葉彬彬 黃維潔

浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(325000)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)是一個(gè)多因素疾病，多數(shù)致病原因未知[1]。迄今為止，關(guān)于RSA的研究方向主要集中在免疫反應(yīng)和炎癥介質(zhì)有關(guān)的遺傳和表觀遺傳多態(tài)性上，并在反復(fù)流產(chǎn)和免疫機(jī)制之間產(chǎn)生了重要聯(lián)系[2-3]。異常的免疫學(xué)機(jī)制可能導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)[4]。茯苓多糖是茯苓的主要成分之一，對(duì)免疫功能具有調(diào)節(jié)作用。茯苓是臨床治療RSA方劑的常用藥物，但茯苓多糖成分對(duì)RSA的治療作用及其機(jī)制尚不完善[5-6]。輔助性T淋巴細(xì)胞(Th細(xì)胞)和調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg細(xì)胞)在人類免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，與是否成功受孕相關(guān)[7]。本研究通過建立RSA小鼠模型，分析茯苓多糖對(duì)RSA小鼠妊娠結(jié)局及Th細(xì)胞/Treg細(xì)胞免疫平衡調(diào)節(jié)的影響，初步探究茯苓多糖對(duì)RSA的治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性CBA/J小鼠，未產(chǎn)；雄性DBA/2小鼠，雄性BALB/c小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量20～22 g，鼠齡7周，購自上海睿太莫斯生物科技有限公司，許可證號(hào)SCXK(滬)2016-0001。經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵守3R保護(hù)原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2藥品與試劑茯苓多糖(REL-FLDT30)由西安瑞爾麗生物工程有限公司生產(chǎn)；小鼠白細(xì)胞介素22(IL-22)(SEKM-0023)、小鼠IL-17(SEKM-0018)、IL-10(SEKM-0010)、TGF-β(SEKR-0012)試劑盒購自北京Solarbio公司；CD4(46-0041-82)、CD25(17-0251-82)、IL-17(12-7177-81)和Foxp3(12-5773-82)抗體購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3主要儀器CX41型生物顯微鏡由日本Olympus公司生產(chǎn)；CytoFLEX型流式細(xì)胞儀由美國BioRad公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型制備、分組及給藥將購買的小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，觀察無異常表現(xiàn)后入組。參考建模方法[8]，分別取雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2小鼠或BALB/c小鼠按照2:1比例合籠交配，建立CBA/J+DBA/2復(fù)發(fā)性流產(chǎn)模型和CBA/J+BALB/c正常妊娠模型，以檢出陰栓當(dāng)天(第0天)計(jì)為妊娠受孕。將CBA/J+BALB/c正常妊娠模型小鼠設(shè)置為對(duì)照組(n=10)，CBA/J+DBA/2 RSA造模成功小鼠隨機(jī)分為模型組(n=10)、茯苓多糖低劑量組(n=11)、中劑量組(n=10)、高劑量組(n=11)和陽性對(duì)照組(n=10)。妊娠第1天，給予對(duì)照組和模型組等量蒸餾水灌胃處理，茯苓多糖低、中、高組和陽性對(duì)照組分別給予蒸餾水溶解的50、100、200 mg茯苓多糖、156 mg/kg黃體酮膠囊灌胃處理，灌胃體積0.1 ml/10 g，每天1次，連續(xù)16d。

1.2.2RSA小鼠妊娠結(jié)局觀察末次給藥4 h后，稱重各組小鼠，麻醉后采用頸椎脫臼法處死各組小鼠，打開腹部，暴露子宮，記錄胚胎著床數(shù)目以及吸收數(shù)目，計(jì)算胚胎丟失率，胚胎丟失率=丟失胚胎數(shù)/(丟失胚胎數(shù)+存活胚胎數(shù))。清除子宮組織中胚胎及脂肪組織等，清洗后，濾紙吸干保存于-80℃中。同時(shí)觀察子宮生長(zhǎng)情況。無菌條件下收集各組小鼠脾臟、胸腺組織，-80℃保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3RSA小鼠脾臟和胸腺指數(shù)檢測(cè)將上述保存的小鼠脾臟、胸腺組織，洗滌后濾紙吸干，稱重，計(jì)算脾臟和胸腺指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器重量/體重。

1.2.4RSA小鼠子宮組織Th17、Treg細(xì)胞檢測(cè)將上述收集的子宮組織研磨，IV型膠原酶消化過濾后制成1×107個(gè)/ml單細(xì)胞懸液，取100 μl加入一抗CD4、IL17、CD25和FOXP3反應(yīng)30 min.，經(jīng)PBS清洗、離心、棄上清后，添加500 μl PBS充分混勻，流式細(xì)胞儀上檢測(cè)CD4+和IL17+雙陽性細(xì)胞即為Th17細(xì)胞，CD4+、CD25+和FOXP3+陽性細(xì)胞為Treg細(xì)胞，計(jì)算Th17/Treg細(xì)胞比值。

1.2.5RSA小鼠子宮組織CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)取100 μl 上述制備的子宮組織單細(xì)胞懸液，加入一抗CD3、CD4和CD8染色30 min，經(jīng)PBS清洗、離心、棄上清后，添加500 μl PBS充分混勻，流式細(xì)胞儀上檢測(cè)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比。

1.2.6RSA小鼠子宮組織IL-17、IL-22、IL-10和TGF-β表達(dá)檢測(cè)另取上述子宮組織研磨，PBS勻漿后離心，棄上清液，按IL-17、IL-22、IL-10和TGF-β試劑盒說明書，檢測(cè)各組小鼠上述因子。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠妊娠情況

小鼠胚胎丟失率，對(duì)照組最低(4.21±0.13)%，模型組最高(57.36±6.20)%；茯苓多糖低(40.83±7.22)%、中(28.69±6.06)%、高劑量組(10.35±3.17)%依次降低，陽性對(duì)照組降低(16.33±4.72)%，均P<0.05。

2.2 各組小鼠脾臟和胸腺指數(shù)

小鼠脾臟和胸腺指數(shù)，模型組RSA均低于對(duì)照組；與模型組相比，茯苓多糖低、中、高劑量組RSA小鼠脾臟和胸腺指數(shù)依次升高，陽性對(duì)照組升高(均P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠脾臟和胸腺指數(shù)比較

2.3 各組小鼠子宮組織Th17、Treg細(xì)胞值

與對(duì)照組相比，模型組小鼠子宮組織Th17細(xì)胞比例、Th17/Treg比值均升高，Treg細(xì)胞比例降低(P<0.05)；與模型組相比，茯苓多糖低、中和高劑量組RSA小鼠子宮組織Th17細(xì)胞比例、Th17/Treg比值依次降低，Treg細(xì)胞比例依次升高(均P<0.05)，陽性對(duì)照組上述指標(biāo)變化趨勢(shì)與茯苓多糖各組一致。見圖1、圖2，表2。

圖1 各組小鼠子宮組織Th17細(xì)胞比例

圖2 各組小鼠子宮組織Treg細(xì)胞比例

表2 各組小鼠子宮組織Th17、Treg細(xì)胞比例及Th17/Treg比較

2.4 各組小鼠子宮組織中免疫因子表達(dá)

與對(duì)照組相比，模型組小鼠IL-17和IL-22表達(dá)升高，IL-10和TGF-β表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組相比，茯苓多糖低、中和高劑量組小鼠IL-17和IL-22表達(dá)依次降低，IL-10和TGF-β表達(dá)依次升高(均P<0.05)，陽性對(duì)照組與上述各指標(biāo)變化趨勢(shì)與茯苓多糖各劑量組一致。見表3。

表3 各組小鼠子宮組織免疫因子水平表達(dá)比較

2.5 各組小鼠子宮組織CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞

與對(duì)照組相比，模型組小鼠子宮組織CD4+數(shù)量、CD4+/CD8+比值降低，CD8+數(shù)量升高(P<0.05)；與模型組相比，茯苓多糖低、中和高劑量組RSA小鼠子宮組織CD4+數(shù)量、CD4+/CD8+比值依次升高，CD8+數(shù)量依次降低(均P<0.05)，陽性對(duì)照組上述指標(biāo)變化趨勢(shì)與茯苓多糖各組一致。見表4。

表4 各組RSA小鼠子宮組織淋巴細(xì)胞比較

3 討論

RSA致病原因復(fù)雜且較少循證診斷策略，至今病因尚無明確說法[9]。雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2小鼠交配是目前國際公認(rèn)的RSA模型經(jīng)典方法，其胚胎丟失率高于正常妊娠小鼠[10]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠胚胎吸收率均顯著高于對(duì)照組，提示建模成功。

胸腺和脾臟指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)均顯著降低，初步判斷RSA可能導(dǎo)致小鼠整體免疫力下降。茯苓多糖具有降血糖、抗腫瘤、消炎和增強(qiáng)免疫力等藥理功效[12]。劉坤等[13]發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖可以增強(qiáng)小鼠的抗原特異性體液免疫反應(yīng)。本研究給予RSA小鼠茯苓多糖治療，胚胎丟失率呈劑量依賴性減少，胸腺和脾臟指數(shù)顯著增加，提示茯苓多糖可能通過調(diào)節(jié)RSA小鼠的免疫功能，改善妊娠結(jié)局。原始CD4+細(xì)胞可以分化為包括Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞的T細(xì)胞， CD4+T細(xì)胞及其相關(guān)的細(xì)胞因子在母胎免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，其中Th17/Treg細(xì)胞比例失衡被認(rèn)為是RSA的原因[14-15]，因此推測(cè)茯苓多糖對(duì)RSA妊娠結(jié)局的保護(hù)作用可能與Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)，但仍待進(jìn)一步驗(yàn)證。

Th17細(xì)胞屬于CD4+T淋巴細(xì)胞的Th亞型，能夠產(chǎn)生IL-17和IL-22炎性因子，募集中性粒細(xì)胞，引起自身免疫和炎癥反應(yīng)[16]。相比之下，Treg細(xì)胞可以產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β，抑制免疫細(xì)胞活性及免疫反應(yīng)，維持免疫穩(wěn)態(tài)[17]。妊娠期間，Th17比率下降有利于抑制母體免疫排斥提高妊娠率，反之增加流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)[18]。此外，CD4+ CD25+Foxp3+ Treg細(xì)胞對(duì)于胎兒免疫耐受性至關(guān)重要[19]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組RSA小鼠Th17細(xì)胞比率以及炎癥因子IL-17和IL-22表達(dá)顯著升高，Treg細(xì)胞比例及炎癥因子IL-10和TGF-β表達(dá)顯著降低，Th17/Treg值顯著升高，提示導(dǎo)致RSA小鼠妊娠結(jié)局不良的原因可能與Th17/Treg免疫失衡有關(guān)。給予茯苓多糖治療后，上述各指標(biāo)得到顯著改善，Th17/Treg值呈劑量依賴降低，提示茯苓多糖能夠減緩RSA小鼠子宮組織中Th17/Treg穩(wěn)態(tài)失調(diào)。王慧蓮等[20]研究發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖能夠通過提高系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)Treg并降低Th17細(xì)胞比例，達(dá)到治療效果，因此推測(cè)茯苓多糖可能通過調(diào)節(jié)RSA小鼠體內(nèi)Th17/Treg平衡，發(fā)揮妊娠保護(hù)作用。此外，CD8+是另一種重要的T淋巴細(xì)胞亞群，CD4+/CD8+細(xì)胞比例異常也導(dǎo)致RSA發(fā)生[21]。本研究初步發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖治療后，RSA小鼠子宮組織CD4+/CD8+細(xì)胞失衡得到緩解，提示茯苓多糖可能對(duì)子宮組織周圍CD4+/CD8+免疫細(xì)胞異常具有調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，茯苓多糖對(duì)RSA小鼠的妊娠結(jié)局具有保護(hù)作用，可能與調(diào)節(jié)Th17/Treg、CD4+/CD8+免疫失衡有關(guān)，這可能為茯苓多糖治療RSA的潛在機(jī)制。然而成功妊娠涉及孕婦的生理變化以及胎兒和母親之間細(xì)胞因子、血管生成介質(zhì)和激素復(fù)雜相互作用，同時(shí)RSA涉及的免疫因素比較復(fù)雜，因此需聯(lián)合臨床試驗(yàn)更深入地探索其機(jī)制。