熊紅蓮，王茗祎，謝慧嫻，顏倚媚，鐘會(huì)清

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 a.物理與光電工程學(xué)院; b.口腔醫(yī)學(xué)院， 佛山528000；2.華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院, 國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥與光子技術(shù)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510631)

乳腺癌是危害女性生命的主要腫瘤之一，早期診斷和臨床治療可以顯著提高病人的生存率。現(xiàn)有乳腺癌的成像診斷技術(shù)包括鉬靶X射線和超聲影像，但只能檢測(cè)較小的腫塊[1]。傳統(tǒng)的血清腫瘤標(biāo)志物糖類抗原(carbohydrate antigen 153，CA153)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)與乳腺癌抗原(breast cancer antigen 225，BCA225)等雖然可以檢測(cè)到早期的乳腺癌，但特異性和敏感性較低，容易造成誤診和漏診[2,3]。最近，液體活檢已成為一種極具潛力的方法，可早期診斷疾病和監(jiān)測(cè)患者的健康。該方法基于使用各種技術(shù)檢測(cè)人流體循環(huán)中的腫瘤標(biāo)志物，例如：循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)，循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)和外泌體的鑒定和定量。其中，由于外泌體在人體液中的穩(wěn)定存在，分析患者體內(nèi)循環(huán)的外泌體被認(rèn)為是一種創(chuàng)新且有前途的方法，可用于癌癥的早期診斷。外泌體是活細(xì)胞分泌并排泄到胞外的微小囊泡，直徑為40～150 nm[4,5]。外泌體的成分反映了釋放細(xì)胞的組成成分，包括多種蛋白質(zhì)、核酸等成分，以及特異性的 CD9、CD81、CD63、TSG101、HSP70、HSP90和miRNA 等生物分子[6]，可作為疾病診斷的新型標(biāo)志物，是釋放細(xì)胞的“指紋”物。已有研究表明外泌體在乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用[7]。有報(bào)道乳腺癌患者體液中外泌體的數(shù)量增多，其所攜帶的分子與正常乳腺上皮細(xì)胞釋放的外泌體顯著不同，尤其是核酸和蛋白質(zhì)含量明顯增加[7]。

目前外泌體的檢測(cè)方法主要包括透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)，動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS)，納米粒子跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)，流式細(xì)胞儀和蛋白質(zhì)印跡[8,9]。其中，外泌體的TEM檢測(cè)是一項(xiàng)金標(biāo)準(zhǔn)，可以看到囊泡的形態(tài)和大小。但是SEM只能確定其存在，不能鑒別正常和腫瘤來源的外泌體。DLS和NTA也只能提供有關(guān)粒徑和分布的信息。流式細(xì)胞術(shù)既可以分析粒徑，還可以通過細(xì)胞熒光標(biāo)記鑒定外泌體的來源和亞群。但是標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞術(shù)不能檢測(cè)到小于300 nm的顆粒。而蛋白質(zhì)印跡需要破碎外泌體后，間接測(cè)定其表達(dá)的特征蛋白，如四跨膜蛋白(CD9，CD63和CD81)，熱休克蛋白等。因此腫瘤特異性的快速檢測(cè)仍然是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。

拉曼光譜技術(shù)通過分子振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)產(chǎn)生的光譜信號(hào)就可獲得分子的結(jié)構(gòu)和物質(zhì)的成分信息，樣品無(wú)需標(biāo)記。因懸浮在PBS中的外泌體含量極小，拉曼散射效應(yīng)十分微弱，難以獲得清晰的拉曼光譜。增加激光功率并延長(zhǎng)曝光時(shí)間可以增強(qiáng)微弱的拉曼信號(hào)，但激光功率超過10 mW，易燒傷生物學(xué)標(biāo)本[10]。表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)技術(shù)將大量的樣品吸附在粗糙的金屬表面，當(dāng)激光束穿過懸浮膠體時(shí)，不僅可使拉曼信號(hào)增強(qiáng)1013～1014倍,還能夠抑制生物樣品熒光背景[11]。SERS技術(shù)具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)越性能，為外泌體檢測(cè)提供了新的希望。從理論上講，來自各種不同來源的外泌體具有特定功能的生物大分子。這意味著來自各種來源的外泌體具有特定的分子表型，從而反映不同的SERS譜型。因此SERS技術(shù)與外泌體檢測(cè)結(jié)合可區(qū)分不同細(xì)胞來源的外泌體。Park等[12]已經(jīng)報(bào)道了應(yīng)用SERS鑒別肺癌細(xì)胞來源的外泌體和正常細(xì)胞來源的外泌體的可行性。

本研究利用SERS技術(shù)檢測(cè)了從乳腺癌細(xì)胞MCF-7和人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A培養(yǎng)基上清中分離出來的外泌體，探索了SERS技術(shù)在乳腺癌中診斷的應(yīng)用價(jià)值，比對(duì)了MCF-7和MCF-10A細(xì)胞來源的外泌體SERS光譜，同時(shí)篩選出兩種不同細(xì)胞來源外泌體的特征光譜，最后分析特征性光譜的形成原因。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7均購(gòu)于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。表面增強(qiáng)的拉曼材料是納米銀增強(qiáng)基底，購(gòu)于云洋光電(深圳)有限公司。圖1是納米基底的掃描電鏡圖，粗糙的表面可以增加納米材料的表面增強(qiáng)能力。

圖1 納米銀基底的掃描電鏡圖Fig.1 Scan electron microscope image of the silver film substrate

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

正常人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A采用DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%HS、1%青霉素/鏈霉素、0.1%HCl、0.02%EGF、0.1%胰島素、0.01%霍亂毒素),在37 ℃和5% CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到大約70%時(shí)，用PBS對(duì)細(xì)胞洗滌3次，加入無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7在DMEM完全培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清、青霉素100 μg/mL、鏈霉素100 μg/mL)，培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到大約70%時(shí)，用PBS對(duì)細(xì)胞洗滌3次，加入含10%無(wú)外泌體的胎牛血清(Gibco)DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

1.3 培養(yǎng)基中外泌體的分離

本試驗(yàn)采用差速超速離心法從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離外泌體。收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，于4 ℃下轉(zhuǎn)速為1 000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，于4 ℃下轉(zhuǎn)速為2 000 r/min離心20 min，棄沉淀，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，在4 ℃下轉(zhuǎn)速為5 000 r/min離心30 min，棄沉淀，用0.22 μm微濾器過濾，留上清液，之后4 ℃下32 000 r/min超速離心90 min，低速離心獲得的細(xì)胞培養(yǎng)上清液不足時(shí)，用PBS緩沖液補(bǔ)充配平。去上清液，將離心獲得的沉淀用無(wú)菌PBS重懸。再次在4 ℃下32 000 r/min超速離心90 min，去上清液，用100 μL PBS重懸沉淀，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 外泌體的表征

透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM，日本電子株式會(huì)社JEM-1200EX)可視化測(cè)量外泌體大??；納米跟蹤儀(nanoparticle tracking analysis, NTA，Malvern，Nanosight LM 10)跟蹤外泌體，分析其大小和濃度。吸取樣本各10 μL滴加于銅網(wǎng)上，沉淀3 min，濾紙從邊緣處吸去浮液，PBS漂洗后磷鎢酸負(fù)染，常溫干燥5 min，電鏡成像。NTA儀器利用激光光源照射外泌體懸浮液，可觀察到帶有散射光的顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)，并進(jìn)行粒徑計(jì)算，同時(shí)得到整個(gè)體系的粒徑分布信息。用注射器吸取1 mL左右的樣品，然后向樣品池緩慢注入，設(shè)置參數(shù)，獲取粒徑分布結(jié)果。

1.5 SERS測(cè)量和數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)使用雷尼紹公司的顯微共聚焦拉曼光譜儀(Renishaw,inVia,UK)采集SERS數(shù)據(jù)。石英載玻片上置于激光共焦顯微拉曼光譜儀的顯微鏡載物臺(tái)上，納米銀基底置于石英載玻片上，然后將10 μL外泌體溶液滴于干燥的納米銀基底上，液滴消失后，基底表面為濕潤(rùn)狀態(tài)，立即收集表面增強(qiáng)拉曼散射信號(hào)。拉曼信號(hào)采集的光譜范圍為800～1 800 cm-1，激發(fā)波長(zhǎng)為785 nm，采集次數(shù)2次，曝光時(shí)間4 s，激發(fā)光功率約為0.5 mW，以防止功率過大燒傷樣品。所裝備的顯微鏡為萊卡DM2500，物鏡放大倍數(shù)50×。每個(gè)樣品在不同的位置獲得約30個(gè)SERS光譜。每次掃描前，均用硅片的520 cm-1峰進(jìn)行校準(zhǔn)。試驗(yàn)重復(fù)3遍。為了減少不同光譜強(qiáng)度的差異和更好地對(duì)光譜形狀進(jìn)行對(duì)比分析，所有的拉曼信號(hào)采集均在同一條件下進(jìn)行。數(shù)據(jù)定量分析前，采用Vancouver拉曼譜處理軟件對(duì)所有譜線進(jìn)行基線校正及熒光背景扣除。為了便于比較不同外泌體樣品光譜形狀和譜峰的相對(duì)強(qiáng)度，用強(qiáng)度法對(duì)光譜進(jìn)行了歸一化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 MCF-10A來源外泌體和MCF-7來源外泌體外泌體的表征結(jié)果

采用透射電鏡TEM觀察外泌體的大小和形態(tài)；納米跟蹤儀(nanoparticle tracking analysis,NTA)檢測(cè)外泌體的粒徑和濃度。圖2a與圖2b分別為MCF-10A和MCF-7來源外泌體的TEM圖。在鏡下觀察，外泌體分布不均勻，體形態(tài)多變，測(cè)量大小在30～200 nm，脂質(zhì)包膜膜結(jié)構(gòu)完整，大多數(shù)都呈現(xiàn)出典型的杯狀結(jié)構(gòu)，數(shù)個(gè)MCF-7來源外泌體有聚集的現(xiàn)象(圖2b)，這可能與TEM樣品制樣的沉淀過程有關(guān)。然后進(jìn)一步利用NTA分析外泌體的大小和濃度，圖2c為MCF-10A外泌體粒徑圖，可以發(fā)現(xiàn)外泌體主要分布在50～150 nm之間，中位值在130 nm左右，外泌體濃度約為4.8×108particles/mL。MCF-7外泌體粒徑圖可以發(fā)現(xiàn)極少量外泌體分布在40～50 nm之間(圖2d)，主要分布在80～150 nm之間，中位值分布也在130 nm左右，外泌體濃度4.9×108particles/mL。但可以看到有少量的囊泡分布在200～400 nm之間，可能與外泌體的聚集有關(guān)。

圖2 外泌體的表征Fig.2 The characterization of exosomes(a)MCF-10A來源外泌體的透射電鏡圖(TEM)；(b)MCF-7來源外泌體的TEM圖；(c)MCF-10A來源外泌體的納米跟蹤儀(NTA)檢測(cè)結(jié)果圖；(d)MCF-7來源外泌體的NTA檢測(cè)結(jié)果圖(a)TEM image of MCF-10A-derived exosomes;(b)TEM image of MCF-7-derived exosomes; (c)NTA results of MCF-10A-derived exosomes;(d)NTA results of MCF-7-derived exosomes

2.2 吸附于納米銀表面的外泌體的SERS光譜

SERS技術(shù)檢測(cè)得到為正常乳腺細(xì)胞MCF-10A來源外泌體和乳腺癌細(xì)胞MCF-7來源外泌體SERS光譜(圖3)，主要差異反映在其核酸，蛋白質(zhì)，脂類等譜峰的波數(shù)和相對(duì)強(qiáng)度的明顯變化，兩者的拉曼特征峰差異性顯著。MCF-10A外泌體和MCF-7外泌體SERS特征譜分別如圖3a和圖3b所示。由于外泌體包含相同的整體結(jié)構(gòu)和大分子(脂質(zhì)，蛋白質(zhì)，核酸等)，因此在800～1 800 cm-1區(qū)域有共同的拉曼譜峰，858、938、999、1 032、1 318、1 602和1 655 cm-1，其分別歸屬于酪氨酸，脯氨酸和纈氨酸，苯丙氨酸，膠原或者脂類，核酸，酪氨酸和苯丙氨酸，蛋白的酰胺I帶[13]。MCF-10A來源外泌體和MCF-7來源外泌體的特征峰歸屬見表1。

表1 外泌體拉曼光譜譜峰歸屬Tab.1 Band position and assignment of exosomes from 800～1 800 cm-1

2.2.1 核酸分子的譜線的變化

1 031 cm-1譜帶源于核酸分子C- C鍵的拉伸振動(dòng)，1 336 cm-1譜線歸屬于多核苷酸鏈。同時(shí)出現(xiàn)在MCF-7外泌體中的1 031 cm-1，1 336 cm-1處的拉曼峰，再一次證明MCF-7外泌體中的核酸顯著高于MCF-10外泌體。

2.2.2 蛋白質(zhì)分子類譜線的變化

MCF-10A來源的外泌體中蛋白質(zhì)的酰胺I帶特征譜帶位于1 655 cm-1處，而MCF-7來源的外泌體的譜峰頻移到1 642 cm-1處。該峰反映了蛋白質(zhì)構(gòu)象的α-螺旋和β-折疊結(jié)，無(wú)規(guī)則卷曲等特征。MCF-7來源外泌體在1 642 cm-1處的峰強(qiáng)雖無(wú)明顯變化，但位于938 cm-1的肽鏈骨架 C-C鍵振動(dòng)峰卻明顯變?nèi)?。酰胺I帶和肽鏈骨架的特征拉曼峰與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，是研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的靈敏探針。肽鏈骨架峰強(qiáng)相對(duì)于酰胺I帶的減弱會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的無(wú)序性[25]。

在MCF-7外泌體的SERS光譜中還可以清楚地看到酪氨酸譜線由正常乳腺癌上皮細(xì)胞MCF-10A的853 cm-1處頻移到 857 cm-1，歸屬于色氨酸譜帶1 336 cm-1處的強(qiáng)度也有明顯的升高。這些譜線強(qiáng)度的增加表明癌變組織中氨基酸殘基含量增加，成為蛋白質(zhì)拉曼光譜的主要貢獻(xiàn)者。值得注意的是，1 372 cm-1出現(xiàn)在MCF-10A來源外泌體峰譜中，該譜帶的存在說明色氨酸殘基的吲哚環(huán)呈埋藏式。而在MCF-7來源的外泌體中此特征峰消失，這說明氨基酸殘基所處的腫瘤微環(huán)境發(fā)生變化使色氨酸殘基的埋藏式吲哚環(huán)變?yōu)楸┞妒絒26]。

2.2.3 脂類分子譜線的變化

正常乳腺上皮細(xì)胞外泌體中歸屬于脂類的特征譜線位于1 754、1 446和1 318 cm-1，而癌變組織中只觀察到1 318 cm-1處的峰藍(lán)移到1 315 cm-1，且峰發(fā)生了分裂。這些脂類分子可能主要來源于組織中的脂肪，這些譜線消失表明癌變組織中脂肪成分所占比例減少。另外，我們還觀察到在正常MCF-10A來源的外泌體中可見較強(qiáng)的1 372 cm-1(碳水化合物)，但是在MCF-7外泌體譜線卻觀察不到此峰。這可能是癌細(xì)胞的代謝比正常細(xì)胞活躍。

圖3 外泌體的表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)特征光譜Fig.3 The characteristic SERS spectrum of exosomes(a)MCF-10A來源外泌體SERS光譜;(b)MCF-7來源外泌體SERS光譜(a)SERS spectrum of MCF-10A-derived exosomes;(b)SERS spectrum of MCF-7-derived exosomes

3 討論

SERS技術(shù)是一種靈敏度度高、無(wú)標(biāo)記、無(wú)損傷、簡(jiǎn)單快速檢測(cè)物質(zhì)成分的方法，能夠獲得清晰的良惡性細(xì)胞來源外泌體的拉曼特征光譜，從而協(xié)助診斷良惡性細(xì)胞腫瘤。普通的拉曼光譜技術(shù)也有極高的靈敏度，但血清和培養(yǎng)基上清中純化外泌體數(shù)量極少，獲得外泌體的特征譜不夠清晰，難以對(duì)疾病進(jìn)行正確的評(píng)估。我們用SERS技術(shù)檢測(cè)了MCF-10A和MCF-7來源的外泌體，并繪制了800～1 800 cm-1頻移區(qū)段SERS光譜圖。通過分析比對(duì)方式尋找出了腫瘤細(xì)胞MCF-7來源外泌體的特征性拉曼光譜，然后對(duì)特征性光譜的可行性及其物質(zhì)歸屬進(jìn)行匹配。拉曼光譜是物質(zhì)成分的表觀顯示，物質(zhì)成分的變化使拉曼光譜波形數(shù)量和強(qiáng)度的改變以及波峰的頻移[27,28]。核酸、蛋白和脂類是構(gòu)成外泌體表面的主要分子。這些物質(zhì)成分在含量、結(jié)構(gòu)、成分、表觀遺傳學(xué)發(fā)生任何變化，都可能會(huì)引起拉曼光譜的變化，導(dǎo)致SERS特征明顯不同。此前，Joseph等[29]已用SERS技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞與健康人血清和早期胰腺癌病人血清來源的外泌體，獲得了清晰的拉曼特征譜，成功的區(qū)分了不同來源的外泌體。在本研究中，也能觀察到SERS特征光譜明顯的改變。例如，歸屬為雙螺旋DNA骨架磷酸二酯的對(duì)稱伸縮振動(dòng)的拉曼峰，在正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A來源外泌體拉曼光譜的1 067 cm-1處，而乳腺腫瘤細(xì)胞MCF-7來源外泌體特征譜中紅移到1 072 cm-1處，且拉曼峰明顯變寬變高。核酸是關(guān)鍵的遺傳物質(zhì)，核酸任何成分的增加或減少或結(jié)構(gòu)構(gòu)象的改變代表細(xì)胞新陳代謝和基因完整性發(fā)生變化。MCF-7中核酸的明顯增加表明了腫瘤細(xì)胞大量分裂繁殖。另外，相比MCF-10A外泌體，MCF-7中歸屬蛋白質(zhì)肽鏈骨架938 cm-1處的拉曼峰變?nèi)?，表明了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的無(wú)序性。癌細(xì)胞旺盛的代謝消耗了大量的脂類，其分泌的外泌體的脂類拉曼峰也顯著變?nèi)?。良惡性?xì)胞外泌體富含的蛋白質(zhì)、核酸(DNA或RNA)及脂類的變化都會(huì)引起拉曼光譜的變化能夠協(xié)助鑒別良惡性腫瘤[30]。

本研究建立了一種基于外泌體和SERS技術(shù)的快速無(wú)損檢測(cè)方法，外泌體中的成分反映了釋放細(xì)胞的組成成分，通過分析比對(duì)SERS拉曼光譜，可用于區(qū)分正常和腫瘤來源的外泌體，進(jìn)而協(xié)助診斷早期腫瘤。這項(xiàng)研究表明SERS技術(shù)可為癌癥的早期檢測(cè)和診斷提供了一種快速、無(wú)標(biāo)記和無(wú)損的方法。

但該試驗(yàn)和結(jié)果也有一定的局限性。首先我們僅僅選取乳腺上皮細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞來源的外泌體做比較，想要得更客觀的結(jié)果，需要選擇多種乳腺癌細(xì)胞系與乳腺上皮細(xì)胞的外泌體拉曼光譜做對(duì)比，甚至選擇其他種類良惡性細(xì)胞外泌體拉曼光譜做對(duì)比，這樣篩選出的特征光譜更為可靠。其次，我們用的是細(xì)胞培養(yǎng)基分離出來的外泌體，但患者血清提純的外泌體更具有臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。因此，下一步的試驗(yàn)計(jì)劃是收集健康人和腫瘤患者的血液樣本，分離外泌體，然后用SERS技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)和鑒別。