以外周血單個核細胞WT1基因相對表達量的均數(shù)7.16為臨界值，將B-ALL患兒分為WT1基因高表達者42例、低表達者41例。WT1基因高表達者5年總生存率為69.0%(29/42)，WT1基因低表達者為87.8%(36/41)。WT1基因高表達者5年總生存率低于WT1基因低表達者(χ2=4.142，P<0.05)。

3 討論

ALL是兒童時期最常見的惡性腫瘤，主要與B系或T系淋巴祖細胞惡性增殖有關(guān)。兒童ALL以B-ALL最常見，約占80%[9]。B-ALL的特征是惡性增殖的原始或未成熟B淋巴細胞在骨髓內(nèi)聚集并抑制骨髓正常的造血功能，同時可侵犯肝、脾、淋巴結(jié)等髓外組織，引起肝脾腫大、貧血等臨床癥狀。全身化療是目前B-ALL最主要的治療方式，雖然多數(shù)患兒經(jīng)全身化療后緩解，但仍有部分患兒不緩解或化療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)[10]。因此，進一步深入研究B-ALL發(fā)生、發(fā)展確切的分子機制，尋找新的分子診斷標(biāo)志物和治療靶點具有重要意義。

WT1基因定位于染色體11p13區(qū)域，其編碼產(chǎn)生的WT1蛋白具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子作用，通過其C末端的DNA結(jié)合區(qū)和N末端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)與目標(biāo)DNA結(jié)合，激活或抑制下游靶基因表達，從而在神經(jīng)系統(tǒng)和心、肝、腎等重要器官的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，WT1基因在肺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤等實體腫瘤細胞中高表達，并通過調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡等，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。在體外細胞實驗中，通過shRNA敲低WT1基因表達能夠誘導(dǎo)線粒體損傷，抑制腫瘤細胞生長[11]。在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，WT1基因主要通過調(diào)控造血細胞發(fā)育通路上重要基因的表達，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。WT1基因在兒童B-ALL中可能發(fā)揮同樣的調(diào)控作用。因此，WT1基因表達可能有助于兒童B-ALL的分子診斷、靶向治療和預(yù)后評估。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組外周血單個核細胞WT1基因相對表達量明顯高于對照組，其機制可能與B-ALL發(fā)生時WT1基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制異常有關(guān)。有研究表明，腫瘤發(fā)生時miR-1720表達降低，導(dǎo)致其不能結(jié)合至WT1基因的3′非編碼區(qū)，從而使WT1基因表達增加，繼而促進腫瘤細胞的惡性增殖和遷移[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外周血單個核細胞WT1基因相對表達量與B-ALL患兒年齡、流式亞型、危險程度有關(guān)，而與B-ALL患兒性別、染色體核型、發(fā)病狀態(tài)和WBC計數(shù)無關(guān)。其中，年齡≤2歲的B-ALL患兒外周血單個核細胞WT1基因相對表達量高于>2歲的B-ALL患兒，表明WT1基因表達在B-ALL患兒中存在明顯的年齡差異，其原因尚不清楚，可能與不同年齡B-ALL患兒具有不同的分子特征有關(guān)，如年齡較小的B-ALL患兒WT1、MBNL1、ZEB2等基因突變或基因融合現(xiàn)象普遍存在，而年齡較大的B-ALL患兒DNMT3A、TP53等基因突變更為常見[13]。B-ALL流式亞型為Com-B-ALL患兒外周血單個核細胞WT1基因相對表達量明顯低于流式亞型為Pro-B-ALL、Pre-B-ALL患兒，且流式亞型為Pre-B-ALL患兒WT1基因表達低于流式亞型為Pro-B-ALL患兒，這可能與其分子特征或組織分化程度不同有關(guān)。在B-ALL腫瘤微環(huán)境中，免疫抑制性細胞因子，如TGF-β等，能夠激活下游細胞信號傳導(dǎo)，抑制腫瘤細胞分化；同時，促進WT1基因啟動子區(qū)甲基化，繼而抑制WT1基因表達[14,15]。本研究通過分析不同危險分級患兒WT1基因表達差異發(fā)現(xiàn)，高危B-ALL患兒外周血單個核細胞WT1基因相對表達量明顯高于中危、標(biāo)危B-ALL患兒，其機制可能與高危B-ALL患兒多伴有BCR/ABL融合基因表達增加有關(guān)。BCR/ABL融合基因作為一種癌基因，能夠促進WT1基因表達，故WT1基因異常高表達可作為評估B-ALL患兒存在高危風(fēng)險的指標(biāo)之一[16]。

有研究表明，化療后微小殘留病灶與血液系統(tǒng)腫瘤患者預(yù)后密切相關(guān)，化療后微小殘留病灶越多，復(fù)發(fā)風(fēng)險越高，患者預(yù)后越差[17]。既往研究證實，WT1基因可作為監(jiān)測AML患兒微小殘留病灶的有效指標(biāo)之一[18]，但其用于監(jiān)測B-ALL患兒微小殘留病灶尚存在爭議。本研究中，WT1基因高表達者5年總生存率低于WT1基因低表達者，提示W(wǎng)T1基因高表達可能與B-ALL患兒預(yù)后不良有關(guān)，其原因可能是WT1基因表達增加能夠促進腫瘤細胞的惡性增殖、向髓外組織侵犯等，從而促進腫瘤進展，導(dǎo)致B-ALL患兒預(yù)后不良[19]。因此，WT1基因有可能成為B-ALL患兒預(yù)后評估的有效指標(biāo)之一。

綜上所述，B-ALL患兒外周血單個核細胞WT1基因表達升高，其異常表達與患兒年齡、流式亞型、危險程度和預(yù)后有關(guān)。WT1基因有可能成為B-ALL分子診斷、靶向治療和預(yù)后評估的指標(biāo)之一。