李正剛，農媛，湯亞飛，佘小漫，于琳，藍國兵，鄧銘光，何自福

（廣東省農業(yè)科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州510640）

0 引言

【研究意義】黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）隸屬于帚狀病毒科（Virgaviridae）煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）[1]，該屬病毒的特點是極易通過機械摩擦進行傳播。CGMMV可以侵染黃瓜、葫蘆、甜瓜、西瓜等葫蘆科作物，造成植株生長遲緩、葉片褪綠斑駁、果實變色和纖維化，導致嚴重損失[2-5]。CGMMV是典型的種傳病毒[6-7]，是我國植物檢疫性有害生物[4]。因此，對CGMMV進行監(jiān)測及鑒定，有利于對該病毒進行預防，減輕該病毒造成的危害，對葫蘆科作物的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。【前人研究進展】CGMMV是正義單鏈RNA病毒，全長約6 400 nt，編碼4個蛋白，分別為129 kD的復制酶、186 kD的復制相關蛋白、29 kD運動蛋白和17.4 kD的外殼蛋白[8]。CGMMV最早是在英格蘭發(fā)現(xiàn)的[9]，隨后在全世界范圍內陸續(xù)被報道[10-16]。CGMMV在世界范圍的傳播可以分為3個時期[17]：1935—1985年，該時期CGMMV在全球的傳播速度較慢，僅局限在歐洲、中東、南亞和東亞少數(shù)幾個國家以及中國臺灣等地區(qū)[17-20]；1986—2006年，該時期CGMMV在全球傳播的速度有所加快，已傳播至歐洲大部分國家[17]，在亞洲包括南亞的巴基斯坦，東亞的中國和韓國，東南亞的印度尼西亞和泰國，中東地區(qū)的以色列、沙特阿拉伯和敘利亞[11,17,21-27]；2007—2016年，該時期CGMMV傳播速度更加迅速，傳播至更多的國家和地區(qū)[17]，加拿大、美國、尼日利亞、澳大利亞這些國家也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了CGMMV[17,28-30]。中國大陸于2005年在廣西南瓜上最早報道CGMMV，目前已經在山東、河北、湖北、云南、廣東、遼寧等多地普遍發(fā)生[3,22,31-33]，并對多地的瓜類作物造成了毀滅性的損失[2,4]?！颈狙芯壳腥朦c】CGMMV廣東分離物雖然已經報道[32]，但是只包含了運動蛋白和外殼蛋白的部分序列，不是全長序列，而且沒有對其侵染性進行分析。【擬解決的關鍵問題】克隆侵染葫蘆的CGMMV廣東分離物基因組全長，構建其全長侵染性克隆，并測定其對3種重要葫蘆科植物（黃瓜、葫蘆和西瓜）的致病性，為該病毒的預防提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2018年9月至2019年7月在廣東省農業(yè)科學院植物保護研究所完成。

1.1 樣本來源

2018年9月在廣東省連州市葫蘆產區(qū)發(fā)現(xiàn)有植株疑似感染CGMMV，采集2個有癥狀病樣以及1個無癥狀樣品后帶回實驗室，并置于-80℃超低溫冰箱凍存。

1.2 RNA提取

采用TRIzol方法提取樣品總RNA，TRIzol購自TaKaRa公司，提取好的RNA樣品凍存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.3 RT-PCR反應

反轉錄試劑盒購自TaKaRa公司。CGMMV檢測引物參考CGMMV序列（GenBank登錄號：KX883801）設計，引物序列為F：CCACGAGTTGTTTCCTAAT GCTG/R：TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT，擴增長度為890 bp，退火溫度為53℃。

1.4 CGMMV-GDLZ分離物全長序列擴增

將CGMMV全長序列分為兩段，前半段1—3 511 nt，后半段3 301—6 423 nt，分別設計引物擴增。前半段擴增引物為F：AAGTTCATTTCATTTGGAGAG GGTTTTAATTTTTATAATTAAACAAA （下劃線序列為同源重組序列）/R：AGTTCTGCATTAATTGCTA TTTGGTAGGCACAGTGGTAG；后半段擴增引物為F：GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGAT TGCCCGTG/R：GGTGGAGATGCCATGCCGACCC T GGGCCCCTACCCGGGGAAAGG（下劃線序列為同源重組序列）。將擴增好的前半段和后半段序列通過同源重組的方法構建到pCB301載體上[34]。將構建好的pCB301-CGMMV質粒送往上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

1.5 系統(tǒng)進化分析

將測序所得CGMMV全長序列在NCBI中進行Blast分析。利用MEGA7軟件[35]構建系統(tǒng)進化樹。

1.6 CGMMV-GDLZ侵染性克隆構建及農桿菌注射接種

將約為0.5 μg的pCB301-CGMMV質粒轉入100 μL GV3101（pSoup）農桿菌感受態(tài)細胞（上海唯地生物技術有限公司），菌落PCR驗證。將含有pCB301-CGMMV質粒的農桿菌接種于含有卡那霉素（100 μg·mL-1）和利福平（25 μg·mL-1）的LB培養(yǎng)基內，28℃搖床過夜培養(yǎng)，4 000 r/min離心10 min收集沉淀，棄上清，沉淀用農桿菌懸浮緩沖液（10 mmol·L-1MES，10 mmol·L-1MgCl2，150 μmol·L-1As）重懸，利用紫外分光光度計將菌液OD600調至1.0。28℃培養(yǎng)箱靜置4 h，用注射器注射植物。

1.7 Western blot檢測

采集0.5 g發(fā)病及健康對照樣品于2 mL離心管中，液氮速凍，通過組織研磨機充分破碎，趁冷加入0.3 mL蛋白提取緩沖液（50 mmol·L-1Tris-HCl pH 6.8，10%甘油，2% SDS，2.5%巰基乙醇），充分振蕩混勻，沸水浴10 min，12 000 r/min離心10 min，取20 μL上清進行Western blot檢測。Western blot一抗為CGMMV CP多克隆抗體，羊抗兔二抗購自于Sigma Aldrich。

2 結果

2.1 樣品采集及檢測

2018年9月在廣東省連州市一個葫蘆種植區(qū)調查時發(fā)現(xiàn)，部分葫蘆植株葉片呈現(xiàn)明顯的褪綠、花葉、斑駁等癥狀（圖1-A），疑似感染CGMMV。采集了2株發(fā)病植株及1株無癥狀植株，RT-PCR檢測結果顯示，2個發(fā)病樣品均可檢測到大小為900 bp左右的特異條帶（圖1-B），無癥狀CK樣品則沒有條帶，說明2個發(fā)病樣品確實感染了CGMMV。

圖1 疑似感染CGMMV的葫蘆植株田間發(fā)病癥狀以及RT-PCR檢測Fig.1 Symptoms of bottle gourd infected by CGMMV and RT-PCR detection of CGMMV

2.2 CGMMV-GDLZ基因組全長序列及其系統(tǒng)進化

為了得到CGMMV廣東連州分離物（CGMMVGDLZ）基因組的全長序列，將CGMMV全長分為兩段擴增，PCR結果顯示，從毒源病樣中成功擴增到預期大小的目的條帶（未展示數(shù)據(jù)），將膠回收的片段與pCB301載體[34]進行重組反應，得到CGMMVGDLZ分離物基因組全長序列，同時也構建了其侵染性克隆pCB301-CGMMV。CGMMV-GDLZ分離物全長為6 423 nt（GenBank登錄號：MK933286），編碼4個蛋白，分別為129K復制酶（61—3 495 nt）、186K復制相關蛋白（61—5 007 nt）、運動蛋白MP（4 994—5 788 nt）和外殼蛋白CP（5 763—6 248 nt）。CGMMV-GDLZ分離物與CGMMV-eWT分離物（GenBank登錄號：KY753928）核苷酸同源性最高，為99.97%，僅有第31位和4 143位核苷酸不同，而其編碼的所有蛋白的同源性則為100%。

為了分析比較CGMMV-GDLZ分離物與其他分離物之間的關系，利用MEGA7軟件[35]構建了系統(tǒng)進化樹。選取不同地點（中國大陸、中國臺灣、日本、韓國、加拿大、以色列、西班牙、俄羅斯）、不同作物（黃瓜、葫蘆、西瓜）上的CGMMV分離物進行系統(tǒng)進化樹構建。結果顯示CGMMV分離物根據(jù)地點分成了3個組：中國大陸、中國臺灣、韓國和日本等亞洲國家和地區(qū)的CGMMV分離物為第1組；以色列和加拿大CGMMV分離物為第2組；西班牙和俄羅斯CGMMV分離物為第3組。CGMMV-GDLZ分離物與山東黃瓜CGMMV-SD分離物（KJ754195）、河南西瓜CGMMV-hn分離物（KC851866）、浙江香瓜CGMMV-JD8分離物（KM873784）、浙江西瓜CGMMV-DY9分離物（KM873786）距離最近（圖2）。

2.3 CGMMV-GDLZ分離物侵染性克隆接種驗證

為了驗證侵染性克隆pCB301-CGMMV的侵染性，首先利用農桿菌注射的方法接種了本生煙，結果顯示第7天時，與Mock植株相比，接種的本生煙上部葉片開始出現(xiàn)明顯的泡狀凸起，隨著時間的發(fā)展，癥狀愈加明顯（圖3-A）。采集發(fā)病葉片進行RT-PCR驗證，結果顯示發(fā)病樣品可以檢測到CGMMV特異條帶，Mock樣品沒有檢測到（圖3-B）。進一步利用Western blot進行驗證，結果顯示發(fā)病樣品可以檢測到CGMMV CP條帶，而Mock沒有檢測到（圖3-C）。說明侵染性克隆pCB301-CGMMV具有侵染性。

圖2 基于CGMMV全長序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on full-length sequence of CGMMV

圖3 利用pCB301-CGMMV侵染性克隆接種本生煙Fig.3 Ago-infiltration into N.benthamiana with pCB301-CGMMV infectious cDNA clones

2.4 CGMMV-GDLZ分離物的致病性

利用含有CGMMV-GDLZ侵染性克?。╬CB301-CGMMV）的農桿菌注射接種黃瓜、葫蘆和西瓜的子葉，15 dpi時，葫蘆和西瓜上部葉片出現(xiàn)明顯的斑駁、花葉、突起，植株生長遲緩，24 dpi時癥狀更明顯；而15 dpi時，CGMMV-GDLZ分離物在黃瓜上的癥狀不明顯，與未接種對照植株幾乎沒有區(qū)別；將植株從控溫接種室移入網(wǎng)室中，30 dpi，黃瓜植株上部葉片開始出現(xiàn)斑駁和花葉，40 dpi時，癥狀已經非常明顯（圖4-A）。RT-PCR和Western blot結果驗證了CGMMV的成功侵染（圖4-B、4-C）。這些結果說明，CGMMVGDLZ分離物可以侵染黃瓜、葫蘆、西瓜等瓜類作物，顯癥時間有所差異。

3 討論

中國是世界上瓜類種植面積最大的國家，而CGMMV則是危害瓜類作物生產的主要病原菌之一，給我國的瓜類產業(yè)造成了巨大的損失。CGMMV屬于煙草花葉病毒屬[1]，該屬病毒可以通過汁液、花粉、農事操作以及嫁接的方式傳播，因此CGMMV在田間非常容易擴散。CGMMV還是典型的種傳病毒[6-7]，種子帶毒也是CGMMV長距離傳播的主要方式。

早在2002年和2004年，中國口岸檢疫部門就已在從日本進口的瓜類種苗或種子中檢測到了CGMMV[36]；2005年，秦碧霞等報道在廣西觀賞南瓜上檢測到了CGMMV，該南瓜品種是從歐洲、印度、日本等國引種后選育出的[22]；2007年，研究人員在從日本引進的西瓜中檢測到了CGMMV[37]。對不同國家和地區(qū)的CGMMV分離物進行進化樹分析，結果顯示亞洲的中國、日本、韓國被分到了一組，加拿大和以色列分到了一組，西班牙和俄羅斯等歐洲國家被分到了一組，其中中國與日本的CGMMV分離物在遺傳距離上更為接近。這些結果均表明中國大陸的CGMMV很有可能是從日本傳播擴散而來。CGMMV-GDLZ分離物在遺傳距離上與山東、河南、浙江等地的分離物最接近，說明廣東、山東、河南和浙江的CGMMV分離物可能來自相同的傳染源。

圖4 CGMMV-GDLZ分離物在黃瓜、葫蘆和西瓜上的致病性Fig.4 Pathogenicity of CGMMV-GDLZ isolate on cucumber, bottle gourd, and watermelon

接種后15 d，CGMMV-GDLZ在葫蘆以及西瓜上的癥狀已經非常明顯，而在黃瓜上的癥狀卻不明顯；將黃瓜植株由溫度恒定的控溫室移入變溫的開放網(wǎng)室，30 dpi時黃瓜植株開始出現(xiàn)典型的斑駁和花葉，說明CGMMV-GDLZ在不同作物上的發(fā)病時間及發(fā)病溫度有所差異，這些差異可能與不同的作物和品種有關。不同的作物和品種對同種病毒的抗性有很大的區(qū)別，包含抗性基因的作物和品種表現(xiàn)出抗病，反之則表現(xiàn)出感病；另外溫度對植物的抗性水平也起著重要的調控作用，在不同的溫度下植物表現(xiàn)出不同的抗性水平，比如包含Rychc抗性基因的馬鈴薯在不同的溫度下對馬鈴薯Y病毒（Potaoto Y virus，PVY）表現(xiàn)出不同的抗性水平，在22℃下馬鈴薯表現(xiàn)出極端抗性（extreme resistance，ER）水平，只在接種葉上有少量小的壞死斑，上部葉片沒有任何癥狀，而當溫度升至28℃時，接種葉上出現(xiàn)了明顯的壞死斑，上部葉片也開始有少量發(fā)病，另外研究人員還發(fā)現(xiàn)包含有Rychc抗性基因的馬鈴薯栽培品種在夏天比春天更容易出現(xiàn)壞死斑[38]。再如小麥品種Adl-cross在25℃以下對小麥條紋花葉病毒（Wheat streak mosaic virus，WSMV）表現(xiàn)為抗病，而在32℃時則不抗病[39]。這些結果都表明高溫可能會降低抗性基因賦予的抗性，使植物在高溫下更容易感病。黃瓜以及其他瓜類對CGMMV有沒有抗性基因、抗性基因是否受到溫度調控還需進一步研究。

4 結論

侵染廣東省連州市葫蘆的CGMMV-GDLZ分離物全長6 423 nt，與CGMMV-eWT分離物同源性最高，在遺傳距離上與山東、浙江和河南的CGMMV分離物最接近，很可能具有相同的傳染源。CGMMV-GDLZ分離物可以侵染黃瓜、葫蘆和西瓜等作物，但在不同作物上顯癥時間存在差異。

致謝：感謝中國農業(yè)大學植物保護學院王穎副教授惠贈CGMMV CP多克隆抗體；感謝南京農業(yè)大學植物保護學院陶小榮教授惠贈pCB301載體。