吳 瓊，林慧晶，徐兩蒲，孫 艷，林 多，陳冠楠*

(1.醫(yī)學(xué)光電科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建省光子技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建師范大學(xué)光電與信息工程學(xué)院， 福州350007； 2.福建省婦幼保健院， 福州 350001)

DNA作為遺傳物質(zhì)的載體，攜帶了豐富的人體信息，是一種非常重要的生物分子。大量研究發(fā)現(xiàn)，DNA在疾病診斷治療、刑偵學(xué)及法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域都扮演了十分重要的角色[1-4]。醫(yī)生通過(guò)DNA的檢測(cè)，可獲取大量的人體健康狀況信息，為臨床診斷(特別是癌癥診斷)的治療方案確定及預(yù)后等，提供有效的判斷依據(jù)。目前，DNA檢測(cè)方法主要包括聚合酶鏈反應(yīng)和微陣列技術(shù)，但此類方法通常需要熒光標(biāo)記、存在成本較高、程序和檢測(cè)流程復(fù)雜、DNA分子內(nèi)在信息極易丟失、樣品無(wú)法重復(fù)利用等缺點(diǎn)[5]。

1928年，印度科學(xué)家Raman等[6]發(fā)現(xiàn)拉曼散射效應(yīng)，證明該現(xiàn)象產(chǎn)生的頻率變化，均取決于散射物體自身的特性，可以產(chǎn)生具有“指紋”特性的拉曼光譜。在此基礎(chǔ)上，拉曼光譜技術(shù)已經(jīng)能夠獲得許多生物大分子的結(jié)構(gòu)信息，例如：脂肪、DNA、蛋白質(zhì)、核糖、脫氧核糖、各種碳水化合物、染色體病毒等[7]。拉曼光譜以其精細(xì)的分辨能力、所需樣品量少等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到迅速的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者更是將該技術(shù)運(yùn)用于檢測(cè)人體各個(gè)部位[8-17]。但是，拉曼光譜技術(shù)仍存在一些無(wú)法克服的短板。由于拉曼散射的截面僅有10-30～10-25cm-1，造成了極弱拉曼散射信號(hào)和極高生物分子的熒光信號(hào)。因此，拉曼光信號(hào)常常淹沒(méi)在噪聲中，使得拉曼光譜技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展大大受限[18]。直到1974年，F(xiàn)leischman等[19]在電化學(xué)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了表面增強(qiáng)拉曼散射現(xiàn)象，拉曼信號(hào)得到了大大的增強(qiáng)，這種局面才有了轉(zhuǎn)機(jī)。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface enhanced Raman scattering,SERS)是指分子吸附在具有納米級(jí)粗糙度的金屬表面，拉曼散射信號(hào)可以得到極大增強(qiáng)的現(xiàn)象。SERS增強(qiáng)機(jī)理主要來(lái)自[20-21]：1)電磁場(chǎng)增強(qiáng)包括表面等離激元共振、尖端避雷針效應(yīng)、鏡像場(chǎng)增強(qiáng)；2)化學(xué)增強(qiáng)主要包括金屬-分子間電荷轉(zhuǎn)移、表面絡(luò)合物表面活性位。研究表明，電磁場(chǎng)增強(qiáng)的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)大于化學(xué)增強(qiáng)，而電磁場(chǎng)增強(qiáng)主要來(lái)自于表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)，即金屬中的自由電子在光電場(chǎng)下集體發(fā)生了振蕩效應(yīng)。SERS的出現(xiàn)，克服了常規(guī)拉曼的固有缺陷，極大拓展了拉曼光譜的應(yīng)用。近40年來(lái)，科學(xué)家進(jìn)一步研究表明吸附在或者非常接近特定粗糙金屬(例如：金、銀、銅)表面的待測(cè)物質(zhì)的拉曼信號(hào)會(huì)被大大提高(約為1013～1015倍)，并且能夠抑制熒光的產(chǎn)生，使表面拉曼增強(qiáng)光譜技術(shù)成為一種十分有潛力的檢測(cè)方式[22-24]。

隨著光學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)SERS技術(shù)有希望克服當(dāng)前DNA檢測(cè)存在的缺陷[1]。因此，研究人員致力將表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用于DNA檢測(cè)，力求發(fā)展一種快速、無(wú)損、簡(jiǎn)便、檢測(cè)限度低的檢測(cè)方法。目前，DNA-SERS檢測(cè)主要有兩種方式，一種方法是使用標(biāo)簽分子修飾DNA，來(lái)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目標(biāo)DNA的目的。另一種是無(wú)需加入標(biāo)記分子，進(jìn)行非標(biāo)記的DNA快速檢測(cè)。本文主要介紹了非標(biāo)記DNA-SERS檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)程及本課題組的初步研究進(jìn)展。

1 標(biāo)記DNA-SERS檢測(cè)

標(biāo)記法是將目標(biāo)分子通過(guò)吸附、雜交等作用，與有一定強(qiáng)度且易分辨的拉曼標(biāo)記物相連，后通過(guò)檢測(cè)拉曼標(biāo)記分子，間接達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)分子的目的。SERS標(biāo)記分子能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈的SERS信號(hào)，并易于修飾生物分子的一些物質(zhì)。這種標(biāo)記物常以金或銀納米顆粒為增強(qiáng)基底，同時(shí)利用可產(chǎn)生SERS信號(hào)的染料分子在納米粒子表面修飾。2009年，MacAskill等[25]已經(jīng)證明了一種新的SERS檢測(cè)方法，該方法是將與目標(biāo)DNA結(jié)合力更強(qiáng)、且用染料標(biāo)記的探針與目標(biāo)DNA雜交后，致使探針SERS信號(hào)降低，以此證明待測(cè)物中有目標(biāo)DNA的存在。與未修飾的標(biāo)記DNA探針相比，該方法實(shí)現(xiàn)了精確匹配和錯(cuò)配間的更大區(qū)分。Mhairi等[26]將TaqMan檢測(cè)技術(shù)與SERS技術(shù)相結(jié)合，形成一種全新的DNA檢測(cè)方式。并且，為了證明該檢測(cè)方式可用于臨床，該研究小組利用這項(xiàng)技術(shù)檢測(cè)基因組MRSA株內(nèi)的mecA基因，并將金黃色葡萄球菌株作為對(duì)照試驗(yàn)。試驗(yàn)證明，這種新的檢測(cè)方法可用于生物檢測(cè)。同時(shí)，該小組通過(guò)銀納米顆粒靜電相互作用的差異，證明了幾種標(biāo)記DNA染料親和力的差異。結(jié)果表明，單鏈DNA、雙鏈DNA和游離染料標(biāo)簽的SERS強(qiáng)度存在明顯差異，并證明表面引力是由于核苷酸的靜電電荷引起，而非來(lái)自SERS染料的親和力。該試驗(yàn)進(jìn)一步證明，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)條件和序列組成的優(yōu)化，可以在較低的DNA濃度下實(shí)現(xiàn)高精度的DNA序列檢測(cè)[27]。2014年，Tara[28]研究小組首次報(bào)道了功能化銀納米粒子和鍍銀磁性納米粒子組合成“三明治”模型，并在穩(wěn)定夾層中進(jìn)行DNA檢測(cè)，能同時(shí)識(shí)別多種目標(biāo)分子。這種方法將目標(biāo)識(shí)別與磁性捕獲相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了樣品低濃度檢測(cè)，有極高的靈敏度。2017年Su[29]小組研究出了多色金銀納米蘑菇，是一種即用型SERS探針，可用于超敏感和多路DNA/miRNA檢測(cè)。其特點(diǎn)是制備過(guò)程簡(jiǎn)便，易于合成，無(wú)需進(jìn)一步的生物功能化，為實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)的生化診斷和細(xì)胞成像創(chuàng)造了極大的可能。2018年，Pala等[30]介紹了12種用于SERS-DNA檢測(cè)的新型寡核苷酸功能化納米粒子，研究表明12種染料可以獨(dú)立表達(dá)出特異信號(hào)，為實(shí)現(xiàn)多重復(fù)路檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

近年來(lái)，有許多研究學(xué)者將PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增技術(shù)與DNA檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，研發(fā)出了新的檢測(cè)方法。在2016年，Eugene等[31]對(duì)循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)進(jìn)行研究，他們利用了標(biāo)準(zhǔn)PCR的靈敏度優(yōu)勢(shì)與SERS技術(shù)的多路復(fù)用特點(diǎn)，檢測(cè)出重要的黑色素瘤突變，并采用該方式測(cè)定了血清樣品中的基因型細(xì)胞系和ctDNA，證實(shí)了此法的可行性。2018年，李小舟[32]小組將含有目標(biāo)突變基因的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，用熒光標(biāo)簽標(biāo)記互補(bǔ)序列上的DNA鏈，再運(yùn)用SERS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)分析，獲得了結(jié)直腸癌患者的基因突變率，并與臨床檢測(cè)所得的結(jié)果一致。

2 非標(biāo)記DNA-SERS檢測(cè)

2.1 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展

為了獲取表面增強(qiáng)拉曼光譜，必須要使分析物靠近或吸附在貴金屬表面。使用非標(biāo)記SERS技術(shù)檢測(cè)，常需挑選一個(gè)適當(dāng)?shù)脑鰪?qiáng)基底，獲得DNA堿基的SERS信號(hào)[33]。其優(yōu)勢(shì)在于：不需要引入外源性的拉曼標(biāo)記物,不會(huì)對(duì)待測(cè)DNA的原生信號(hào)產(chǎn)生干擾。

早在2006年，Bell和Narayana[33]已經(jīng)嘗試?yán)帽砻嬖鰪?qiáng)拉曼技術(shù)對(duì)低濃度無(wú)標(biāo)記單核苷酸進(jìn)行檢測(cè)，獲取DNA分子與不同銀膠作用后的光譜，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2008年，Aoune等[1]報(bào)道了如何成功獲得高質(zhì)量的單鏈和雙鏈DNA-SERS光譜。這種方法是將納米金殼SERS基底與DNA結(jié)合，使重現(xiàn)性得到了顯著的提高。這是單鏈DNA的熱解和雙鏈DNA雜交所帶來(lái)的高規(guī)律性和高控制性的電磁增強(qiáng)。而后，該小組又提出了一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的簡(jiǎn)單、無(wú)標(biāo)記的DNA雜交檢測(cè)方法[34]。試驗(yàn)證明，將探針DNA序列中的腺嘌呤換成人工合成的2-AP堿基，仍然可以檢測(cè)到腺嘌呤互補(bǔ)堿基的SERS信號(hào)，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)含有腺嘌呤的目標(biāo)DNA。2011年，Papadopoulou和Bell[35]，通過(guò)硫醇連接DNA序列和金納米顆粒表面，此時(shí)DNA站立在納米顆粒表面，使得腺嘌呤的SERS信號(hào)得到優(yōu)先增強(qiáng)。之后，利用堿基的非特異性結(jié)合使DNA重新定位，可降低這種效應(yīng)。這種重定向?qū)е聫?qiáng)度改變的現(xiàn)象，被用于分子信標(biāo)雜交的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)。研究表明，利用DNA堿基中的固有信號(hào)，進(jìn)行無(wú)標(biāo)記SERS檢測(cè)，在生物診斷中具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。2015年，Marks等[36]設(shè)計(jì)了一個(gè)利用功能性納米粒子檢測(cè)小型血液生物標(biāo)記物的SERS檢測(cè)平臺(tái)。試驗(yàn)中適當(dāng)調(diào)整納米探針的參數(shù)，則能實(shí)現(xiàn)靈敏度、范圍、重現(xiàn)性、顆粒穩(wěn)定性以及與生物識(shí)別分析的整體控制?？偟膩?lái)說(shuō)，這是一種可控的SERS分析平臺(tái)，用適配體連接SERS活性納米粒子，組裝檢測(cè)小的毒素分子。同年，Sun等[37]構(gòu)建了一種新型的納米通道傳感平臺(tái)，該裝置簡(jiǎn)單易行，可在受限的三維納米空間實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記、超靈敏、高特異性的DNA檢測(cè)。Xu等[4]利用碘化鉀修飾Ag納米基底，并在接近人體生理?xiàng)l件的環(huán)境中，獲取了單鏈和雙鏈核苷酸的高重現(xiàn)性的SERS信號(hào)。值得注意的是，碘化層不僅能夠清除Ag納米粒子表面的雜質(zhì)，還能防止Ag納米粒子表面與DNA直接發(fā)生相互作用，確保獲得高重現(xiàn)性的信號(hào)。并且，該工作證明MgSO4能使帶負(fù)電荷的DNA更有效地吸附，能夠使Ag IMNPs產(chǎn)生聚集，產(chǎn)生較強(qiáng)的SERS信號(hào)。他們認(rèn)為可以將磷酸骨架作為內(nèi)部標(biāo)記，從而使得寡核苷酸的SERS光譜標(biāo)準(zhǔn)化，以除去外部因素對(duì)光譜的影響。2018年，Han小組[38]將表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)與微流控技術(shù)結(jié)合，研發(fā)了一種基于銀納米顆粒(AgNPs)和氧化石墨烯(GO)簡(jiǎn)便的激光刻劃的生物芯片，該芯片可重復(fù)用于DNA檢測(cè)。AgNPs@GO復(fù)合膜的可編程激光刻劃芯片，通過(guò)將復(fù)合材料剝離成分層多孔結(jié)構(gòu)，使由石墨烯支撐的AgNPs組成的靈敏SERS通道直接形成所需圖案。DNA和石墨烯之間的非共價(jià)相互作用介導(dǎo)了DNA序列可控的捕獲和釋放，由此，在該生物芯片上可重復(fù)進(jìn)行SERS檢測(cè)，有望對(duì)遺傳疾病診斷提供幫助。2019年，Li等[39]開(kāi)發(fā)了一種新的非標(biāo)記DNA檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)單鏈DNA。他們引入一種新的界面劑二氯甲烷，并將其作為內(nèi)標(biāo)分子，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同鏈長(zhǎng)單鏈DNA的高靈敏檢測(cè)，并且突破了雙鏈DNA的檢測(cè)局限。此外，該方法已被證明能夠識(shí)別具有單堿基變化的長(zhǎng)鏈DNA中的基因突變，在快速遺傳分析方面具有很大的臨床診斷潛力。

2.2 本課題組研究進(jìn)展

福建師范大學(xué)項(xiàng)目組將DNA-SERS檢測(cè)用于鼻咽癌的早期診斷，并對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，早期鼻咽癌、晚期鼻咽癌、正常鼻咽組織DNA的診斷準(zhǔn)確率分別為87.9%，86.8%和92.3%。該項(xiàng)探索性研究證明了可將SERS測(cè)試?yán)糜诮M織中提取的DNA，此方法有潛力成為鼻咽癌早期篩查的一種新的方式[40]。本課題組的劉秀杰等[41]發(fā)明了一種DNA鏈作為信號(hào)開(kāi)關(guān)檢測(cè)重金屬離子的方法：利用銀鏡反應(yīng)制作的玻片作為表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)檢測(cè)的基底，再通過(guò)硫醇鍵將用Cy5標(biāo)記的DNA鏈連接在還原有銀膜的基底上，用DNA鏈作為拉曼信號(hào)的開(kāi)關(guān)，以此來(lái)間接表明待測(cè)介質(zhì)中是否存在重金屬離子汞(Hg2+)。通過(guò)鍍銀的玻片做為重金屬檢測(cè)的基底，使得SERS增強(qiáng)效果和檢測(cè)的靈敏度得到了大大的提升，并且具有極好的重復(fù)性。林多等[42]利用金屬羰基化合物的光譜特性，設(shè)計(jì)了一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)的比率檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)鼻咽癌患者血液中游離態(tài)的EB病毒DNA進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)中主要利用錸羰基化合物(Re-CO)作為DNA探針，另外一種鋨羰基化合物(Os-CO)則被鑲嵌于SERS基底中作為DNA檢測(cè)內(nèi)標(biāo)，最后在基底表面修飾上鏈霉親和素，用來(lái)捕獲帶有生物素的游離態(tài)目標(biāo)DNA。由于這兩種羰基化合物的拉曼信號(hào)都處于生物分子的指紋區(qū)外(靜默區(qū))，不會(huì)受其他生物分子影響，因此該文章提出的方法有望對(duì)血液中的游離DNA進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測(cè)。之后，他們利用光譜信號(hào)處于1 800～2 200 cm-1的羰基化合物(Os-SCO和Re-SCO)作為SERS探針，實(shí)現(xiàn)低濃度DNA檢測(cè)。此外，還將SERS探針(Re-SCO)裝備在包裹有介孔硅的納米棒材料中，在光的刺激下可將該探針大量釋放到SERS基底上獲得其拉曼信號(hào)，由此實(shí)現(xiàn)SERS信號(hào)的二次放大。研究表明，利用該技術(shù)能對(duì)DNA實(shí)現(xiàn)可靠以及超靈敏的檢測(cè)，這對(duì)于發(fā)展基于SERS的液體活檢技術(shù)具有重要意義[43]。

基于以上的文獻(xiàn)探索，本課題組也對(duì)單鏈DNA檢測(cè)展開(kāi)了試驗(yàn)研究，試驗(yàn)流程如圖1所示。

圖1 單鏈DNA檢測(cè)流程圖Fig.1 Schematic forsingle-strand DNA detection

圖2 SERS光譜圖Fig.2 SERS spectra(a)純銀膠的拉曼背景信號(hào)；(b)單鏈DNA的SERS光譜(a)The background signal of pure silver colloid;(b)SERS spectrum of single-strand DNA

表1 DNA表面增強(qiáng)拉曼光譜峰位歸屬[1,4,31-33,38]Tab.1 The peak positions and tentative assignment of major vibrational bands in DNA

Raman bands(cm-1)Assignmentsa683G735A, ring breathing792C, T, PO2-, skeleton stretching1 092PO2-, symmetric stretching1 222 A, C, or T, ring stretching1 326A1 459CH2, deformation1 555A, G1 629T, C

本試驗(yàn)獲得了單鏈DNA的表面增強(qiáng)拉曼光譜，圖2中b曲線為單鏈DNA的SERS光譜，圖2中a曲線為銀膠的背景信號(hào)。值得注意的是，在單鏈DNA的SERS光譜圖中可以觀察到683、735、792、1 092、1 222、1 326、1 459、1 555以及1 629 cm-1拉曼譜峰(圖2中b曲線)。如表1所示，有很多試驗(yàn)證明這些譜峰可以歸屬于磷酸骨架(PO2-)、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶[1,4,33-35,40]。在今后的研究里，我們希望可以利用SERS技術(shù)對(duì)DNA分子中的生化成分組成及數(shù)量差異進(jìn)行進(jìn)一步的探索。

3 總結(jié)與展望

本文簡(jiǎn)單介紹了國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)DNA檢測(cè)的研究，特別是非標(biāo)記DNA檢測(cè)。SERS的主要優(yōu)點(diǎn)：一是能夠用最少生物樣品進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度甚至可以達(dá)到10-15mol/L；二是利用SERS技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)多重復(fù)路檢測(cè)，同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)物進(jìn)行分析，有利于疾病的診斷和預(yù)后。SERS技術(shù)的優(yōu)勢(shì)恰恰克服了當(dāng)下臨床診斷方法的一些不足，目前，該技術(shù)已被應(yīng)用于真實(shí)的臨床樣本。大量的科研人員致力于發(fā)展一種簡(jiǎn)單、快速的DNA檢測(cè)技術(shù)，希望能夠通過(guò)SERS技術(shù)獲得DNA中的堿基排列順序、堿基突變序列等，從而探索更豐富、更深層的遺傳信息。

綜上所述，SERS技術(shù)在DNA檢測(cè)方面表現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。雖然，在目前的技術(shù)水平和試驗(yàn)條件下，SERS光譜無(wú)法確切表達(dá)出DNA序列中堿基的特定順序，但采用標(biāo)記的SERS檢測(cè)技術(shù)，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA高靈敏度、高特異性的定性甚至定量檢測(cè)。而非標(biāo)記DNA-SERS檢測(cè)技術(shù)，也以其簡(jiǎn)便、快捷、無(wú)損等優(yōu)勢(shì)，成為時(shí)下的研究熱點(diǎn)，有很大的發(fā)展?jié)摿?。相信在不久的將?lái)，非標(biāo)記DNA-SERS檢測(cè)技術(shù)能夠發(fā)展為一種快速、準(zhǔn)確的疾病基因診斷新方法。