童曉紅，查錦芬，丁家望，李 松，李穩(wěn)慧，吳 輝，陳 勇

(1.宜昌市中心人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 宜昌 443003； 2.宜昌市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 宜昌 443003)

缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion，I/R)一直是心肌缺血治療難以解決的問題，迄今為止，臨床用來治療心肌缺血再灌注損傷的藥物仍存在一定的局限性[1]。心肌缺血再灌注損傷(MIRI)指冠狀動脈部分、完全急性阻塞后再通時，缺血心肌雖可恢復正常灌注，但其組織損傷反而加重[1-2]。缺血期患者心肌超微結(jié)構(gòu)、心功能等出現(xiàn)損傷，可誘發(fā)心律失常、心肌細胞壞死、心肌組織損傷、心肌收縮功能的減退等，并且再灌注時產(chǎn)生的氧自由基會進一步加重心肌損傷，甚至可發(fā)生嚴重的心律失常而導致猝死。雖然缺血預處理被證實是減輕I/R損傷的有效方法之一，但多種原因?qū)е缕渑R床應用受限[2]。近年藥物預處理成為I/R損傷研究的熱點。蛋白C系統(tǒng)為機體重要的抗凝系統(tǒng)，由活化蛋白C抑制物(APCI)、血漿蛋白C(PC)、蛋白S(PS)和血栓調(diào)節(jié)素(TM)組成，其中PC是該系統(tǒng)發(fā)揮抗凝效應的重要部分。活化蛋白C(APC)是一種天然的抗凝劑，APC可選擇性滅活FⅤa、FⅧa 及纖溶酶原激活物抑制物(PAI)，從而發(fā)揮強大的抗凝和促纖溶作用。APC作為心肌細胞磷脂酰肌醇信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的重要組成部分，參與了心肌缺血再灌注損傷，心肌缺血再灌注時PKC活性顯著增強除了抗凝作用外，它還能通過抑制炎性因子的轉(zhuǎn)錄與表達，達到抗炎作用，還能通過抑制細胞的凋亡過程有效的預防心肌缺血再灌注損傷[3-5]。本實驗探討APC對心肌缺血再灌注損傷的影響

1 材料和方法

1.1 實驗動物

納入30只體重為220～250 g的SPF級雄性SD大鼠，8周齡；購自三峽大學實驗動物中心[SCXK(鄂)2011-0012]，所有實驗操作均在三峽大學第一臨床醫(yī)學院實驗室[SYXK(鄂)2011-0061]進行，在溫度(22±2)℃，濕度(60±10)%和光照(12 h光照和12 h黑暗循環(huán))條件下，將所有實驗大鼠喂養(yǎng)在無特定病原體的動物房中。每個籠子最多容納5只大鼠，每4～6天更換1次。同時經(jīng)過我院委員會的批準，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

MPO試劑盒購買自上海遠慕生物科技有限公司(貨號：ym-sx1873)；TNF-α試劑盒購買自上海生物科技有限公司(貨號：f00473)；ICAM-1試劑盒購買自上海雅吉生物科技有限公司(貨號：iM-05687b)；APC購買自上海春麥生物科技有限公司(貨號：enz-349)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及模型的制作

30只SD大鼠隨機分為APC組、缺血再灌注(I/R)組和假手術(shù)(Sham)組，各10只。APC組：將APC 100 Ug/kg 溶于1 mL生理鹽水中，再灌注前5 min通過頸外靜脈注射。I/R組和假手術(shù)組注射等體積生理鹽水。

按文獻[6]復制模型，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(劑量為30 mg/kg)麻醉大鼠，切開氣管，插管連接微型動物呼吸機。參數(shù)：潮氣量20 mL/kg，呼吸頻率每分鐘50次，呼吸時比為1∶1。用大頭針將四肢皮下穿刺，然后連接心電圖機記錄一段，對照為正常心電圖。開胸、暴露心臟。APC組和I/R組用5/0縫線在左冠狀動脈前降支根部穿線，在前降支上墊一塑料管一同結(jié)扎，缺血60 min后，剪斷結(jié)扎線再灌注6 h。假手術(shù)組僅在左前降支下穿線不結(jié)扎。手術(shù)完成，每組隨機選取5只大鼠進行心肌梗死面積的檢測，其余大鼠用于病理切片檢測相關(guān)指標。

1.3.2 標本的收集

再灌注6 h末，經(jīng)下腔靜脈采血3 mL，常溫下靜置20 min，以3000 r/min離心10 min，提取血清，置于-20℃冰箱保存；將心臟迅速剪下，并且用生理鹽水進行沖洗，將靠近心尖部分的心肌組織放在10%福爾馬林中進行固定24 h，采用常規(guī)石蠟進行包埋。另一塊快速放入液氮中進行速凍，-80℃保存[7]。

1.3.3 指標檢測

心肌組織石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟。切片經(jīng)脫蠟后，參照ICAM-1試劑盒說明書用SP法進行免疫組化染色，光鏡下每張切片隨機選擇5個高倍視野進行半定量分析[8]。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血清TNF-α的濃度，采用硫代巴比妥酸比色法測定心肌組織MPO的水平；HE染色觀察各組心肌組織病理學改變。

表1 各組大鼠心肌梗死面積的比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與I/R組比較，△P<0.01。

Note. Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with the I/R group,△P<0.01.

表2 各組血清TNF-α水平及心肌組織MPO含量的比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01; 與I/R組比較，△P<0.01。

Note. Compared with the sham operation group,*P<0.05. Compared with the I/R group,△P<0.01.

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死面積比較

與假手術(shù)組比較，I/R組和APC組大鼠心肌梗死面積明顯增加(P<0.01)，而APC組大鼠心肌梗死面積較I/R組明顯減少(P<0.05)(見表1)。

2.2 血清TNF-α水平和心肌組織MPO水平的測定

與假手術(shù)組比較，I/R組和APC組血清TNF-α的水平明顯升高(P<0.01)，而APC組TNF-α的水平較I/R組明顯降低(P<0.01)。在I/R組和APC組心肌組織MPO的水平與假手術(shù)組比較明顯升高(P<0.01)；與I/R組比較，APC組心肌組織MPO水平明顯降低(P<0.05)(見表2)。

2.3 心肌組織ICAM-1免疫組化染色

與假手術(shù)組比較，I/R組和APC組ICAM-1的表達水平明顯升高(P<0.05)與I/R組比較，APC組心肌組織ICAM-1的表達明顯減少(P<0.05),(見圖1A、1B)。

2.5 HE染色觀察各組心肌組織病理學變化

再灌注6 h后，假手術(shù)組未見炎性細胞浸潤，心肌細胞包膜完整；與I/R組比較，APC組心肌組織炎性細胞浸潤明顯減少(見圖2)。

3 討論

心肌缺血再灌注能夠觸發(fā)急性炎癥反應所具備條件，包括補體激活，心肌內(nèi)化學因子和細胞因子產(chǎn)生，細胞外基質(zhì)降解和細胞死亡，活性氧生成和微血管通透性增強[9]。近年來有關(guān)心肌缺血再灌注損傷等血栓性疾病與活化蛋白C密切相關(guān)?；罨鞍證是人體重要抗凝因子，其缺乏可導致血栓性疾?。荒负脱ㄕ{(diào)節(jié)蛋白相互結(jié)合時可以激活APC，從而達到抗凝效果。血漿PC系統(tǒng)主要包括血漿蛋白C、PS、APCI和TM等，當凝血酶與TM結(jié)合形成復合物時可激活PC，滅活FⅤa/FⅧa，達到抗凝及促纖溶目的。PS為輔因子可加強PC活性，APCI可降低PC活性。研究表明，心肌缺血再通后血小板聚集率明顯增高。患者若出現(xiàn)心肌缺血，血漿中 TM含量大幅度上升，與凝血酶形成復合物，消耗血漿APC，同時活化的血小板釋放大量 APC抑制血漿APC活性。冠狀動脈再灌注后血流急劇增加，血液呈高凝狀態(tài)，抗凝系統(tǒng)活化，進而激活APC，血漿FPS代償增多以抵抗高凝狀態(tài)。

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05; 與I/R組比較，#P<0.01。圖1 心肌組織ICAM-1免疫組化染色Note. Compared with the sham group,*P<0.05. Compared with the I/R group,#P<0.01.Figure 1 Myocardial tissue ICAM-1 immunohistochemical staining

圖2 心肌組織HE染色Figure 2 HE staining of myocardial tissue

APC是存在于血漿中的維生素K依賴性的胰島素樣絲氨酸蛋白酶，生理情況下是血液中的主要抗凝成分，同時近年來的研究顯示其具有抗炎、抗凋亡及保護內(nèi)皮屏障的功能。它的細胞保護效應可以中和細胞損傷，使細胞得以存活并且其效應的發(fā)揮依細胞和損傷類型的不同而不同，主要表現(xiàn)為抗炎、抗凋亡、改變基因表達譜和穩(wěn)定內(nèi)皮細胞屏障的功能。炎癥是機體的防御性反應，主要表現(xiàn)為血流速度加快、血管通透性增加。中性粒細胞在化學趨化因子的作用下滲出血管外在受損組織大量集聚浸潤同時釋放大量炎性因子如 TNF-α，IL-1β，IL-6，NO，誘導 TNF 的表達導致了大量的凝血酶的產(chǎn)生，這些反應修復現(xiàn)存的組織損傷同時造成進一步的損傷：使凝血和抗凝血平衡紊亂從而促進血栓形成和炎癥反應。機體可釋放 IL-4、IL-10 產(chǎn)生進一步代償炎癥反應。在人體內(nèi)，活化蛋白 C 可以減少白細胞與選擇素的連接從而抑制中性粒細胞在體內(nèi)的活化和白細胞產(chǎn)物的定位；抑制核因子 NF-кB 的核轉(zhuǎn)移從而減少單核細胞炎性因子如 TNF-α的釋放；通過內(nèi)皮蛋白 C 受體(EPCR)減少白細胞釋放的促炎細胞因子；通過抑制凝血酶的生成和功能的發(fā)揮從而間接抑制其促炎效應；促進纖維蛋白溶解，防止血栓形成，減輕炎癥反應。活化蛋白 C與內(nèi)皮蛋白 C 受體結(jié)合，激活蛋白激酶活化受體-1(PAR-1)，從而激活上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化因子(SIP-1)轉(zhuǎn)錄，活化內(nèi)皮生長因子-1，減少 TNF-α誘導的細胞凋亡。活化蛋白 C 可抑制凋亡基因表達，促進細胞的增殖。研究表明其亦可以通過蛋白激酶活化受體復合物阻礙細胞凋亡誘導因子-1 轉(zhuǎn)錄，增加抗凋亡基因 Bcl-2 、凋亡蛋白抑制物的表達，抑制 Caspase-3、Caspase-9、P21 及 P53 等誘導的細胞凋亡。研究表明其亦可以通過蛋白激酶活化受體復合物阻礙細胞凋亡誘導因子-1 轉(zhuǎn)錄，從而誘導細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)再灌注6 h心肌組織中有明顯的炎性反應，而與對照組比較，APC組的心肌損傷、炎性細胞浸潤有所減輕。相關(guān)表明APC能夠改善大鼠腎臟缺血再灌注損傷腎血流量，減少白細胞在腎組織的浸潤、遷移，降低維持腎小球通過性的穩(wěn)定和在受損腎組織內(nèi)纖維素沉積[10-11]。相關(guān)研究表明APC能夠通過下調(diào)血漿髓過氧化物酶、IL-8、TNF-α水平，來改善受損骨骼肌的電生理作用[12-13]。TNF-α是一種重要的炎性因子，它能刺激血管內(nèi)皮細胞表達黏附分子，并促進產(chǎn)生中性粒細胞趨化因子[14-15]。本次研究我們發(fā)現(xiàn)APC能明顯降低再灌注血清TNF-α的水平，同時減少心肌組織中MPO的含量，降低了ICAM-1的表達水平，減少了炎性細胞與血管內(nèi)皮的接觸機會，在心肌缺血再灌注中具有抗炎作用。

在凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復合物的作用下蛋白C所形成的APC具有抗凝、抗炎、粗纖溶以及抗凋亡和保護內(nèi)皮的功能。它通過調(diào)節(jié)炎性因子的產(chǎn)生，降低血管內(nèi)皮細胞ICAM-1的表達來減輕炎性損傷。目前APC已被廣泛用于膿毒癥的治療，降低了全身炎性反應的病死率[16]同樣本次研究也證實了APC通過抑制缺血再灌注的炎性反應明顯改善了再灌注后的心肌損傷。同時為心肌缺血再灌注損傷臨床干預提供新的途徑。