胡驍飛，李青梅，姚靜靜，胡思宇，孫亞寧，邢云瑞，鄧瑞廣，張改平,

（1河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002；3河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，鄭州 450002）

0 引言

【研究意義】Alpha-玉米赤霉醇（α-zearalanol），又稱(chēng)玉米赤霉醇（zeranol, ZAL），化學(xué)名稱(chēng)為右環(huán)十四酮酚，霉菌毒素玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）的還原產(chǎn)物[1]，是一種植物性雌激素，能提高植物抗寒抗凍能力及冬小麥的春化[2]。上世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)其有促進(jìn)反芻動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)沉積的功能，提高牛羊飼料轉(zhuǎn)化效率，縮短牛羊育肥周期，因此被作為反芻動(dòng)物促生長(zhǎng)劑而廣泛應(yīng)用，尤其是采用埋置形式[3-4]。隨后的研究證明ZAL對(duì)單胃動(dòng)物如大鼠、狗及猴子是有害的，特別是生殖方面危害[5-8]。雖然ZAL在體內(nèi)大部分會(huì)被代謝掉，但仍有一部分會(huì)殘留在埋置部位。而且通過(guò)食物鏈?zhǔn)秤煤衂AL殘留的牛羊肉后，導(dǎo)致消費(fèi)者促性腺激素水平的降低、內(nèi)分泌失調(diào)、生長(zhǎng)發(fā)育障礙以及影響人體第二性征發(fā)育等不良影響，而且還具有潛在的致癌、致畸、致突變等毒性[9-12]。1996年，歐盟明確禁止在畜禽養(yǎng)殖中使用ZAL，同時(shí)要求向歐盟各國(guó)輸入的畜牧產(chǎn)品中不得檢出其殘留物[4]。2002年，我國(guó)農(nóng)業(yè)部第193號(hào)公告中明確禁止ZAL作為增重劑用于任何食源性動(dòng)物，并且在食源性動(dòng)物的任何可食組織中均不得檢測(cè)到。但是由于ZAL作為牛羊增重劑增重效果好、經(jīng)濟(jì)回報(bào)高等特點(diǎn)，仍被非法使用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】為了減少ZAL危害，人們建立很多種ZAL檢測(cè)方法。目前常用的檢測(cè)方法包括理化法如（高效）液相色譜及其衍生方法[13-19]，氣液相色譜及其衍生方法[20-23]，薄層色譜及其衍生的方法等[24-25]。免疫學(xué)檢測(cè)方法如放射免疫分析法（RIA）、ELISA、熒光免疫分析（FIA）、化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）及免疫傳感器（Immunosensor）[4,26]。理化檢測(cè)方法雖然準(zhǔn)確、靈敏度高，但耗時(shí)長(zhǎng)，費(fèi)用高。而免疫學(xué)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，特異性強(qiáng)，耗時(shí)短，費(fèi)用低，使用便捷，可進(jìn)行大批量篩檢，因而近些年免疫學(xué)檢測(cè)方法得到快速發(fā)展，劉媛等利用玉米赤霉醇單克隆抗體建立ZAL的免疫檢測(cè)方法[27]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】決定免疫學(xué)檢測(cè)方法靈敏度的關(guān)鍵是抗體的質(zhì)量，目前有關(guān)報(bào)道ZAL免疫學(xué)檢測(cè)抗體靈敏度均是ng級(jí)，有的甚至是更高[27-28]，可能是因?yàn)閆AL人工抗原的質(zhì)量不確定，在制備人工抗原過(guò)程中完全或部分改變了ZAL的抗原決定簇，因此導(dǎo)致制備的抗體靈敏度不高，甚至可能并不是ZAL的抗體。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究針對(duì)現(xiàn)有的ZAL抗體制備存在的不足，從抗原制備源頭開(kāi)始，擬通過(guò)利用抗體的非特異性反應(yīng)（交叉反應(yīng)性），利用ZAL結(jié)構(gòu)類(lèi)似物玉米赤霉酮（ZAN）制備抗原，然后免疫動(dòng)物，在抗血清及細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體靈敏度檢測(cè)時(shí)，以ZAL為阻斷劑，從而篩選能分泌抗ZAL單抗的雜交瘤細(xì)胞株，建立一種ZAL抗體制備新方法，為高靈敏的ZAL免疫學(xué)檢測(cè)方法研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2014—2017年在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試劑

α-玉米赤霉醇（ZAL）、β-玉米赤霉醇（β-ZAL）、α-玉米赤霉烯醇（α-ZEL）、β-玉米赤霉烯醇（β-ZEL）、玉米赤霉酮（ZAN）、玉米赤霉烯酮（ZEN）及黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1, AFB1）標(biāo)準(zhǔn)品、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）、卵清蛋白（Ovalbumin, OVA）、非那西丁、過(guò)氧化脲購(gòu)自于Sigma-Aldrich公司。赭曲霉毒素A（Ochratoxin A, OTA）、伏馬菌素B1（FB1）、T-2毒素及嘔吐毒素（Deoxynivalenol, DON）標(biāo)準(zhǔn)品、EDC[1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亞胺由Thermo scientific公司生產(chǎn)；弗氏完全佐劑（Freund's complete adjuvant, FCA）及弗氏不完全佐劑（Freund's incomplete adjuvant, FIA）購(gòu)自于Pierce公司；羧甲基羥胺半鹽酸鹽（CMO）購(gòu)自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；酶標(biāo)記二抗（羊抗鼠IgG抗體，GaMIgG-HRP）購(gòu)自華美生物工程有限公司；ZEN 單克隆抗體，河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備；3, 3′, 5, 5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等其他試劑均購(gòu)自于市售，均為國(guó)產(chǎn)分析純或更高級(jí)別試劑。

1.2 溶液

0.01 mol·L-1，pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS），實(shí)驗(yàn)室自配，室溫保存（注：用于動(dòng)物免疫時(shí)必須經(jīng)高壓滅菌處理）。0.05 mol·L-1，pH9.6碳酸鹽緩沖液（CBS），實(shí)驗(yàn)室自配，室溫保存。ELISA實(shí)驗(yàn)洗液PBST，PBS+0.05% Tween-20，實(shí)驗(yàn)室自配，室溫保存。顯色液A，含有非那西丁及過(guò)氧化脲的0.1 mol·L-1pH5.0乙酸鈉-檸檬酸緩沖液，冷藏避光保存；顯色液B，含有TMB的等量甲醇與甘油混合溶液，實(shí)驗(yàn)室自配；使用時(shí)顯色液A和顯色液B等量混合均勻。終止液：2 mol·L-1硫酸溶液，實(shí)驗(yàn)室自配。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系

SPF級(jí)6周齡雌性BALB/c小鼠，河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖飼養(yǎng)。細(xì)胞融合所用NS0細(xì)胞系，英國(guó)動(dòng)物健康研究院惠贈(zèng)，河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 ZAN人工抗原制備 2 mg ZAN 溶于2 mL無(wú)水吡啶，加入4 mg CMO，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上（115℃）控溫回流2 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，2 mL甲醇（每次1 mL，洗滌2次）洗滌干燥物，旋干；1 mL雙蒸水（DDW）溶解制備所得物，2 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值到8.0；等體積甲苯抽提3次，棄甲苯層，留水相層；水相用等體積乙酸乙酯萃取3次，棄水相，留乙酸乙酯相，旋干，得到ZAN-O。ZAN肟化改造路線(xiàn)見(jiàn)圖1。

0.5 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解上述ZAN-O，轉(zhuǎn)移至有轉(zhuǎn)子的平底玻璃瓶，0.5 mL DMF洗滌旋轉(zhuǎn)瓶，溶液轉(zhuǎn)移至上述玻璃瓶中，磁力攪拌器上攪動(dòng)的同時(shí)向玻璃瓶加入2 mg EDC和1.2 mg NHS，室溫?cái)嚢? h，記為A液。

稱(chēng)取5 mg BSA于放置有轉(zhuǎn)子的平底玻璃瓶中，加入500 μL 0.3% NaHCO3，記為B液。磁力攪拌器上，邊攪拌邊緩慢加入A液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h。

將上述溶液裝入制備好的透析袋內(nèi)，對(duì)PBS透析3 d，第一天換透析液8次，第二天換透析液6次，第三天換透析液4次，得到ZAN-O-BSA。

分別稱(chēng)取和上述一樣質(zhì)量的ZAN，EDC，NHS，和BSA一樣質(zhì)量的OVA（提前1天把OVA溶解于0.3%NaHCO3），采用與上述相同的方法，制備出ZAN-O-OVA。

圖1 ZAN 肟化改造路線(xiàn)圖Fig.1 Roadmap of ZAN structural renovation by oximation

1.4.2 人工抗原的質(zhì)量鑒定 采用河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備的ZEN單克隆抗體對(duì)所制備的人工抗原進(jìn)行鑒定。制備的ZAN-O-BSA及ZAN-O-OVA分別用CBS稀釋到4 μg·mL-1，分別包被酶標(biāo)板，并采用5%（v/v）豬血清封閉酶標(biāo)板，制備出ZAN-O-BSA及ZAN-O-OVA酶標(biāo)板。間接ELISA測(cè)定ZEN單抗效價(jià)[ZEN單抗先用PBS稀釋到1∶5 000（v/v）]，酶標(biāo)板上的孔先分別加入50 μL PBS，然后第一孔加入50 μL上述制備的單抗溶液，移液槍吹打混勻后，取出50 μL加入到第二孔，吹打混勻，取出50 μL加入到第三孔，同樣的方法，一直倍比稀釋到第七孔，混勻后，取出50 μL棄掉，第八孔作為空白（BC）對(duì)照孔；37℃恒溫箱孵育15 min，PBST洗板4—6次，并拍干；加入PBS 1∶1000倍（v/v）稀釋的HRP標(biāo)記的抗IgG抗體50 μL/孔，37℃恒溫箱孵育30 min，PBST洗板4—6次，并拍干；加入顯色液50 μL/孔，室溫孵育10 min，每孔加入50 μL終止液，酶標(biāo)儀450 nm濾光片讀值（OD450）。根據(jù)ZEN效價(jià)的有無(wú)確定抗原制備是否成功。

1.4.3 動(dòng)物免疫及免疫效果測(cè)定

1.4.3.1 動(dòng)物免疫 選取健康的SPF級(jí)6周齡雌性BALB/c小鼠6只，用ZAN-O-BSA進(jìn)行免疫。免疫劑量50 μg蛋白/（200 μL·只老鼠）；采用背部皮下的免疫方式，4—6個(gè)點(diǎn)注射；共免疫4次；間隔3—4周。第一次免疫時(shí)，用PBS稀釋ZAN-O-BSA到100 μg蛋白/200 μL，加入等量的FCA，充分乳化后（取乳化好的乳液一滴，置于水面上，乳滴浮在水面上且不發(fā)生擴(kuò)散，證明乳化完全）注射入BALB/c小鼠皮下。后3次強(qiáng)化免疫時(shí)，把FCA改換為FIA即可，其他試劑及程序不變。

1.4.3.2 免疫效果測(cè)定 四免10 d后，斷尾采血10 μL，加入到990 μL PBS中，5 000 r/min離心10 min，棄沉淀留上清用于血清效價(jià)和靈敏度（即半數(shù)抑制濃度，IC50）測(cè)定。ZAN-O-OVA 2 μg·mL-1包被酶標(biāo)板，5%（v/v）豬血清封閉酶標(biāo)板。間接ELISA測(cè)定血清效價(jià)，步驟同1.4.2中ZEN單抗效價(jià)測(cè)定；結(jié)果判定時(shí)，P/N≥2.1（待測(cè)孔OD450/BC孔OD450≥2.1）且待測(cè)孔 OD450≥0.2，則判定為陽(yáng)性孔。間接競(jìng)爭(zhēng)（阻斷）ELISA測(cè)定血清靈敏度時(shí)，ZAL作為競(jìng)爭(zhēng)物與酶標(biāo)板上包被的ZAN-O -OVA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合血清抗體，把濃度分別為500、250、125、62.5、31.25、15.62、0 ng·mL-1的ZAL標(biāo)準(zhǔn)液，按50 μL/孔分別加入到酶標(biāo)板孔中，然后每孔再加入50 μL血清（血清最終稀釋倍數(shù)是效價(jià)測(cè)定時(shí)，OD450值最為接近于1.0時(shí)對(duì)應(yīng)的稀釋值），后面的試驗(yàn)步驟與效價(jià)測(cè)定完全一致。

1.4.4 ZAL單抗制備及免疫學(xué)性能鑒定

1.4.4.1 陽(yáng)性雜交瘤篩選 選取小鼠血清效價(jià)高，靈敏度好，即IC50值比較小的小鼠作為細(xì)胞融合用小鼠。高壓無(wú)菌處理的PBS稀釋ZAN-O-BSA至50 μg蛋白/200 μL，不加佐劑，直接注射到用于細(xì)胞融合的小鼠腹腔中進(jìn)行超強(qiáng)免疫。3 d后，摘取眼球放血，抻頸處死小鼠，小鼠尸體置于75%酒精中浸泡5 min。超凈臺(tái)上無(wú)菌取小鼠脾臟與NS0細(xì)胞進(jìn)行融合。細(xì)胞融合過(guò)程按孫亞寧[29]描述進(jìn)行，小鼠脾臟細(xì)胞與NS0細(xì)胞融合后，均勻的融合細(xì)胞懸液按100 μL/孔分別加入到96孔酶標(biāo)板上，共鋪10塊酶標(biāo)板，960個(gè)孔，放于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選過(guò)程按胡驍飛等[30]描述進(jìn)行，間接ELISA測(cè)定細(xì)胞上清效價(jià)，阻斷ELISA測(cè)定細(xì)胞上清靈敏度。最終選效價(jià)高、靈敏度好、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔，轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行2次有限稀釋亞克隆化，然后擴(kuò)大培養(yǎng)、建株、反復(fù)凍存與復(fù)蘇，最后篩選到能穩(wěn)定分泌抗ZAL單克隆抗體的細(xì)胞株。收集的眼球血液37℃恒溫箱靜置2 h，5 000 r/min，離心10 min，收集上層陽(yáng)性血清，-20℃保存，作為陽(yáng)性對(duì)照血清，在細(xì)胞融合篩選時(shí)使用。

1.4.4.2 腹水制備 體內(nèi)誘生腹水法批量制備抗體。向小鼠體內(nèi)注入石蠟400 μL/只以誘發(fā)炎癥，7—10 d后注入制備好的雜交瘤細(xì)胞，觀(guān)察小鼠腹部變化，一般小鼠在注射10 d左右，小鼠腹腔變大，小鼠腹腔皮膚緊繃時(shí)，用消毒的大號(hào)針頭刺破腹腔，收集腹腔液體即為腹水。

1.4.4.3 單抗免疫學(xué)性能鑒定 采用one dropTM光譜儀測(cè)定單抗蛋白濃度。

間接ELISA測(cè)定單抗效價(jià)，步驟同1.4.3.2中血清效價(jià)測(cè)定。

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定單抗靈敏度，步驟同1.4.3.2中血清靈敏度測(cè)定。

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定單抗特異性，把競(jìng)爭(zhēng)物替換為ZAL的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物、其他霉菌毒素以及人工抗原制備時(shí)所用的載體蛋白BSA和OVA，不同的競(jìng)爭(zhēng)為物質(zhì)的濃度不同。

親和力曲線(xiàn)測(cè)定按照姚靜靜等[31]描述方法稍作改動(dòng)。PBS稀釋ZAN-O-OVA成0.5 μg·mL-1和1 μg·mL-1兩個(gè)濃度進(jìn)行包板。PBS稀釋單抗蛋白至128 μg·mL-1。在兩個(gè)ZAN-O-OVA濃度包被的酶標(biāo)板上，分別加入倍比稀釋上述已知質(zhì)量濃度的單抗，測(cè)定OD450值，以O(shè)D450為橫坐標(biāo)，單抗?jié)舛葹闄M坐標(biāo)，建立親和力曲線(xiàn)。根據(jù)親和力常數(shù)計(jì)算公式，計(jì)算親和力常數(shù)Ka值[32]。

2 結(jié)果

2.1 人工抗原質(zhì)量分析

紫外掃描測(cè)定ZAN-O-BSA及ZAN-O-OVA的濃度分別為5.78和8.9 mg·mL-1。CBS分別把二者稀釋到4 μg·mL-1包板，測(cè)定ZEN單克隆抗體的效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，ZAN-O-BSA及ZAN-OOVA包被的酶標(biāo)板均能測(cè)定出ZEN單抗的效價(jià)，且隨著抗體濃度的降低，OD450值呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，說(shuō)明制備的人工抗原時(shí)與ZEN抗體可以結(jié)合，人工抗原制備是成功的。

2.2 融合小鼠的篩選

小鼠血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，表明ZAN-O -BSA免疫小鼠后能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。血清靈敏度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，從表3可以看出，6只免疫ZAN-O-BSA的小鼠均能產(chǎn)生抗ZAL抗體，500 ng·mL-1以下濃度的ZAL可以或強(qiáng)或弱地抑制ZAN與血清抗體的結(jié)合。其中6號(hào)小鼠血清靈敏度最好，通過(guò)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖2），可以計(jì)算得出IC50為40.04 ng·mL-1，因此選擇6號(hào)小鼠作為融合小鼠。

2.3 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選

細(xì)胞融合3 d后觀(guān)察酶標(biāo)板，發(fā)現(xiàn)其中898孔有細(xì)胞生長(zhǎng)，其余62個(gè)孔沒(méi)有看見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)，即93.54%細(xì)胞孔有細(xì)胞生長(zhǎng)，說(shuō)明細(xì)胞融合率比較高。待融合細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)孔1/3孔底面積時(shí)，將培養(yǎng)細(xì)胞板各孔的細(xì)胞上清取出25 μL，加入到每孔含有25 μL PBS的ZAN-O-OVA包被的酶標(biāo)板孔中，間接ELISA測(cè)定細(xì)胞上清OD450值，OD450值在1.0以上的認(rèn)為是陽(yáng)性孔，共有44孔，陽(yáng)性孔率為4.58%，以5、2 ng·mL-1兩個(gè)濃度ZAL測(cè)定44個(gè)陽(yáng)性孔細(xì)胞上清液的靈敏度，其中2孔細(xì)胞上清IC50在2 ng·mL-1以下。將這2孔細(xì)胞轉(zhuǎn)至24孔酶標(biāo)板擴(kuò)大培養(yǎng)亞克隆，用1 ng·mL-1ZAL測(cè)定細(xì)胞上清液的靈敏度，選擇IC50在1 ng·mL-1以下陽(yáng)性孔，最終得到一株能分泌抗ZAL單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株12B10A7。

圖2 6號(hào)免疫小鼠血清抑制曲線(xiàn)圖Fig.2 The serum inhibition curve of NO.6 immunized mouse

表1 制備的ZAN-O-BSA及ZAN-O-OVA 包板測(cè)定ZEN單克隆抗體效價(jià)Table 1 The ZEN McAb’s titer detected by microplates coated with the prepared ZAN-O-BSA or ZAN-O-OVA

表2 ZAN-O-BSA免疫小鼠后血清抗體效價(jià)Table 2 The serum titer of mice immunized with ZAN-O-BSA

表3 ZAN-O-BSA免疫小鼠后血清靈敏度Table 3 The serum sensitivity of mice immunized with ZAN-O-BSA

2.4 單抗性能鑒定

光譜儀測(cè)定單抗蛋白濃度約為20.29 mg·mL-1。間接ELISA測(cè)定單抗效價(jià)為2.56×105，結(jié)果見(jiàn)表4。

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定了單抗腹水的靈敏度，其抑制曲線(xiàn)見(jiàn)圖3，線(xiàn)性方程為y=-0.5483x+0.3691，相關(guān)系數(shù)R2=0.9666，通過(guò)公式計(jì)算IC50為0.577 ng·mL-1。

單抗特異性鑒定結(jié)果見(jiàn)表5，從結(jié)果可以看出，所制備的單克隆抗體除了與α-ZAL反應(yīng)外，與ZAN有77.65%的交叉反應(yīng)率，與β-ZAL有43.06%的交叉反應(yīng)率，與α-ZEL和β-ZEL分別有15%左右的交叉反應(yīng)率，與ZEN有近10%的交叉反應(yīng)率，與其他霉菌毒素如AFB1、OTA、FB1、T-2毒素、DON以及載體蛋白BSA、OVA交叉反應(yīng)率均小于0.1%。

表4 ZAL單抗效價(jià)Table 4 The titer of ZAL McAb

表5 ZAL單抗特異性Table 5 The specificity of ZAL McAb

圖3 ZAL單抗的抑制曲線(xiàn)圖Fig.3 The serum inhibition curve of ZAL McAb

親和力曲線(xiàn)測(cè)定如圖4。ZAL mAb與抗原結(jié)合達(dá)半飽和時(shí)對(duì)應(yīng)ZAL mAb的濃度分別是9.04×10-9和8.54×10-9mol·L-1，將所得的值換算成摩爾濃度值帶進(jìn)公式得Ka為6.21×107L·mol-1。GODING認(rèn)為，親和常數(shù)為107—1012L·mol-1時(shí)表明抗體具有高親和力[33]，因此本試驗(yàn)獲得了高親和力的ZAL mAb。

圖4 ZAL單抗親和曲線(xiàn)Fig.4 The affinity curve of ZAL McAb

3 討論

ZAN分子量為320.38，屬小分子半抗原物質(zhì)，由于其自身結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，只具有免疫反應(yīng)性，可以與相應(yīng)的抗體結(jié)合；但不具有免疫原性，因此不能直接刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，必須與大分子的載體物質(zhì)如BSA，OVA，匙孔血藍(lán)蛋白（KLH，Keyhole limpet hemocyanin）或非抗原性的多聚賴(lài)氨酸等偶聯(lián)后，才能具有免疫原性，通過(guò)刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)ZAN的抗體。小分子與載體蛋白偶聯(lián)是否成功需要進(jìn)行質(zhì)量鑒定，鑒定方法一般包括紫外掃描鑒定、凝膠電泳鑒定、紅外光譜法（IR）鑒定、質(zhì)譜鑒定及動(dòng)物免疫鑒定[34-35]。紫外掃描、凝膠電泳、紅外光譜及質(zhì)譜鑒定只是根據(jù)物質(zhì)特征吸收峰有無(wú)變化、載體蛋白分子質(zhì)量變化情況來(lái)初步判定半抗原與載體蛋白是否偶聯(lián)在一起，但不能確定偶聯(lián)方式是否正確，也即偶聯(lián)過(guò)程中是否對(duì)半抗原的特征結(jié)構(gòu)（半抗原的抗原決定簇）產(chǎn)生影響，如果偶聯(lián)過(guò)程中半抗原的抗原決定簇被破壞，則即使半抗原與載體蛋白偶聯(lián)在一起，即使能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體，但所產(chǎn)生的抗體并不是針對(duì)半抗原的抗體。因此，半抗原與載體蛋白偶聯(lián)是否成功，是否能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)半抗原的抗體，最好的方法是通過(guò)免疫動(dòng)物來(lái)確定，或者用已知的半抗原的抗體來(lái)確定。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，制備的玉米赤霉烯酮單克隆抗體與玉米赤霉酮有交叉反應(yīng)性，但和BSA及OVA沒(méi)有交叉反應(yīng)性[36]，因此，本研究中用制備的ZAN-O-BAS及ZAN-O-OVA包板測(cè)定ZEN抗體效價(jià)，以確定ZAN是否與BSA及OVA正確偶聯(lián)，而結(jié)果兩個(gè)人工抗原均能測(cè)定到ZEN抗體效價(jià)，說(shuō)明本研究中的偶聯(lián)方法正確，且制備的人工抗原是成功的，制備過(guò)程并沒(méi)有改變ZAN的抗原決定簇，為后面抗體的制備奠定了良好的基礎(chǔ)。

半抗原、抗原和抗體之間的特異性結(jié)合，其分子機(jī)制是抗原分子表面存在著能與抗體相互作用的部位即抗原決定簇，是抗原表位的空間結(jié)構(gòu)與抗體分子超變區(qū)互補(bǔ)以及氫鍵、疏水性、靜電作用等形成的低能勢(shì)共同作用的結(jié)果[37]，也即抗體是從抗原決定簇的立體結(jié)構(gòu)而不是從抗原的全面分子排列來(lái)“認(rèn)識(shí)”抗原的，因此，半抗原分子的空間構(gòu)像對(duì)抗體免疫學(xué)特性有決定性影響，半抗原分子改造或偶聯(lián)過(guò)程中如果空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，則很可能制備不出所需要的抗體。

交叉反應(yīng)性是指抗體可以與分子結(jié)構(gòu)并不完全相同但具有類(lèi)似抗原決定簇的不同抗原起反應(yīng)，交叉反應(yīng)實(shí)質(zhì)上也是抗原與抗體的特異性結(jié)合。交叉反應(yīng)通常發(fā)生在含有相同結(jié)構(gòu)，特別是相同空間結(jié)構(gòu)的半抗原之間，也可發(fā)生于具有相似抗原決定簇或相似結(jié)構(gòu)部位的半抗原之間[38]。ZAL及ZAN均屬于小分子化合物，根據(jù)分子抗原決定簇?cái)?shù)目計(jì)算公式，分子量小于1萬(wàn)，抗原決定簇只有1個(gè)[39]。ZAN和ZAL二者只是在七位碳原子上的結(jié)構(gòu)（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)表4）有所不同，ZAL的C7位碳原子為羥基，而ZAN為酮基，二者的抗原決定簇可能有一定的交叉重合，因此產(chǎn)生交叉反應(yīng)性。以前的研究證明ZEN抗體與ZAN及ZAL有一定的交叉反應(yīng)[36]，說(shuō)明三者的抗原決定簇至少有部分是重疊的。從ZEN結(jié)構(gòu)上分析可以看出ZEN中C11-C12位點(diǎn)雙鍵肯定是抗原決定簇的一部分，同時(shí)C7位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)也應(yīng)該是抗原決定簇一部分，可能正是由于這兩個(gè)部位結(jié)構(gòu)的不同，導(dǎo)致ZEN單抗與ZAN及ZAL交叉反應(yīng)率的不同，也導(dǎo)致本試驗(yàn)中制備的ZAL單抗與ZEN及ZAL交叉反應(yīng)率的不同。

筆者以往在對(duì)ZAL苯環(huán)上的羥基進(jìn)行改造制備人工抗原時(shí)，可能是破壞了或至少是部分破壞了抗原決定簇，因此導(dǎo)致制備的抗體靈敏度不高，甚至制備的抗體可能不是真正的ZAL抗體，因此用ZAL阻斷ZAL-O-OVA與ZAL-O-BSA免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體反應(yīng)時(shí)，并沒(méi)有見(jiàn)到阻斷作用或阻斷效果不好。而用ZAN肟化改造C7位的酮基時(shí)，改造后其結(jié)構(gòu)與ZAL結(jié)構(gòu)比較相似，可能抗原決定簇比較吻合，因此ZAN-O-BSA免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體，可以與ZAL反應(yīng)，而且反應(yīng)靈敏度比較高。

本研究制備的ZAL抗體與其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物（β-ZAL、α-ZEL、β-ZEL、ZAN、ZEN）有或多或少的交叉反應(yīng)性，用此抗體建立ZAL免疫學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)，即使樣品中不含ZAL，而含有其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，檢測(cè)結(jié)果也可能是陽(yáng)性。由于玉米赤霉醇結(jié)構(gòu)類(lèi)似物也基本都是有害的，如果建立的檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到，則更有利于對(duì)玉米赤霉醇的監(jiān)控。我國(guó)農(nóng)業(yè)部2012年10月1日開(kāi)始實(shí)行的《農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)管理辦法》明確規(guī)定，可以采用快速檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行篩查，然后再通過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的理化檢測(cè)方法進(jìn)行確證，可以保證對(duì)玉米赤霉醇檢測(cè)不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而避免漏檢。

4 結(jié)論

利用制備的人工抗原ZAN-O-BSA免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗血清，玉米赤霉醇作為檢測(cè)靶標(biāo)物，通過(guò)阻斷ELISA篩選，篩選出分泌抗玉米赤霉醇單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，并制備出玉米赤霉醇單克隆抗體，該抗體靈敏度高IC50為577 pg·mL-1，親和力強(qiáng)?；谒狙芯克苽涞膯慰寺】贵w，可以建立玉米赤霉醇酶聯(lián)免疫、化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨、熒光偏振等免疫學(xué)檢測(cè)方法，并可制備玉米赤霉醇膠體金試紙條及拉曼增強(qiáng)膠體金試紙條等快速檢測(cè)產(chǎn)品。