田晴，高丹美，李慧，劉守偉，周新剛，吳鳳芝

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030）

0 引言

【研究意義】西瓜（Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum & Nakai）是我國用量較大的水果之一，其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的經(jīng)濟(jì)地位[1]。在現(xiàn)代集約化農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中，為了追求作物產(chǎn)量和效益的最大化，西瓜連作現(xiàn)象普遍存在。單作系統(tǒng)中，特異性土壤病原菌的積累是西瓜產(chǎn)量損失的重要原因。小麥?zhǔn)呛瘫究谱魑?，具有較強(qiáng)的化感作用，其產(chǎn)生的化感物質(zhì)有異羥肟酸和酚類化合物[2]。研究小麥根系分泌物對連作西瓜土壤中特異性菌群、真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，探明根系分泌物對連作土壤微生物環(huán)境的改善作用，對西瓜枯萎病的生態(tài)防治和菜田土壤的健康保持具有重要的理論意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究發(fā)現(xiàn)，多樣化的管理實(shí)踐（如間作和輪作）可以緩解連作引起的負(fù)面影響，間作小麥增強(qiáng)了西瓜對枯萎病的抗性[3]。間作抑制作物病害的機(jī)制可能與根系分泌物和土壤微生物有關(guān)[4-5]。不同植物分泌的物質(zhì)并不完全相同，所以植物多樣性的變化改變了土壤中根系分泌物的數(shù)量和類型[6]。旱稻的根系分泌物可以改變西瓜根際土壤中微生物的多樣性，增加根際土壤中放線菌的豐度，同時(shí)降低真菌的豐度和病原菌的活性[7]。根系分泌物可通過改變微生物的結(jié)構(gòu)和多樣性間接抑制病原體的生長[8-9]，也可以直接抑制病原菌[10]。土壤微生物在維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[11]。尖孢鐮刀菌屬和木霉菌屬都是絲狀的子囊真菌[12]，木霉菌可以增強(qiáng)植物對病原體的防御能力，并促進(jìn)植物生長[13-14]。此外，木霉菌屬中的某些物種（例如T.asperellum（T-34））是尖孢鐮刀菌的生物控制劑[15]。尖孢鐮刀菌屬中存在致病性和非致病性物種，致病性物種可以感染許多植物并導(dǎo)致作物維管束阻塞，引起植株萎蔫[16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在植物多樣性的種植體系中，土壤中根系分泌物的數(shù)量和類型會(huì)發(fā)生改變從而改變土壤中的微生物[6]。體外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)小麥根系分泌物對西瓜?；图怄哏牭毒幸种谱饔肹17]。例如水稻根系分泌物中有香豆酸而沒有阿魏酸，西瓜根系分泌物則與之相反[18]。目前西瓜幼苗根系分泌物和小麥根系分泌物在西瓜土壤中對微生物相互作用的研究還比較少。前期研究發(fā)現(xiàn)，伴生小麥可以減輕西瓜枯萎病的發(fā)生[19]，這與小麥根系分泌物密切相關(guān)[4]，但小麥根系分泌物是如何調(diào)控真菌群落以及有益微生物來抑制植物病原菌的還不得而知?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用熒光定量和高通量測序技術(shù)，研究外源添加小麥根系分泌物對西瓜連作土壤中真菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，為揭示根系分泌物對微生物群落變化規(guī)律的影響提供理論依據(jù)，也為間作緩解病害的發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年1—7月東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施工程中心日光溫室和園藝園林學(xué)院蔬菜生理生態(tài)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤類型為北方黑土，取自連作3茬西瓜土壤（采用5點(diǎn)取樣法，取其耕層0—15 cm的土混合均勻備用），其銨態(tài)氮30.82 mg·kg-1，硝態(tài)氮25.37 mg·kg-1，速效磷246.31 mg·kg-1，速效鉀256.00 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)30.60 g·kg-1，pH 7.21（1∶2.5，土∶水），EC值1.08 ms·cm-1（1∶2.5，土∶水）。西瓜品種為‘黑美人’（感病品種），購于種子公司。小麥（Triticum aestivumL.）品種為D123，由筆者課題組提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 小麥根系分泌物的收集 將從東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施工程中心塑料大棚中采集閑置4年的土壤（0—15 cm）混合均勻，然后裝入15 cm×13.5 cm的塑料盆中，每盆裝土900 g。每盆播種105粒小麥種子，常規(guī)管理。待小麥苗高20 cm左右時(shí)，將小麥的根系取出，先用自來水沖洗，再用去離子水清洗，將小麥苗置于盛有0.5 mmol·L-1CaCl2的去離子水溶液的塑料杯（500 mL）中，燒杯外包裹錫紙避光。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，取出根后得到的就是小麥根系分泌物[20]。先后用布氏漏斗和兩層0.45 μm濾膜過濾。將根系表面的水分吸干，并對根系稱重。依據(jù)前期的研究發(fā)現(xiàn)小麥根系分泌物的濃度在（1 g/10 mL）時(shí)，對西瓜專化型尖孢鐮刀菌的抑制作用最大[4]。因此，用含0.5 mmol·L-1CaCl2的去離子水溶液定容根系分泌物至1 g根鮮重/10 mL[21]。密封，放于-80℃冰箱中備用。

1.2.2 試驗(yàn)處理設(shè)計(jì) 將西瓜連作土壤裝入15 cm×13.5 cm的塑料盆中，每盆裝西瓜連作土壤900 g。試驗(yàn)設(shè)置有西瓜苗外源添加小麥根系分泌物（WR）、無西瓜苗外源添加小麥根系分泌物（NR）、有西瓜苗外源添加含CaCl2的去離子水溶液（WC）和無西瓜苗外源添加含CaCl2的去離子水溶液（NC）4個(gè)處理。每個(gè)處理6盆，3次重復(fù)，隨機(jī)排列，常規(guī)管理。不噴施藥劑，不施加化肥，人工除草。

1.3 試驗(yàn)方法

西瓜常規(guī)育苗，待西瓜生長至三葉一心時(shí)定植于裝有西瓜連作土的栽培盆中，每5 d用收集到的小麥根系分泌物對西瓜進(jìn)行灌根處理，即分別在西瓜緩苗后的第0、5、10、15、20、25、30和35天將收集的小麥根系分泌物澆灌到每個(gè)盆中，每盆澆灌20 mL到西瓜根部，模擬小麥根系分泌物的作用。西瓜緩苗后的第40天采集不同處理的土壤。以每個(gè)處理6盆土壤的混合樣作為一個(gè)樣本，即每個(gè)處理有3個(gè)重復(fù)樣本。將收集到的土壤樣本過2 mm篩后保存在-80℃冰箱中，用于土壤DNA的提取。

1.3.1 土壤總DNA的提取 取0.25 g土壤樣品，用Power Soil? DNA Isolation Kit（MO BIO Laboratories，CA，USA）按說明提取DNA。對每個(gè)土壤樣品平行提取3次，提取到的溶液混合后待用。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的土壤DNA。使用NanoDrop ND-1000 UV-Vis分光光度計(jì)（Thermo Scientific，Rockwood，TN，USA）檢測提取物的DNA濃度和質(zhì)量（A260/A280）。

1.3.2 qPCR 在IQ5實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Bio-Rad Lab，LA，USA）中測定土壤微生物的豐度?？傉婢?、木霉菌、尖孢鐮刀菌和西瓜?；图怄哏牭毒謩e使用引物ITS1F/ITS4[22]、UtF/UtR[23]、FnSc-1/FnSc-2[24]和Fon-1/Fon-2[24]。

1.3.3 高通量測序 用Illumina MiSeq測序分析土壤真菌群落的組成。用引物ITS1F/ITS2R擴(kuò)增真菌rRNA的ITS1區(qū)域[25]。使用mothur軟件處理獲得的DNA序列。用USEARCH v7.1去除嵌合序列。用UPARSE將具有97%相似性的獨(dú)特序列聚類到操作分類單元（OTU）中。使用含有真菌核糖體RNA序列（版本119）的SILVA數(shù)據(jù)庫對序列進(jìn)行分類。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的整理采用Microsoft Excel（Office 2016）軟件完成。對于Illumina MiSeq測序數(shù)據(jù)，用Mother（version v.1.30.1）計(jì)算Chao1、ACE、Shannon和Inverse Simpson的多樣性指數(shù)。對于Beta多樣性分析，基于Bray-Curtis距離用“R”中的“vegan”作PCoA圖，研究樣本群落組成的相似性或差異性。用Origin8.5軟件做柱形圖。基于Tukey在0.05概率水平上的真實(shí)顯著性差異（HSD）進(jìn)行處理之間的平均比較。

2 結(jié)果

2.1 小麥根系分泌物對西瓜連作土壤真菌群落多樣性的影響

2.1.1 對真菌群落α多樣性的影響 無苗添加小麥根系分泌物處理的Shannon指數(shù)和Inverse Simpson index低于其他處理（P＜0.05）。無苗添加小麥根系分泌物（NR）處理的ACE顯著低于處理WR（P＜0.05）。無苗對照（NC）的Inverse Simpson index顯著低于有苗對照WC（P＜0.05）（圖1）。

2.1.2 對土壤中總真菌、木霉菌、尖孢鐮刀菌和西瓜?；图怄哏牭毒S度的影響 有西瓜苗添加小麥根系分泌物（WR）和無西瓜苗添加小麥根系分泌物（NR）的處理均降低了真菌和尖孢鐮刀菌的菌群豐度（圖2-a，c），且無西瓜苗添加小麥根系分泌物的土壤（NR）中尖孢鐮刀菌的菌群豐度高于有西瓜苗添加小麥根系分泌物的處理（WR）（圖2-c）。有西瓜苗添加去離子水（WC）總真菌的菌群豐度高于無西瓜苗添加去離子水（NC）（圖2-a）。有西瓜苗添加小麥根系分泌物（WR）和無西瓜苗添加小麥根系分泌物（NR）的處理均增加了木霉菌的菌群豐度，并且有西瓜苗添加小麥根系分泌物（WR）的木霉菌菌群豐度較高（圖2-b）。有西瓜苗添加小麥根系分泌物（WR）的處理降低了西瓜?；图怄哏牭毒木贺S度（圖2-d）。

圖1 小麥根系分泌物對真菌群落α多樣性的影響Fig.1 Effects of wheat root exudates on α diversity of fungal communities

2.2 小麥根系分泌物對西瓜連作土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 在門水平上對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響在各處理土壤中，子囊菌門（Ascomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、接合菌門（Zygomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）是主要的真菌門（平均相對豐度＞1%），占真菌序列的94%以上。在無西瓜苗處理中，外源添加小麥根系分泌物增加了Chytridiomycota的相對豐度，但降低了Zygomycota和Basidiomycota的相對豐度。有西瓜苗的處理（WC和WR）中，Chytridiomycota和Zygomycota的相對豐度分別高于無西瓜苗處理（NC和NR）。無苗添加小麥根系分泌物的處理（NR）中Ascomycota的相對豐度高于有西瓜苗的處理（WC和WR）（圖3-a）。

2.2.2 在綱水平上對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響 在綱水平上，糞殼菌綱（Sordariomycetes）、盤菌綱（Pezizomycetes）和壺菌綱（Chytridiomycetes）占真菌序列的78%以上。在無苗處理中，小麥根系分泌物處理中Sordariomycetes和Chytridiomycetes的相對豐度高于對照，但Pezizomycetes和銀耳綱（Tremellomycetes）的相對豐度低于對照。小麥根系分泌處理（NR和WR）中Dothideomycetes的相對豐度高于對照處理（NC和WC）。有西瓜苗的處理（WC和WR）中Sordariomycetes和散囊菌綱（Eurotiomycetes）的相對豐度高于無苗處理（NC和NR），但Pezizomycetes、Dothideomycetes和Tremellomycetes的相對豐度低于無苗處理（NC和NR）（圖3-b）。

圖2 小麥根系分泌物對總真菌（a）、木霉菌（b）、尖孢鐮刀菌（c）和西瓜?；图怄哏牭毒╠）豐度的影響Fig.2 Effects of wheat root exudates on the abundances of total fungi (a), Trichoderma spp.(b), Fusarium spp.(c) and Fusarium oxysporum f.sp.niveum (d)

圖3 小麥根系分泌物對西瓜連作土壤真菌門（a）和綱水平（b）的影響Fig.3 Effects of wheat root exudates on the phylum (a) and class (b) level of fungal in watermelon soil

2.2.3 在屬水平上對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響 在屬水平上（平均相對豐度＞1%），Kernia、Chaetomium、Fusarium和Acremonium是主要的分類群（平均相對豐度＞16%）。無苗添加小麥根系分泌物的處理（NR）中Acremonium的相對豐度高于無苗對照處理（NC），但無苗添加小麥根系分泌物的處理（NR）中Humicola、Mortierella、Cephaliophora和Cryptococcus的相對豐度低于無苗對照處理（NC）。有苗對照處理中Chaetomium和Alternaria的相對豐度低于有苗添加小麥根系分泌物處理（WR），而Fusarium和Podospora的相對豐度高于有苗添加小麥根系分泌物處理（WR）。與有西瓜苗的處理（WC和WR）相比，無苗添加小麥根系分泌物的處理（NR）增加了Acremonium和Rhizophlyctis的相對豐度，但是降低了Chaetomium、Fusarium、Humicola、Mortierella、Podospora和Aspergillus的相對豐度（P＜0.05）（表1）。

表1 小麥根系分泌物對西瓜連作土壤真菌主要屬水平的影響Table 1 Effects of wheat root exudates on the genus level of fungal in watermelon soil

2.2.4 對真菌OTU水平的影響 在OTU水平上，大部分的OTUs（平均相對豐度＞1%）主要屬于子囊菌門。在無西瓜苗的土壤中，在添加小麥根系分泌物的處理中屬于Acremonium和Rhizophlyctis的2個(gè)OTUs的相對豐度較高；在沒有添加小麥根系分泌物的處理中屬于Cephaliophora、Cryptococcus、Acremonium和Mortierella的5個(gè)OTUs相對豐度較高。在有西瓜苗的土壤中，添加小麥根系分泌物的處理中屬于Chaetomium和Mortierella的2個(gè)OTUs的相對豐度較高（P＜0.05）；在沒有添加小麥根系分泌物的處理中屬于Fusarium和Podospora的3個(gè)OTUs的相對豐度較高（表2）。

在所有處理中檢測到13個(gè)OTUs屬于尖孢鐮刀菌屬，3個(gè)OTUs屬于木霉菌屬（平均相對豐度＞0.01%）。OTU168、OTU595、OTU327、OTU307、OTU917和OTU1129分別屬于F.solani、F.brachygibbosum、F.sp、F.delphinoides和T.virens。在尖孢鐮刀菌屬中，WC處理中OTU322、OTU168和OTU307的相對豐度高于其他處理。在木霉菌屬中，WC處理中OTU917的相對豐度高于其他處理（表3）。

表2 小麥根系分泌物對西瓜連作土壤真菌主要OTU水平的影響Table 2 Effect of wheat root exudates on the OTU level of fungal in watermelon soil

2.2.5 對真菌的PCoA分析 PCoA（Principal coordinates analysis）結(jié)果表明不同處理中西瓜連作土壤的真菌群落存在差異（圖4）。在土壤真菌群落中PC1的貢獻(xiàn)率為85.86%，PC2的貢獻(xiàn)率為8.43%。每個(gè)處理的3個(gè)重復(fù)聚在一起，說明真菌群落結(jié)構(gòu)的樣品重復(fù)較好。有苗處理（WC和WR）和無苗處理（NC和NR）在PC1上分開，相距較遠(yuǎn)。無苗處理和有苗處理中，小麥根系分泌物與去離子水（含CaCl2）處理在PC2上分開。說明外源添加小麥根系分泌物和有無西瓜苗的處理在土壤真菌群落組成上存在顯著差異。

3 討論

根系分泌物進(jìn)入土壤后可以被土壤微生物快速的分解[26]。因此，需要定期的將小麥根系分泌物施加到土壤中。根系分泌物對微生物在土壤中的分布具有重要的作用[27]。在本研究中，小麥根系分泌物改變了西瓜連作土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，這與之前的研究結(jié)果一致[28]。無苗且添加小麥根系分泌物處理中真菌的菌群豐度最低，而有苗添加去離子水的處理中真菌的菌群豐度最高。表明小麥根系分泌物可以抑制真菌的豐度，而西瓜根系分泌物可以促進(jìn)真菌的豐度，這是由于根系分泌物的成分不同造成的[29]。無苗且添加小麥根系分泌物的處理中真菌群落的豐富度和多樣性最低，而有西瓜苗的處理中真菌群落的豐富度和多樣性較高，這可能是由于西瓜根系分泌物中的某些物質(zhì)可以誘發(fā)微生物增殖并在根際積累。

表3 小麥根系分泌物對西瓜連作土壤中尖孢鐮刀菌屬和木霉菌屬群落結(jié)構(gòu)的影響Table 3 Effects of wheat root exudates on the community structure of Fusarium and Trichoderma spp.in watermelon soils

圖4 小麥根系分泌物對西瓜連作土壤真菌的主坐標(biāo)分析（PCoA）Fig.4 Effects of wheat root exudates on the principal coordinate analysis of fungi in watermelon soil

作物根系中的碳代謝物可以被土壤微生物同化，所以土壤微生物會(huì)受到碳資源的限制[30]。在該項(xiàng)研究中，小麥根系分泌物增加了與纖維素降解相關(guān)物種的相對豐度，如Chaetomium[31]、Acremonium[32]和Aspergillus[33]；但降低了有致病潛力的物種，如Fusarium[34]、Humicola[35]和Mortierlla[36]的相對豐度。研究表明，微生物與小麥根系分泌物的相互作用改變了真菌群落的結(jié)構(gòu)和豐度，更有利于作物的生長[37-38]。此外，小麥根系分泌物降低了Cephaliophora[39]，Podospora[26]和Cryptococcus[40]的相對豐度，它們具有促進(jìn)植物生長和抑制植物病原體的作用。間作系統(tǒng)有較多的有益微生物和較少的病原微生物，并能引起微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[41]。因此，小麥根系分泌物誘導(dǎo)的西瓜連作土壤中有益微生物的增加和病原微生物的減少可能是間作系統(tǒng)抑制土傳病害的原因之一。

在許多生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)木霉菌是一種有益的真菌，它可以分泌各種化學(xué)物質(zhì)來抑制病原真菌的生長[13]。在本研究中，小麥根系分泌物增加了木霉菌屬的多樣性，并改變了其群落組成。與無苗處理相比，有西瓜苗的處理中增加了木霉菌的豐度，并且添加小麥根系分泌物的處理中木霉菌的豐度更高。這些結(jié)果表明，小麥和西瓜的根系分泌物都可以促進(jìn)木霉菌的豐度，但是在小麥和西瓜根系分泌物的共同作用下木霉菌的豐度最高。這是因?yàn)樾←満臀鞴细捣置谖锒紝δ久咕鷮傥锓N有促進(jìn)作用[42]，且西瓜根系分泌物的某些成分可作為木霉菌的化學(xué)誘導(dǎo)劑[43]。木霉菌屬的許多菌株可以抑制植物病原體，減少植物病害的發(fā)生，并分泌針對真菌細(xì)胞壁的裂解酶[44]，比如，Trichoderma koningii的生物防治活性可以控制小麥的全腐病[45]。小麥根系分泌物引起的木霉菌屬的變化可以單方面地解釋間作對植物病害的抑制作用。

尖孢鐮刀菌從根部傷口或從根毛頂端細(xì)胞間侵入，在維管束導(dǎo)管內(nèi)生長發(fā)育，阻塞導(dǎo)管，影響水分輸送，引起植株萎蔫和分泌毒素，干擾寄主代謝功能，使寄主中毒死亡[46]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻根系分泌物可以抑制尖孢鐮刀菌孢子的萌發(fā)和生長，增強(qiáng)了西瓜對尖孢鐮刀菌的抗性[47]。本研究發(fā)現(xiàn)，與無苗處理相比，有苗處理降低了尖孢鐮刀菌的豐度，并且在添加小麥根系分泌物的處理中尖孢鐮刀菌的豐度最低，在添加去離子水的處理中西瓜?；图怄哏牭毒木贺S度最高。這些結(jié)果表明，西瓜根系分泌物對尖孢鐮刀菌有促進(jìn)作用，而小麥根系分泌物對尖孢鐮刀菌有抑制作用。此外，小麥根系分泌物降低了Fusarium solani和Fusarium delphinoides的相對豐度，它們二者都是植物病原體，可以在多種植物上引發(fā)各種疾病[18,48]。這些結(jié)果表明，小麥根系分泌物可以抑制植物病原菌。

4 結(jié)論

小麥和西瓜根系分泌物改變了總真菌、木霉菌和尖孢鐮刀菌的群落組成。小麥根系分泌物降低了土壤中真菌、尖孢鐮刀菌和西瓜?；图怄哏牭毒木贺S度，增加了木霉菌的菌群豐度，且有西瓜苗添加小麥根系分泌物處理中木霉菌的豐度最高，尖孢鐮刀菌的豐度最低；而西瓜根系分泌物與之相反。說明在西瓜和小麥根系分泌物的共同作用下對有益微生物的擴(kuò)繁作用和對有致病潛力的微生物抑制作用最大。小麥根系分泌物誘導(dǎo)的西瓜連作土壤中真菌群落的變化是小麥/西瓜減緩西瓜病害的原因之一。