劉玉蘭，李澤澤，陳文彥，張家楓，馬宇翔

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

我國稻谷年產(chǎn)量超過兩億 t。米糠是稻米加工過程的副產(chǎn)物，年產(chǎn)量約1 500萬 t。米糠含油率18%～20%，若將全部米糠資源用于制油，米糠油產(chǎn)量將超過 200萬 t[1]。米糠油的脂肪酸組成合理，并且含有豐富的谷維素、生育酚、植物甾醇等活性營養(yǎng)成分，是公認(rèn)的營養(yǎng)價值很高的食用植物油。隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展和人民生活水平的大幅提高，食品安全問題受到更加廣泛的關(guān)注。作為一日三餐必不可少的食用油，其食品安全同樣也受到更多關(guān)注。油脂科研工作者和油脂生產(chǎn)企業(yè)高度重視食用油中安全風(fēng)險成分的防范和控制[2]，通過對先進(jìn)技術(shù)的研發(fā)應(yīng)用，持續(xù)提升產(chǎn)品的安全品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)，為消費者提供更好的食用油產(chǎn)品。

3-氯丙醇（3-chloro-1,2-pxopanediol，3-MCPD）酯和縮水甘油酯（glycidyl fatty acid esters，GEs）是近年來受到關(guān)注的食品中包括食用油中的安全風(fēng)險成分[3-4]。3-MCPD酯對人體健康的危害除自身帶有一定的毒性之外[5-6]，其在腸道中被脂肪酶水解生成3-MCPD經(jīng)人體吸收也產(chǎn)生毒性[7]。2011年，國際癌癥研究機構(gòu)將3-MCPD列為2B級即“可能的人類致癌物”[8-9]。德國風(fēng)險評估委員會根據(jù)毒理學(xué)實驗提出GEs本身不具有致癌性，但其在體內(nèi)經(jīng)脂質(zhì)代謝產(chǎn)生的縮水甘油是具有基因毒性的致癌物[6]。經(jīng)研究發(fā) 現(xiàn)[10-12]，影響食用油脂中3-MCPD酯和GEs含量的因素可能有多種，歸納為兩類即待精煉毛油品質(zhì)和油脂精煉工藝條件。油脂高溫脫臭過程是3-MCPD酯和GEs形成的最主要工序[13]，而在此過程中氯離子的存在能夠促使3-MCPD酯和GEs的形成[14]。Freudenstein等[15]研究認(rèn)為甘一酯和甘二酯是3-MCPD酯的前體物質(zhì)，能夠促進(jìn)3-MCPD酯和GEs的形成。而這些前體物質(zhì)主要由待精煉毛油帶入及油脂脫臭之前的各精煉工序帶入，如待精煉毛油中含有的游離脂肪酸、甘一酯、甘二酯及氯離子[16-17]， 油脂脫臭之前的水化脫膠、堿煉脫酸、吸附脫色等工序使用的加工助劑如磷酸、堿液、熱水、固體吸附劑中含有的氯離子等[18-20]。王璐陽等[21]研究報道了油脂脫臭過程直接蒸汽中氯離子含量與脫臭后油脂中3-MCPD酯和GEs含量呈正相關(guān)。Zulkurnain等[22]的研究也得到基本一致的結(jié)論。但有關(guān)待精煉毛油中甘一酯、甘二酯含量與酸價之間的相關(guān)性以及在毛油堿煉脫酸過程中甘一酯、甘二酯隨酸價降低與否和降低幅度的相關(guān)研究鮮見報道。

本研究選擇酸價普遍較高的米糠毛油作為實驗原料，對不同酸價米糠毛油中甘一酯、甘二酯、3-MCPD酯、GEs含量進(jìn)行檢測，分析研究米糠毛油酸價與上述物質(zhì)含量的關(guān)系，然后選取酸價差別比較大的2 種米糠毛油進(jìn)行堿煉脫酸，對堿煉脫酸油中上述指標(biāo)進(jìn)行檢測，分析不同酸價米糠毛油在堿煉脫酸過程中甘一酯、甘二酯、3-MCPD酯、GEs含量的變化，以及谷維素、VE、植物甾醇、塑化劑等成分的變化，以期為米糠油精煉過程3-MCPD酯和GEs的風(fēng)險防范與控制以及提升米糠油安全品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同酸價的米糠浸出毛油樣品4 個，均取自米糠油加工企業(yè)。

標(biāo)準(zhǔn)品：氘代油酸縮水甘油酯（純度≥97%）、油酸縮水甘油酯（純度≥97%）、3-油酸-氯丙醇酯（純度≥ 97%）、1,2-二亞油酸-3-氯丙醇酯（純度≥97%）、1,2-二月桂酸-3-氯丙醇酯-D5（純度≥97%） 上海安普實驗科技股份有限公司；5α-膽甾烷醇標(biāo)準(zhǔn)配品（純度≥95%） 美國Sigma公司；α-生育酚、β-生育酚、 γ-生育酚、δ-生育酚、生育三烯酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 北京三區(qū)生物技術(shù)有限公司；氯化鈉為優(yōu)級純；苯基硼酸（純度≥97%）、正己烷、甲醇、異丙醇、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、甲苯、乙酸及環(huán)己烷，均為色譜純；乙醚、溴化鈉、硫酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）、硫酸鈉、碳酸氫鈉、無水硫酸鎂、石油醚、乙醇、冰乙酸、三氯甲烷、氫氧化鉀、碘化鉀、氯仿、淀粉、硫代硫酸鈉、鹽酸，均為分析純；超純水由Milli-Q超純水機制得。

1.2 儀器與設(shè)備

Ttacel310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）氣相毛細(xì)管色譜柱 美國 Thermo Fisher公司；7990B氣相色譜儀 美國Agilent公司；e 2 6 9 5 液相色譜儀、2 4 2 4 蒸發(fā)光檢測器、2475熒光檢測器 美國Waters公司；UItimate SiO2（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱 月旭科技 （上海）股份有限公司；MTN-2800W氮吹濃縮儀 美國奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠毛油的堿煉脫酸

1.3.1.1 低酸價毛油的一次堿煉脫酸

稱取180～200 g經(jīng)脫膠后的米糠毛油，于電熱恒溫水浴鍋中加熱至25 ℃，邊攪拌邊緩慢滴加已計量好的16 °Be’燒堿溶液，反應(yīng)20 min左右，在出現(xiàn)油皂分離現(xiàn)象時，將油樣快速升溫至60 ℃，并同時調(diào)慢攪拌速度，大約10 min，當(dāng)油皂明顯分離時停止反應(yīng)。將油樣轉(zhuǎn)入玻璃離心管中，在3 000 r/min離心20 min使油、皂分層，將上層的油脂取出，加熱至95 ℃左右，然后用微沸的蒸餾水洗滌，直至洗滌廢水呈中性，再進(jìn)行減壓干燥脫除水分，即獲得一次堿煉脫酸油

1.3.1.2 高酸價毛油的兩次堿煉脫酸

對于高酸價米糠毛油若采用一次堿煉工藝，因加堿量和堿液濃度大，容易造成堿煉過程油脂乳化和油脂損耗過高，因此采用兩次堿煉脫酸工藝，即先將高酸價毛油按照上述一次堿煉脫酸的條件（同樣采用16 °Be’的堿液）進(jìn)行堿煉脫酸，再選用12 °Be’的堿液對一次堿煉脫酸后的油脂進(jìn)行二次堿煉脫酸，之后水洗，干燥脫水，即獲得兩次堿煉脫酸油。

在堿煉脫酸過程中，加堿量為理論加堿量與超量堿之和，理論加堿量按堿煉過程脫除游離脂肪酸的量計算得到，超量堿取油質(zhì)量的0.2%。

1.3.2 米糠油質(zhì)量指標(biāo)的檢測

酸價測定參照GB 5009.229—2016《食品中酸價的測定》；過氧化值測定參照GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》；色澤測定參照GB/T 22460—2008《動植物油脂 羅維朋色澤的測定》；VE含量測定參照GB/T 26635—2011《動植物油脂生育酚及生育三烯酚含量測定 高效液相色譜法》；谷維素含量測定參照LS/T 6121.1—2017《糧油檢驗 植物油中谷維素含量的測定 分光光度法》；植物甾醇測定參照GB/T 25223—2010《動植物油脂 甾醇組成和甾醇總量的測定 氣相色譜法》；脂肪酸組成測定參照GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》。

1.3.3 甘油酯組分含量的測定

參照孟祥河[23]甘油酯含量的定量分析方法，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器對米糠油中甘一酯、甘二酯含量進(jìn)行檢測，并計算出甘一酯、甘二酯和甘三酯的相對含量。

高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測器條件：柱溫40 ℃，漂移管溫度7 0 ℃，蒸發(fā)器溫度6 0 ℃，N2壓力25 Psi，進(jìn)樣量10 μL；流動相為正己烷-異丙醇-乙酸 （98.9∶1∶0.1，V/V）。

1.3.4 3-MCPD酯和GEs的測定

參照GB 5009.191—2016《食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的測定》第三法以及苗雨田[24]、任我行[25]等方法。

1.3.4.1 樣品前處理

稱取100 mg（+5 mg）米糠油于具塞玻璃試管中，依次加入3-MCPD酯、GEs內(nèi)標(biāo)溶液和甲基叔丁基醚，充分混勻溶解，再加入NaBr酸性水溶液，于50 ℃振蕩反應(yīng)15 min；用NaHCO3溶液終止反應(yīng)，之后加入正己烷分離提取，將提取物氮吹至干后，用甲基叔丁基醚復(fù)溶；通過加入硫酸甲醇溶液，以完成轉(zhuǎn)化反應(yīng)；終止反應(yīng)之后，加入硫酸鈉和正己烷分離凈化，再用乙酸乙酯-乙醚混合溶液分離，用無水硫酸鎂去除上層液中的水分；加入苯基硼酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)，然后氮吹至干，復(fù)溶后，過濾裝入進(jìn)樣小瓶。

1.3.4.2 色譜條件

色譜柱：含5%苯基亞芳基聚合物或5%苯基-甲基聚硅氧烷的弱極性毛細(xì)管氣相色譜-質(zhì)譜柱（30 m×0.25 μm，0.25 μm）；載氣為氦氣，流速 1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣，不分流時間0.5 min，溶劑延遲時間5 min；程序升溫：50 ℃保持1 min，以2 ℃/min升至90 ℃，再以 40 ℃/min升至270 ℃，并保持5 min。

1.3.4.3 質(zhì)譜條件

電子電離源；電離能量70 eV；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度280 ℃；掃描方式為選擇離子監(jiān)測模式。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 2010、SPSS 25軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Duncan法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酸價米糠毛油的堿煉脫酸效果

對4 個米糠毛油樣品酸價、過氧化值、色澤的測定結(jié)果，以及對其中2 個毛油經(jīng)堿煉脫酸的效果見表1。

表 1 不同酸價米糠毛油的堿煉脫酸效果Table 1 Deacidification effects of alkali smelting on rice bran oils with different acid values

從表1可見，從不同工廠采集的4 個米糠毛油樣品的酸價有明顯差異，其中3號毛油的酸價最低，4號毛油的酸價最高，同時4號毛油的色澤也明顯較其他毛油深。對低酸價的3號毛油進(jìn)行一次堿煉脫酸，加堿量為1.78 g，堿液濃度為16 °Be’，經(jīng)堿煉其酸價由10.34 mg/g降至0.52 mg/g。對高酸價的4號毛油進(jìn)行兩次堿煉脫酸，第1次堿煉的加堿量為3.61 g，堿液濃度16 °Be’，堿煉后其酸價由23.86 mg/g降至7.64 mg/g，第2次堿煉的加堿量為2.41 g，堿液濃度為12 °Be’，堿煉油酸價降至0.51 mg/g。2 個米糠毛油樣品經(jīng)堿煉脫酸，其過氧化值均有所升高。樣品3經(jīng)堿煉其色澤明顯變淺，這是堿煉皂腳吸附部分色素的結(jié)果。但樣品4的色澤基本沒有變化，這可能是米糠原料在酸敗過程中伴隨品質(zhì)劣變產(chǎn)生的再生色素溶解于毛油中的緣故，這些再生色素明顯比天然色素更難于脫除[26]。

2.2 不同酸價米糠毛油堿煉前后甘油酯組分含量的變化

對4 個米糠毛油樣品的甘油酯組成及其中2 個毛油樣品經(jīng)堿煉脫酸后甘油酯組成的檢測結(jié)果見表2。

表 2 不同酸價米糠毛油堿煉前后的甘油酯組分含量Table 2 Contents of glyceride components in rice bran oils with different acid values before and after alkali smelting

由表2可見，4 個米糠毛油隨其酸價的升高，其中甘一酯、甘二酯含量明顯升高，甘三酯含量隨之下降。酸價最高的毛油樣品4中甘三酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為70.31%，甘一酯和甘二酯總量（29.69%）顯著高于低酸價的其他毛油，比低酸價的毛油樣品3中甘一酯和甘二酯總量（15.38%）高出14.31%。這說明當(dāng)米糠品質(zhì)發(fā)生劣變時，其中甘三酯在脂肪酶的作用下發(fā)生酸敗分解，逐步分解成為甘二酯、甘一酯、游離脂肪酸，甘二酯、甘一酯作為甘三酯分解為游離脂肪酸的中間產(chǎn)物，伴隨著游離脂肪酸的增多而增多，也即隨著毛油酸價的升高而含量增多。

由表2還可以看出，米糠毛油經(jīng)堿煉脫酸后，其中甘一酯、甘二酯含量隨酸價的降低有所降低，但降低幅度有限，與酸價降低幅度的差距很大。酸價較低的3號米糠毛油，經(jīng)堿煉其酸價由10.34降低至0.52，但甘一酯和甘二酯總質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅從15.38%降低至12.24%，高酸價的4號米糠毛油，經(jīng)堿煉其酸價由23.86 mg/g降低至0.51 mg/g， 但甘一酯和甘二酯總質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅從2 9.6 9%降低至26.29%。這說明堿煉脫酸過程對甘一酯和甘二酯的脫除作用很有限。

2.3 不同酸價米糠毛油堿煉前后3-MCPD酯和GEs含量的變化

對4 個米糠毛油樣品中3-MCPD酯、GEs含量及其中2 個毛油樣品經(jīng)堿煉脫酸后3-MCPD酯、GEs含量的檢測結(jié)果見表3。

表 3 不同酸價米糠毛油堿煉前后的3-MCPD酯和GEs含量Table 3 Contents of 3-MCPD ester and GEs in rice bran oil with different acid values before and after alkali smelting mg/kg

從表3可以看出，4 個米糠毛油中3-MCPD酯含量為1.44～1.98 mg/kg、GEs含量為0.34～0.55 mg/kg。4 個毛油樣品中3-MCPD酯含量的排序為樣品1＞樣品3＞樣品4＞ 樣品2，而由2.1節(jié)可知4 個毛油酸價的排序為樣品4＞樣品1＞樣品2＞樣品3，對比可見米糠毛油中3-MCPD酯含量與酸價之間似乎沒有呈現(xiàn)正相關(guān)，即其含量并未隨酸價升高而升高。但酸價最高的毛油樣品4中GEs含量最高，酸價最低的毛油樣品3中GEs含量最低，米糠毛油酸價與GEs含量似乎呈現(xiàn)正相關(guān)，這可能是因為隨米糠毛油酸價升高，甘一酯、甘二酯含量升高，更易形成環(huán)酰氧鎓離子，為GEs的形成創(chuàng)造了條件[27]。根據(jù)周紅茹[13]的研究，毛油或未精煉植物油中3-MCPD酯含量在檢測限以下或者是微量，然而王璐陽[28]對玉米油、菜籽油、大豆油、花生油、葵花籽油等毛油中3-MCPD酯和GEs含量檢測的結(jié)果顯示，其范圍分別為0.084～0.863 mg/kg 和0.028～0.721 mg/kg。本實驗測得米糠毛油中存在3-MCPD酯且含量較高，這揭示了酸價顯著高于其他品種毛油的米糠毛油中3-MCPD酯和GEs含量可能會達(dá)到一個較高水平。

從表3 還可以看出，通過堿煉脫酸，米糠油中3-MCPD含量和GEs含量均有所下降，樣品3的降幅分別為26.6%和23.5%，樣品4的降幅分別為26.1%和43.6%，這與酸價降低及甘一酯、甘二酯含量降低相對應(yīng)。說明堿煉脫酸過程包括堿煉脫酸油的水洗過程對3-MCPD和GEs的脫除有一定的作用，其原因可能是3-MCPD酯和GEs在堿煉過程中被皂腳吸附脫除或被水洗脫除，因此致使其含量降低。

2.4 不同酸價米糠毛油及堿煉前后的主要脂肪酸組成

如表4所示，4 種不同酸價米糠毛油中主要脂肪酸組成及其含量相差不大，其中不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的80%左右，主要由油酸（C18:1）和亞油酸（C18:2）組成，油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為36%～40%，亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為37%～42%，脂肪酸組成與WHO和FAO推薦的脂肪酸黃金配比很接近。堿煉脫酸前后米糠油中主要脂肪酸組成基本沒有變化。

表 4 不同米糠油的主要脂肪酸組成Table 4 Main fatty acid composition of different rice bran oils %

2.5 不同酸價米糠毛油及堿煉前后營養(yǎng)成分含量變化

表 5 不同米糠油中的谷維素含量Table 5 Oryzanol contents in different rice bran oils %

由表5可見，4 個米糠毛油中谷維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.82%～2.62%，谷維素含量豐富。經(jīng)堿煉脫酸，谷維素含量顯著降低。毛油樣品3經(jīng)堿煉后谷維素?fù)p失率為76%，毛油樣品4經(jīng)一次堿煉后谷維素?fù)p失率為64%，二次堿煉相對于一次堿煉谷維素?fù)p失率僅為8.5%，兩次堿煉的總損失率為67.2%?？梢姡瑢τ诟咚醿r的米糠油采用兩次堿煉工藝對減少谷維素?fù)p失是有利的，因為在兩次堿煉工藝中，每一次堿煉過程均可采用較小的堿液濃度，這有利于谷維素的保留[29]。

表 6 不同米糠油中VE含量Table 6 VE contents in different rice bran oils mg/100 g

由表6可見，米糠毛油中含有組分齊全的4 種生育酚和4 種生育三烯酚，其中以α-生育酚含量最多（占19.6～21.5 mg/100 g），其次是α-生育三烯酚（占12.5～16.6 mg/100 g）。經(jīng)堿煉脫酸VE含量明顯降低，毛油樣品3堿煉后VE損失率為19.5%，毛油樣品4經(jīng)兩次堿煉后VE損失率為29.8%。堿煉脫酸過程VE的損耗可能是被皂腳吸附，也可能是在堿性條件下發(fā)生了自身損耗[30]。

表 7 不同米糠油中甾醇含量Table 7 Sterol contents in different rice bran oils mg/100 g

如表7所示，米糠毛油中含有豐富的植物甾醇，4 個毛油樣品中甾醇含量為1 130.19～1 562.97 mg/100 g，其中以谷甾醇含量最高，平均占總甾醇含量的51.1%，其次是菜油甾醇約占19.7%。堿煉脫酸過程造成甾醇含量降低，毛油樣品3堿煉后甾醇損失率為23.6%，毛油樣品4經(jīng)兩次堿煉后甾醇損失率為39.3%，在一次堿煉中的損失率（29.0%）大于二次堿煉，說明堿液濃度和堿煉次數(shù)都會對甾醇損失造成影響，為減少甾醇損失，應(yīng)盡量采用淡堿并減少堿煉次數(shù)。

3 結(jié) 論

通過對4 個不同酸價（10.34～23.86 mg/g）米糠毛油樣品的檢測發(fā)現(xiàn)，其中甘油三酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70.31%～84.62%，甘一酯和甘二酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)量為15.38%～29.69%，甘一酯和甘二酯含量隨毛油酸價的升高而顯著升高；3-MCPD酯含量為1.44～1.98 mg/kg，GEs含量為0.34～0.55 mg/kg，這2 種成分與毛油酸價之間未顯示出明確的相關(guān)性。對2 個酸價差別較大的米糠毛油進(jìn)行堿煉脫酸后發(fā)現(xiàn)，甘一酯、甘二酯含量隨油脂酸價的降低而有所降低，但降低幅度有限，低酸價毛油中甘一酯和甘二酯總質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅從15.38%降低至12.24%，高酸價毛油中甘一酯和甘二酯總質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅從29.69%降低至26.29%。3-MCPD酯和GEs含量在堿煉脫酸過程均有明顯下降，兩個毛油樣品中3-MCPD酯和GEs含量的平均降幅分別為26.35%和33.55%，這可能緣于堿煉過程皂腳的吸附脫除作用或水洗脫除作用。此外，堿煉造成米糠油中營養(yǎng)成分的損失，其中谷維素?fù)p失率為64%～76%，VE損失率為19.5%～29.8%，甾醇損失率為23.6%～39.3%。