張晶，李慧，楊香山，張曉瑩，門康，徐保群

1 山東省立第三醫(yī)院，濟(jì)南250031；2 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第970醫(yī)院

近年來，乳腺癌的發(fā)病率不斷上升，并呈年輕化趨勢，已成為威脅女性健康的主要惡性腫瘤之一[1]。乳腺癌是一種具有高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，即使術(shù)后規(guī)律接受化療、放療或內(nèi)分泌治療，仍有部分患者無法獲得滿意療效[2]，這表明傳統(tǒng)治療方法存在一些無法避免的局限性。目前，臨床上正積極探索一種新的治療模式，即精準(zhǔn)個體化靶向治療。但除了人表皮生長因子受體2(HER2)和乳腺癌易感基因外，尚無更多達(dá)成共識的治療靶點(diǎn)。因此，深入研究乳腺癌更多有效的精準(zhǔn)個體化治療所需驅(qū)動基因或作用靶點(diǎn)具有重要意義。SOX基因家族是一類由SRY相關(guān)基因構(gòu)成的基因家族，其編碼的SOX蛋白是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。Grimm等[3]認(rèn)為，SOX蛋白在介導(dǎo)或促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展過程中具有重要作用。SOX11蛋白作為SOX蛋白中的一員，近年來其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用開始受到關(guān)注[4]。但目前國內(nèi)外鮮見SOX11蛋白與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的報道。為此，本研究觀察了乳腺癌組織SOX11蛋白表達(dá)變化，并分析其表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月～2017年12月山東省立第三醫(yī)院收治的乳腺癌患者145例。所有患者經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合乳腺癌診斷，病理類型為浸潤性乳腺癌；②初診，女性；③接受乳腺癌根治術(shù)、乳腺癌改良根治術(shù)或保乳手術(shù)+淋巴結(jié)清掃術(shù)治療；④術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療；⑤臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非浸潤性乳腺癌、浸潤性乳腺癌復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；②合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重功能不全或其他部位惡性腫瘤者；③有乳腺癌家族史者；④臨床病理資料不完整者?；颊吣挲g28～92歲、中位年齡52歲，其中≤45歲41例、>45歲104例；腫瘤直徑：≤2 cm 39例、>2 cm 106例；組織學(xué)分級[5]：Ⅰ、Ⅱ級100例，Ⅲ級45例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移73例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例；激素受體表達(dá)[6]：雌激素受體(ER)陽性107例、陰性38例，孕激素受體(PR)陽性87例、陰性58例；HER2表達(dá)[7]：0～2+ 133例，3+ 12例；臨床病理分型[8]：Luminal型110例，三陰型15例，HER2陽性型20例。本研究經(jīng)山東省立第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 SOX11蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化PV-9000兩步法。取手術(shù)切除的乳腺癌組織及其配對的周圍正常乳腺組織(距腫瘤組織邊緣≥5 cm，且經(jīng)組織病理檢查證實為正常乳腺組織)，在離體30 min內(nèi)經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋，3～4 μm厚連續(xù)切片。切片經(jīng)60 ℃烤片30 min，4 ℃冰箱保存。染色前經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，高壓修復(fù)抗原，自然冷卻至室溫，3% H2O2室溫孵育以滅活內(nèi)源性過氧化物酶；PBS沖洗3 min×3次，滴加SOX11蛋白一抗，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3 min×3次，滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，37 ℃孵育20 min；PBS沖洗3 min×3次，滴加增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠IgG聚合物，37 ℃孵育20 min；PBS沖洗3 min×3次，DAB顯色5～8 min，自來水充分沖洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化、氨水返藍(lán)、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。用蒸餾水代替一抗作為陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照。

采用雙盲法由2位病理科主治醫(yī)師獨(dú)立閱片。SOX11蛋白陽性染色定位于細(xì)胞核，呈淺黃色至棕褐色。每張切片隨機(jī)選取10個100倍視野，評估染色強(qiáng)度，計算陽性細(xì)胞比例。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞比例評分標(biāo)準(zhǔn)：無陽性細(xì)胞為0分，≤10%為1分，>10%～50%為2分，>50%～80%為3分，>80%為4分。以染色強(qiáng)度評分和陽性細(xì)胞比例評分綜合評定陽性表達(dá)，二者評分乘積≥1為SOX11蛋白陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與周圍正常乳腺組織SOX11蛋白表達(dá)比較 乳腺癌組織SOX11蛋白陽性表達(dá)45例(31.03%)，周圍正常乳腺組織未見SOX11蛋白陽性表達(dá)。乳腺癌組織SOX11蛋白陽性表達(dá)率高于周圍正常乳腺組織(P<0.05)。

2.2 乳腺癌組織SOX11蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，2018年全球新發(fā)乳腺癌約210萬例，死亡約63萬例[1]。我國乳腺癌的發(fā)病率已步入快速增長期，每年以3%～4%速度持續(xù)上升[9]，已成為威脅女性健康的重要疾病之一。近年隨著生物技術(shù)和基因技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌的治療模式已從過去的手術(shù)治療+術(shù)后放化療發(fā)展到精準(zhǔn)個體化治療，即根據(jù)不同患者腫瘤的生物學(xué)特點(diǎn)制定最佳的綜合治療方案，如適用于激素受體陽性患者的內(nèi)分泌治療、適用于HER2擴(kuò)增患者的靶向治療等，明顯提高了乳腺癌患者的生存率。我國的一項超大樣本量研究顯示，乳腺癌5年生存率已從2003年的71.2%提高到2015年的83.2%[10]。但乳腺癌的高度異質(zhì)性和耐藥性仍是目前無法攻克的難題。隨著二代測序技術(shù)和基因組學(xué)的快速發(fā)展，探索乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的驅(qū)動基因和關(guān)鍵分子，成為當(dāng)前乳腺癌臨床研究新的方向。

表1 乳腺癌組織SOX11蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

SOX基因家族是一類由SRY相關(guān)基因構(gòu)成的基因家族，可編碼二十多種轉(zhuǎn)錄因子，能夠參與調(diào)控細(xì)胞分化、器官發(fā)生等過程。在生理狀態(tài)下，SOX基因表達(dá)和沉默受到嚴(yán)格調(diào)控，但其在惡性腫瘤中經(jīng)常出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)或下調(diào)[11，12]。已有研究證實，在乳腺腫瘤中SOX基因和蛋白異常表達(dá)[13]。SOX11基因是SOX基因家族成員之一，定位于人染色體2p25.3，屬于SOX C亞族，是一個與胚胎發(fā)育及細(xì)胞增殖、分化、凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。近年來，SOX11基因在乳腺癌中的作用開始受到關(guān)注。Shepherd等[4]通過比較多種轉(zhuǎn)錄因子在基底樣乳腺癌(BLBC)與非基底樣乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，在BLBC細(xì)胞中篩選出33種表達(dá)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子，然后通過其對BLBC細(xì)胞生長的重要性進(jìn)行二級篩選，發(fā)現(xiàn)有8種轉(zhuǎn)錄因子對3種BLBC細(xì)胞中至少2種的增殖是必需的，而SOX11蛋白對BLBC細(xì)胞的影響最大，抑制SOX11表達(dá)會抑制全部3種BLBC細(xì)胞的增殖。因此，SOX11蛋白有可能是BLBC亞型細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并且SOX11蛋白高表達(dá)還是乳腺癌患者低存活率的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。Oliemuller等[14]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)乳腺導(dǎo)管內(nèi)原位癌(DCIS)細(xì)胞SOX11蛋白表達(dá)，可導(dǎo)致其體外侵襲能力增強(qiáng)、體內(nèi)浸潤性病變較早形成，提示SOX11蛋白能夠促進(jìn)DCIS進(jìn)展為乳腺浸潤性癌。Zvelebil等[15]通過RNA干擾技術(shù)沉默乳腺癌細(xì)胞中SOX11基因表達(dá)，可導(dǎo)致裂解的Caspase-3增多，提示SOX11基因敲除后細(xì)胞凋亡速度加快。Ding等[16]研究顯示，SOX C亞族蛋白在三陰型乳腺癌中異常過表達(dá)，其異常過表達(dá)與患者較差的生存率有關(guān)，特別是SOX11蛋白表達(dá)增加被認(rèn)為是BLBC細(xì)胞增殖和遷移必需的轉(zhuǎn)錄因子，而在乳腺癌其他亞型中并未發(fā)現(xiàn)此特征。但Liu等[17]研究認(rèn)為，SOX11蛋白在正常乳腺組織中不表達(dá)，在乳腺癌組織中高表達(dá)，并且乳腺癌組織SOX11蛋白高表達(dá)者腫瘤體積較小、臨床分期較早、生存時間更長，故認(rèn)為SOX11蛋白高表達(dá)能夠抑制乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織SOX11蛋白陽性表達(dá)率高于周圍正常乳腺組織，與Liu等[17]研究結(jié)果一致，提示SOX11蛋白在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Liu等[17]研究還發(fā)現(xiàn)，SOX11蛋白高表達(dá)可抑制乳腺癌進(jìn)展，其高表達(dá)與患者預(yù)后良好有關(guān)。由于時間所限，本研究未能對這些患者進(jìn)行長期隨訪，SOX11蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究驗證。前期通過查詢TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，SOX11蛋白在三陰型乳腺癌和HER2陽性型乳腺癌中表達(dá)明顯高于Luminal型乳腺癌。由于三陰型乳腺癌和HER2陽性型乳腺癌的臨床病理特征相近，本研究這兩種類型乳腺癌病例數(shù)較少，故合并統(tǒng)計分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三陰型乳腺癌和HER2陽性型乳腺癌SOX11蛋白陽性表達(dá)明顯高于Luminal型乳腺癌。本研究還發(fā)現(xiàn)，ER、PR陰性者SOX11蛋白陽性表達(dá)明顯高于ER、PR陽性者，HER2表達(dá)3+者SOX11蛋白陽性表達(dá)明顯高于HER2表達(dá)0～2+者，這與臨床病理分型的統(tǒng)計結(jié)果是一致的。由此推測，SOX11蛋白有可能是三陰型乳腺癌和HER2陽性型乳腺癌的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和潛在治療靶點(diǎn)。由于本研究中HER2陽性型乳腺癌是基于蛋白水平的HER2陽性表達(dá)，其真實的基因擴(kuò)增狀態(tài)還需要原位雜交技術(shù)進(jìn)一步驗證，從而更精確分組。此外，本研究納入的三陰型乳腺癌和HER2陽性型乳腺癌病例數(shù)較少，今后需要增加樣本量并進(jìn)行長期隨訪和體外實驗，從而進(jìn)一步探索SOX11蛋白在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

綜上所述，乳腺癌組織SOX11蛋白過表達(dá)；SOX11蛋白過表達(dá)可能參與三陰型乳腺癌和HER2陽性型乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。