夏立秋

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 微生物分子生物學(xué)湖南省重點(diǎn)實驗室， 淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室, 長沙 410081)

自2019年12月以來近兩個多月時間，在湖北武漢發(fā)生的由新型冠狀病毒SARS-CoV-2引發(fā)的2019冠狀病毒病COVID-19截止到2019年3月3日已導(dǎo)致我國確診病例8.027萬人，死亡2 981人。除我國外，在國際上韓國、意大利、伊朗、日本、法國、德國和美國等71個國家也發(fā)生了COVID-19，累計確診病例1.061萬例，死亡164例。COVID-19確診病例迅速增多，其傳染性高，癥狀比較隱匿，世界衛(wèi)生組織深感憂慮，人類生命受到極大威脅。專家認(rèn)為，新冠病毒肺炎與人類的較量將是一個長期的過程。國內(nèi)外學(xué)者迅速對SARS-CoV-2的來源、基因組及其結(jié)構(gòu)、病毒分類、侵入和致病機(jī)制等進(jìn)行研究并取得了重大進(jìn)展，對防控SARS-CoV-2的蔓延和COVID-19的治療及其藥物研發(fā)產(chǎn)生了重大作用。

1 新型冠狀病毒SARS-CoV-2的來源和進(jìn)化

在湖北武漢發(fā)生新型冠狀病毒疫情，從2019年12月12日至2020年3月3日短時期內(nèi)，已造成我國2 981例患者死亡。中國科學(xué)院武漢病毒研究所石正麗研究團(tuán)隊[1]根據(jù)從幾位重癥肺炎患者分離的病毒進(jìn)行基因組測序，相應(yīng)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該病毒全基因組序列與以前研究的SARS冠狀病毒(SARS-CoV)[2]相似度高達(dá)79.6%，與蝙蝠冠狀病毒SARSr-CoV相似度高達(dá)96%。同時，從一名危重病人的支氣管肺泡灌洗液中分離出的病毒可被幾名肺炎患者的血清中和。復(fù)旦大學(xué)張永振研究團(tuán)隊和武漢市市中心醫(yī)院合作研究，從一名武漢華南海鮮市場上工作的患有嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)綜合癥患者中分離出新病毒，全基因組測序及其系統(tǒng)進(jìn)化分析表明為一種新的冠狀病毒科RNA病毒，與一組來源于蝙蝠的SARS樣冠狀病毒基因組核苷酸序列相似度高達(dá)89.1%[3]。譚文杰等合作研究小組[4]對來自武漢9例住院患者進(jìn)行調(diào)查，其中8例曾去過武漢的華南海鮮市場。對他們的支氣管肺泡灌洗液和培養(yǎng)分離物的樣品測序，獲得的10條2019-nCoV基因組序列極其相似，序列同源性超過99.98%。該2019-nCoV與兩種蝙蝠來源的SARS樣冠狀病毒bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21的序列同源性為88%，與SARS-CoV的約為79%，與中東呼吸綜合癥冠狀病毒(MERS-CoV)的約為50%。認(rèn)為2019-nCoV是一種新型的人類冠狀病毒，蝙蝠可能是該病毒的原始宿主，但武漢海鮮市場上出售的動物可能是促進(jìn)該病毒在人體內(nèi)出現(xiàn)的中間宿主(圖1)。

圖1 2019-nCoV和β冠狀病毒屬的代表性病毒全長基因組的進(jìn)化分析[4] Fig.1 Phylogenetic analysis of full-length genomes of 2019-nCoV and representative viruses of the genus Betacoronavirus[4]2019-nCoV=2019新型冠狀病毒；MERS-CoV=中東呼吸綜合征冠狀病毒；SARS-CoV=嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2019-nCoV=2019 novel coronavirus;MERS-CoV=Middle East respiratory syndrome coronavirus;SARS-CoV=severe acute respiratory syndrome coronavirus

早在2015年，美國北卡羅來納大學(xué)流行病學(xué)系Baric與中國武漢病毒研究所研究人員合作，在對中國菊頭蝠種群中傳播SARS狀冠狀病毒的潛在病害研究中，采用基因工程技術(shù)合成感染性重組病毒具有很強(qiáng)的復(fù)制能力,認(rèn)為蝙蝠種群中的SARS狀冠狀病毒仍會出現(xiàn)造成SARS-CoV的再次傳播[5]。在2017年石正麗與美國和新加坡等國家的專家合作[6]開展對蝙蝠來源SARS相關(guān)冠狀病毒基因庫和SARS冠狀病毒起源的研究，根據(jù)對中國云南省棲息在洞穴中的多種菊頭蝠SARSr-CoV進(jìn)行5年監(jiān)測，新發(fā)現(xiàn)的11個SARSr-CoV毒株的全長基因組與人類SARS-CoV具有高度遺傳相似性，重組分析顯示了其在s基因內(nèi)以及這些SARSr-CoV之間的orf8基因周圍頻繁發(fā)生重組，推測人類SARS-CoV的直接祖先可能起源于這些SARSr-CoV的可變區(qū)域基因結(jié)構(gòu)順序重組。進(jìn)一步細(xì)胞學(xué)試驗發(fā)現(xiàn)，三個新鑒定出的蝙蝠SARSr-CoV具有不同S蛋白序列都能夠使用人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)作為受體。

香港大學(xué)袁國勇等多位學(xué)者的研究表明，冠狀病毒中的α冠狀病毒和β冠狀病毒通常會導(dǎo)致人類呼吸系統(tǒng)疾病。根據(jù)目前對基因組序列數(shù)據(jù)庫分析，蝙蝠和鳥類是冠狀病毒基因源的理想寄主，促進(jìn)冠狀病毒進(jìn)化和傳播[7,8]?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)的人類冠狀病毒SARS-CoV、中東呼吸綜合癥冠狀病毒MERS-CoV、兩種新型人冠狀病毒HCoV-NL63和HCoV-229E均被認(rèn)為來源于蝙蝠，蝙蝠很可能是α-冠狀病毒和β-冠狀病毒的主要天然貯藏庫，而嚙齒動物和家畜可能作為中間宿主發(fā)揮重要作用，使病毒能夠從自然宿主傳播到人類。根據(jù)中國科學(xué)院于文彬等[9]研究，基于進(jìn)化分析和流行病學(xué)研究，使用了來自GISAID EpiFluTM數(shù)據(jù)庫中收集覆蓋了四大洲12個國家的93個SARS-CoV-2完整基因組來研究在兩個月中SARS-CoV-2的進(jìn)化和人對人的傳播。在2019年12月8日至1月6日分別得到了早期和最近的傳播。認(rèn)為華南海鮮市場的新型冠狀病毒是從其他地方傳入，在市場中發(fā)生快速傳播蔓延到市場之外至整個武漢城市。與SARS-CoV和MERS-CoV基因組序列相比，SARS-CoV-2的基因組變異仍然較低。

上述研究結(jié)果表明，認(rèn)為引起湖北武漢突發(fā)COVID-19的SARS-CoV-2與SARS樣冠狀病毒有關(guān)，可能由蝙蝠SARSr-CoV演變而來，提示人類很有必要為未來SARS樣疾病風(fēng)險的出現(xiàn)做好應(yīng)對準(zhǔn)備。

2 新型冠狀病毒SARS-CoV-2的形態(tài)和基因結(jié)構(gòu)

Viruses,ICTV)冠狀病毒研究小組(Coronavirus Study Group)正式命名為武漢新型冠狀病毒為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)，從冠狀病毒分類學(xué)角度上講，SARS-CoV-2屬于SARS冠狀病毒(SARS-CoV)的近親。同日，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)對由這一病毒導(dǎo)致的疾病的正式名稱為COVID-19(Coronavirus Disease 2019)[11,12]。[11,12]

中國疾病預(yù)防控制中心等單位專家合作組[4]從9名武漢肺炎患者中分離出10株2019-nCoV，均對其進(jìn)行全基因組測序，共獲得8個基因組完成圖，發(fā)布了其序列：NMDC60013002-01，NMDC60013002-03，NMDC60013002-04，NMDC60013002-06，NMDC60013002-07，NMDC60013002-08，NMDC60013002-09，NMDC 60013002-10,NMDC60013002-07，NMDC60013002-08，NMDC60013002-09，NMDC60013002-10，已完成測序的8個2019-nCoV基因組大小在29 835～29 896 nt之間，說明不同病毒株間的核苷酸序列數(shù)及其僅有個別位點(diǎn)存在差異。袁國勇研究小組[11]對武漢新型冠狀病毒的全基因組進(jìn)行測序，發(fā)布了其序列(登錄號：MN908947)。全基因組測序結(jié)果展示該病毒基因組由29 891個堿基組成，GC含量為38%，共編碼9 860個氨基酸。與其他βCoV相似，2019-nCoV基因組包含兩個位于側(cè)翼的非編碼區(qū)(5′-UTR 和3′-UTR)、由12個開放閱讀框(orf1ab，Spike，orf3a，orf3b，E，M，orf6，orf7a，orf7b，orf8/orf8b，N和orf9b)組成的一個編碼多蛋白長開放閱讀框、1個前導(dǎo)序列、9個轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列組成。其基因組的排列順序為5′-復(fù)制酶(orf1/ab)-結(jié)構(gòu)蛋白[Spike(S)-Envelope(E)-Membrane(M)-Nucleocapsid(N)]-3′，其編碼產(chǎn)物依次是復(fù)制酶(orf1/ab)、刺突糖蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣殼(N)及其它假想蛋白，但缺乏在β類型冠狀病毒A系中所特有的血凝素脂酶(HE)基因。 2019-nCoV兩側(cè)的非編碼區(qū)分別是由265和358個堿基組成，與其它β類型冠狀病毒兩側(cè)非編碼區(qū)的相似度在83.6%以上。

進(jìn)一步分析表明，復(fù)制酶是2019-nCoV中最大的蛋白，由nsp1(抑制抗病毒宿主反應(yīng))、nsp2(功能未知)、nsp3(木瓜樣蛋白酶)、nsp4(雙層膜囊形成)、nsp5(糜蛋白酶樣蛋白酶)、nsp6(雙層膜囊形成)、nsp7(引發(fā)酶)、nsp8(引發(fā)酶)、nsp9(DNA/RNA結(jié)合活性)、nsp10(復(fù)制酶)、nsp11(orf1a末端的短肽)、nsp12(RNA依賴的RNA聚合酶)、nsp13(解旋酶)、nsp14(3′-5′外切酶)、nsp15[poly(U)特異性內(nèi)切酶]和nsp16(2′-O-核糖甲基轉(zhuǎn)移酶)等16個非結(jié)構(gòu)蛋白組成，約占全基因組編碼區(qū)域的三分之二。刺突糖蛋白由S1和S2兩個亞基組成，介導(dǎo)受體結(jié)合和膜融合。其中S1亞基包含信號肽，依次由N-端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain，NTD)和受體結(jié)構(gòu)域(receptor-binding domain，RBD)組成。S2亞基包括融合肽(FP)，7肽重復(fù)區(qū)1和2，跨膜區(qū)域(TM)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域(CP)(圖3)。

圖3 β冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)[11]Fig.3 Betacoronavirus genome organization[11]冠狀病毒基因組由包括5′ 前導(dǎo)序列的5′ 非翻譯區(qū)(5UTR)，編碼要復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp)的開放閱讀框(orf)1a/b(黃色框)，包括包膜蛋白(橙色框)，膜 (紅色)和核蛋白(青色框)，輔助蛋白(紫色框)，例如2019-nCoV(HKU-SZ-005b)基因組的orf 3、6、7a，7b 8和9b和3′非翻譯區(qū)(3UTR)。 每個β冠狀病毒譜系的例子是人冠狀病毒(HCoV)HKU1(A系)，2019-nCoV(HKU-SZ-005b)和SARS-CoV(B系)，人MERS-CoV和蝙蝠CoV HKU9(C系)和蝙蝠 CoV HKU4(D系)。 nsps和orfs的長度未按比例繪制。Coronavirus genome comprises of 5′ untranslated region (5UTR) including 5′ leader sequence, open reading frame (orf) 1a/b (yellow box) encoding non structural proteins (nsp) for replication, structural proteins including envelop (orange box), membrane (red) and nucleoprotein (cyan box), accessory proteins (purple boxes) such as orf 3, 6, 7a, 7b 8 and 9b of 2019-nCoV (HKU-SZ-005b) genome, and 3′ untranslated region (3UTR). Examples of each betacoronavirus lineage are human coronavirus (HCoV) HKU1 (lineage A), 2019-nCoV (HKU-SZ-005b) and SARS-CoV (lineage B), Human MERS-CoV and bat CoV HKU9 (lineage C) and Bat CoV HKU4 (lineage D) . The length of nsps and orfs are not drawn in scale.

圖4 2019-nCoV，SARS-CoV和MERS-CoV受體結(jié)合域的系統(tǒng)發(fā)育分析和同源性建模[4]Fig.4 Phylogenetic analysis and homology modelling of the receptor-binding domain of the 2019-nCoV, SARS-CoV, and MERS-CoV[4](a)來自各種β冠狀病毒的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的系統(tǒng)發(fā)育分析。 紅星突出顯示了2019-nCoV，問號表示病毒使用的受體仍然未知。 SARS-CoV(b)，2019-nCoV(c)和MERS-CoV(d)結(jié)合其自身受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)比較。 核心亞群是洋紅色，SARS-CoV、2019-nCoV和MERS CoV的外部亞群分別是橙色，深藍(lán)色和綠色。 受體結(jié)合位點(diǎn)中SARS-CoV和2019-nCoV之間的可變殘基突出顯示為棒狀。 CoV=冠狀病毒, 2019-nCoV=2019新型冠狀病毒， SARS CoV=嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒， MERS=中東呼吸綜合征冠狀病毒。 (a) Phylogenetic analysis of the receptor-binding domain from various betacoronaviruses. The star highlights 2019-nCoV and the question marks means that the receptor used by the viruses remains unknown. Structural comparison of the receptor-binding domain of SARS-CoV (b), 2019-nCoV (c), and MERS-CoV (d) binding to their own receptors. Core subdomains are magenta, and the external subdomains of SARS-CoV, 2019-nCoV, and MERS CoV are orange, dark blue, and green, respectively. Variable residues between SARS-CoV and 2019-nCoV in the receptor-binding site are highlighted as sticks. CoV=coronavirus, 2019-nCoV=2019 novel coronavirus, SARS CoV=severe acute respiratory syndrome coronavirus, MERS=Middle East respiratory syndrome coronavirus.

從 Blast比對結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV的S2亞基與其它SARSr-CoV的S2亞基具有很高的同源性，如與來自于蝙蝠的類SARS-CoVs(SL-CoV ZXC21和SL-CoV ZC45)以及來自于人的SARS-CoV的同源性達(dá)到99%，故對S2亞基進(jìn)行抗病毒肽的設(shè)計可能是預(yù)防和治療該類病毒的重要手段。將2019-nCoV的S1亞基與來自于蝙蝠的類SARS-CoVs(SL-CoV ZXC21和SL-CoV ZC45)以及來自于人的SARS-CoV的S1亞基進(jìn)行Blast比對時發(fā)現(xiàn)僅有70%的同源性，但在受體結(jié)構(gòu)域核心區(qū)域的保守性極高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，受體結(jié)構(gòu)域核心區(qū)域以外的氨基酸組成差異較大，其可能與受體的利用、種間轉(zhuǎn)化以及致病機(jī)制有關(guān)。與2019-nCoV和人SARS-CoV不同的是，大多數(shù)已知的蝙蝠類SARS-CoVs，如SL-CoV ZXC21和SL-CoV ZC45在受體結(jié)合域存在兩段序列刪除，最終導(dǎo)致這兩個病毒不能在vero E6(非洲綠猴腎細(xì)胞)細(xì)胞中分離得到，說明s基因中的這兩段序列對病毒感染宿主至關(guān)重要。Orf3b是由4個螺旋組成的假想蛋白，其與病毒的復(fù)制無關(guān)，但在病毒的致病性中發(fā)揮重要作用，如能抑制IFN-β的表達(dá)。

已有對SARS的研究發(fā)現(xiàn)，該病毒在微觀結(jié)構(gòu)上具有包膜，包膜表面形成的刺突和膜上相應(yīng)具有S蛋白和M蛋白。對S蛋白與宿主結(jié)合的受體結(jié)合域(receptor binding domain，RBD)及其三維結(jié)構(gòu)受到研究者高度重視。針對這次武漢發(fā)生的疫情，研究人員[4]在全基因組水平分析基礎(chǔ)上，對β冠狀病毒的受體結(jié)合域認(rèn)真比較，發(fā)現(xiàn)2019-nCoV全基因組序列更接近來源于蝙蝠(bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21)病毒的結(jié)構(gòu)，而其RBD結(jié)構(gòu)更接近SARS-CoV的RBD(圖4a)。利用Swiss-Model程序，對SARS-CoV RBD結(jié)構(gòu)(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫ID 2DD8)為模板對2019-nCoV RBD的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了建模分析。與其他β-冠狀病毒一樣，RBD由核心和外部亞域組成。2019-nCoV受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的外部亞結(jié)構(gòu)域與SARS-CoV的結(jié)構(gòu)域更相似(圖4b)。2019-nCoV也能使用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting eazyme 2,ACE2)作為細(xì)胞受體。觀察到SARS-CoV RBD與ACE2受體結(jié)合的幾個關(guān)鍵殘基中， 2019-nCoV RBD中的是可變的(Asn439，Asn501，Gln493，Gly485和Phe486)。

3 新型冠狀病毒SARS-CoV-2的感染和致病分子機(jī)制

隨著武漢SARS-CoV-2感染病例迅速蔓延和造成死亡病例的增加，研究人員迅速投入對其感染和致病的分子機(jī)制進(jìn)行了研究。S蛋白是其病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合和融合的關(guān)鍵因子，其基因結(jié)構(gòu)與傳染和致病密切相關(guān)。郝沛等[14]根據(jù)SARS-CoV S蛋白RBD結(jié)構(gòu)域與其受體ACE2蛋白結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，用結(jié)構(gòu)疊加和分子模型模擬了2019-nCoV S蛋白與人ACE2結(jié)合的3-D復(fù)合結(jié)構(gòu)。對比分析了2019-nCoV S蛋白和SARS-CoV S蛋白與人ACE2之間的結(jié)合自由能分別為-50.6 kcal/mol和-78.6 kcal/mol，2019-nCoV S蛋白的結(jié)合自由能增加了28 kcal/mol。認(rèn)為2019-nCoV S蛋白與人ACE2具有很強(qiáng)的結(jié)合親和力。盡管2019-nCoV S蛋白替換了五個重要的界面氨基酸殘基中的四個(442、472、479和487位)，但沒有改變其能結(jié)合的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)2019-nCoV S蛋白與人ACE2具有顯著的結(jié)合親和力。2019-nCoV S蛋白和SARS-CoV S蛋白在RBD結(jié)構(gòu)域中共享幾乎相同的3-D結(jié)構(gòu)，從而在相互作用界面中保持相似的范德華力和靜電性質(zhì)，支持2019-nCoV S蛋白與人ACE2分子的強(qiáng)相互作用，根據(jù)上述結(jié)果認(rèn)為2019-nCoV對人類傳播構(gòu)成了重大的公共健康風(fēng)險。為了確定2019-nCoV是否還將ACE2用作細(xì)胞進(jìn)入受體，石正麗等[1]使用表達(dá)或不表達(dá)人類、菊頭蝠，果子貍，豬和小鼠的ACE2蛋白的HeLa細(xì)胞進(jìn)行了病毒感染性研究。 結(jié)果顯示，2019-nCoV能夠使用除小鼠ACE2以外的所有受體作為表達(dá)ACE2的細(xì)胞中的進(jìn)入受體，而不使用沒有ACE2的細(xì)胞，這表明ACE2可能是2019-nCoV的細(xì)胞受體(圖5)。

根據(jù)Letko等[15]的研究，利用合成生物學(xué)及分子工程技術(shù)，將目的基因合成優(yōu)化到很小的片段。對人類細(xì)胞受體ACE2與β冠狀病毒中B類病毒包括SARS-CoV和2019-nCoV在內(nèi)的刺突S蛋白分子三維結(jié)構(gòu)結(jié)合進(jìn)行了模擬(圖6a)。在此基礎(chǔ)上解析了β冠狀病毒中B類病毒包括SARS-CoV和2019-nCoV在內(nèi)的刺突S蛋白分子29個獨(dú)特的RBD序列，并進(jìn)行了基因密碼子優(yōu)化，合成這些工程化的刺突蛋白基因序列，并將其分別克隆到pcDNA3.1中，相應(yīng)生成帶有嵌合的和熒光素酶報告基因的缺陷性水皰性口炎病毒假型病毒VSV-g。將來自蝙蝠和人類細(xì)胞等不同宿主物種的ACE2、DPP4(二肽基肽酶IV)、APN(氨肽酶)基因重組質(zhì)?；蚩蛰d體質(zhì)粒DNA分別轉(zhuǎn)入BHK細(xì)胞(幼倉鼠腎細(xì)胞)，以VSV-g顆粒感染。觀察結(jié)果表明，人ACE2是2019-nCoV進(jìn)入宿主細(xì)胞的受體；宿主蛋白酶是β冠狀病毒B類病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的重要屏障，蛋白酶處理促進(jìn)病毒進(jìn)入表達(dá)ACE2的宿主細(xì)胞。在沒有宿主受體人ACE2的情況下，蛋白酶處理不能使其病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞(圖6b)。已有研究表明，宿主細(xì)胞體內(nèi)有關(guān)生化因子是控制冠狀病毒進(jìn)入的關(guān)鍵。德國Markus研究小組[16]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞絲氨酸蛋白酶(TMPRSS2)對2019-nCoV的S蛋白的啟動及其進(jìn)入宿主細(xì)胞具有關(guān)鍵作用。他們分別將病毒2019-nCoV和SARS-CoV的S蛋白基因(2019-nCoV-S、SARS-CoV-S)重組構(gòu)建了VSV假型病毒。將單獨(dú)或與TMPRSS2組合表達(dá)ACE2的人胚胎腎上皮細(xì)胞293T作為宿主細(xì)胞，與作為對照的組織蛋白酶B/L(CatB/L)抑制劑E64d或PBS一起溫育，并接種帶有標(biāo)簽表面蛋白的VSV-G，并利用Camostat作為細(xì)胞蛋白酶TMPRSS2的抑制劑。發(fā)現(xiàn)病毒受體ACE2和TMPRSS2對2019-nCoV和 SARS-CoV進(jìn)入靶細(xì)胞均具有相同的重要作用(圖7b)。 隨后，他們將VSV-G與來自不同的康復(fù)期SARS患者的血清稀釋液一起孵育，然后接種到表達(dá)ACE2的293T細(xì)胞上。結(jié)果顯示，康復(fù)期SARS患者的血清以濃度依賴性方式抑制或減少了2019-nCoV-S和SARS-S進(jìn)入宿主細(xì)胞，康復(fù)期SARS患者表現(xiàn)出針對病毒S蛋白的中和抗體反應(yīng)(圖7b)。這一結(jié)果提示，在感染或疫苗接種期間針對SARS-S產(chǎn)生的抗體反應(yīng)能提供針對2019-nCoV感染的重要保護(hù)作用。

圖5 2019-nCoV受體結(jié)合情況分析[1]Fig.5 Analysis of 2019-nCoV receptor usage[1]在有或沒有ACE2表達(dá)的情況下測定HeLa細(xì)胞中的病毒感染性。 h，人類； b，犀牛蝙蝠； c，靈貓； s，豬(豬)；m，老鼠。ACE2蛋白(綠色)，病毒蛋白(紅色)和細(xì)胞核(藍(lán)色)。 比例尺= 10 μm。Determination of virus infectivity in HeLa cells with or without the expression of ACE2. h.Human;b.Rhinolophus sinicus bat;c.Civet;s.Swine(pig);m.Mouse. ACE2 protein(green), viral protein (red) and nuclei (blue) was shown. Scale bar=10 μm.

圖6 β-冠狀病毒刺突中RBD與宿主細(xì)胞ACE2相互作用及其進(jìn)入表達(dá)hACE2的宿主細(xì)胞[15]Fig.6 Receptor binding domain (RBD) in β-coronal virus spikes interacts with host cell receptor (ACE2) and enters host cells expressing hACE2[15](a)β-冠狀病毒(SARS-CoV)刺突中的RBD與宿主細(xì)胞受體ACE2相互作用;(b)β-冠狀病毒(2019-nCoV)進(jìn)入表達(dá)受體人ACE2的宿主細(xì)胞。(a)β-Coronaviruses, including SARS-CoV, interact with the host cell receptor via the Receptor Binding Domain (RBD) in spike; (b)β-Coronavirus Lineage B entry into cells with known CoV receptors

圖7 2019-nCoV-S依賴TMPRSS2進(jìn)入宿主細(xì)胞和利用康復(fù)期SARS患者的血清減少2019-nCoV-S進(jìn)入宿主細(xì)胞[16] Fig.7 2019-nCoV-S depends on TMPRSS2 to enter host cells and use serum from patients with SARS in convalescence to reduce 2019-nCoV-S entry to host cells[16] (a)表達(dá)ACE2 和TMPRSS2的293T細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，以不表達(dá)TMPRSS2的相應(yīng)為對照。E-64d為可滲透細(xì)胞的不可逆廣譜半胱氨酸蛋白酶抑制劑。VSV-G為假型病毒。(b)表達(dá)ACE2的293T細(xì)胞作為宿主細(xì)胞?？祻?fù)期SARS患者的血清血稀釋濃度為1∶400、1∶100、1∶25。(a)293T cells expressing ACE2 and TMPRSS2 were used as host cells, and those not expressing TMPRSS2 were used as controls. E-64d is an irreversible broad spectrum cysteine protease inhibitor that can penetrate cells. VSV-G is a pseudotyped virus.(b)293T cells expressing ACE2 as host cells. The serum concentrations of SARS patients during rehabilitation period were 1∶400, 1∶100, 1∶25.

復(fù)旦大學(xué)應(yīng)天雷研究小組[17]對來源于武漢COVID-19 患者的2019-nCoV基因組序列(GISAID，登錄號為EPI-ISL-402124)進(jìn)行其S蛋白系統(tǒng)發(fā)生分析，通過BLI測定，發(fā)現(xiàn)2019-nCoV RBD與ACE2有強(qiáng)力結(jié)合，計算得出2019-nCoV RBD與人ACE2的親和力(KD)為15.2 nmol/L，與SARS-CoV刺突蛋白與人ACE2的親和力(15 nmol/L)相當(dāng)，表明ACE2是新型冠狀病毒的作用受體。根據(jù)前期研究S蛋白中的193個氨基酸長度(N318-V510)RBD是中和抗體的關(guān)鍵靶標(biāo)，預(yù)測了2019-nCoV RBD的構(gòu)象與SARS-CoV-RBD單克隆抗體結(jié)合的模擬模型(圖8a)。發(fā)現(xiàn)2019-nCoV RBD與SARS-CoV有效抗體F26G19、m396 和80R之間的相互靜電作用存在差異，SARS-CoV單克隆抗體有的能被有效中和，表明SARS-RBD的差異使SARS-CoV和2019-nCoV對中和抗體的交叉反應(yīng)具有至關(guān)重要的影響。根據(jù)ELISA和BLI的測定，在供試的幾種抗體中，發(fā)現(xiàn)從康復(fù)期SARS患者的血液中分離的一種SARS-CoV單克隆抗體CR3022與2019-nCoV RBD能有效結(jié)合(圖8b)，該結(jié)果對2019-nCoV高效抗體的研究與篩選提供了重要基礎(chǔ)。

圖8 2019-nCoV RBD與SARS-CoV-RBD特異性抗體結(jié)合的模擬模型(a)及其SARS-CoV-RBD單克隆抗體與2019-nCoV RBD結(jié)合的ELISA確定(b)[17]Fig.8 The simulated model of 2019-nCoV RBD binding to SARS-CoV-RBD-specific antibodies (a)and ELISA determination of SARS-CoV-RBD monoclonal antibody binding to 2019-nCoV RBD(b)[17] m396、80R、 F26G19均為SARS-CoV-RBD單克隆抗體m396, 80R, F26G19 are SARS-CoV-RBD monoclonal antibodies

4 總結(jié)與展望

2019新冠病毒感染的肺炎疫情幾乎在全世界爆發(fā)，引起了國際社會高度重視，對人類社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的沖擊使人們懂得必須投入科學(xué)研究，才能實施精準(zhǔn)科學(xué)防控。從2003發(fā)生SARS[18]、到2012年爆發(fā)的MERS(中東呼吸綜合癥)[19]至此次發(fā)生的COVID-19,均為β冠狀病毒的SARS-CoV病原體，其迅速傳播和引發(fā)的高患病率及致死率對人類健康構(gòu)成持續(xù)威脅。對β冠狀病毒的SARS-CoV病原體實施精準(zhǔn)科學(xué)防控，可以進(jìn)行以下方面深入研究。

1)COVID-19疫苗研發(fā) 對COVID-19病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白S、M、N、E的基因解析，有利于開展SARS-CoV-2新興疫苗如亞單位疫苗、RNA 疫苗、黏膜疫苗、多肽疫苗和病毒顆粒樣疫苗研究。新興疫苗具有易于大規(guī)模生產(chǎn)、便于保存、方便接種、質(zhì)量穩(wěn)定、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。通過建立假型冠狀病毒制備技術(shù)和利用特異基因編輯技術(shù)，獲得新興疫苗，在體外檢測疫苗誘導(dǎo)中和抗體的效果及誘發(fā)T細(xì)胞和持久抗體的應(yīng)答的能力，選取合適的新型冠狀病毒疫苗。近期已有研究人員開展β冠狀病毒的SARS病毒疫苗研究取得了突破性進(jìn)展[20]，為COVID-19病毒疫苗研究獲得成功奠定了可喜的基礎(chǔ)，國際上一些制藥公司包括基因生命科學(xué)公司(GeneOne Life Science Inc)和伊諾維制藥公司(Inovio Pharmaceuticals Inc)等正以驚人的速度進(jìn)行COVID-19疫苗研究，開始在動物身上測試[21]，疫苗仍是防控COVID-19的最佳策略。

2)COVID-19病毒抗體研發(fā) 對SARS-CoV-2的數(shù)個毒株全基因組及其特異S蛋白、M蛋白等三維結(jié)構(gòu)解析，為COVID-19病毒抗體研發(fā)提供了重要條件。 根據(jù)SARS康復(fù)患者血清產(chǎn)生抗體和SARS疫區(qū)人員免疫力強(qiáng)帶有SARS-CoV-2抗體的情況，通過篩選和建立支持抗體細(xì)胞系技術(shù)，從SARS-CoV-2康復(fù)患者體內(nèi)血漿中分離和鑒定結(jié)合該病毒全人單克隆抗體。結(jié)合假型病毒技術(shù)，研究適合的細(xì)胞培養(yǎng)系及其擴(kuò)大培養(yǎng)技術(shù)、抗體標(biāo)簽識別技術(shù)和單克隆抗體交叉反應(yīng)分析技術(shù)，獲得抗體用于有效預(yù)防和治療COVID-19。國際上ModeRNA Therapeutics 公司，藥明生物與生物技術(shù)公司Vir Biotechnology公司等一些制藥公司及研究院所正火速開展多種單克隆抗體研發(fā)，已有幾種COVID-19病毒抗體分別進(jìn)入動物試驗和臨床試驗[22,23]。

3)COVID-19病毒抑制劑研發(fā) SARS-CoV-2感染人體致病需融合和進(jìn)入宿主細(xì)胞，但受到宿主細(xì)胞蛋白水解酶對病毒的S蛋白激活和融合肽的過膜釋放的調(diào)控。以病毒RNA聚合酶、宿主細(xì)胞組織蛋白酶、表面跨膜絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、弗林蛋白酶和胰蛋白酶、作為潛在靶點(diǎn)[24-26]，進(jìn)行相應(yīng)抑制劑研究，阻止對病毒的S蛋白激活和融合肽的過膜釋放，阻斷病毒與宿主細(xì)胞的融合，阻斷聚合酶蛋白的裂解以抑制病毒RNA合成和病毒復(fù)制，能得到治療和預(yù)防該病毒的特效抑制劑藥物。根據(jù)上述調(diào)控酶的結(jié)構(gòu)通過構(gòu)建多肽，篩選小分子、核苷類物質(zhì)和化學(xué)物質(zhì)、金屬納米顆粒等，采用高通量篩選獲得高效抑制劑，有效地抑制病毒入侵宿主細(xì)胞，或者抑制病毒RNA復(fù)制。目前臨床上治療COVID-19應(yīng)用的藥物，包括瑞德西韋(Remdesivir)、洛匹那韋和利托那韋(Lopinavir/ritonavir)等藥物都是針對原來用于傳染病病毒的藥物，這些藥物大規(guī)模臨床使用效果還需要更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐R床試驗驗證。說明針對COVID-19病毒抑制劑的研發(fā)有著巨大的潛力。