黃瑞杰，李 媚，廖安平，藍(lán) 平，鐘 磊，覃 琴，藍(lán)麗紅，王雪嬌，韋麗明，甘蘭芳

（廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西多糖材料及改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006）

右旋糖酐酶（E.C. 3.2.1.11）是一種可以特異性水解右旋糖酐中α-1,6糖苷鍵的酶[1-2]。臨床級(jí)別特定分子質(zhì)量的右旋糖酐在醫(yī)藥領(lǐng)域有重要應(yīng)用，中低分子質(zhì)量的右旋糖酐（重均分子質(zhì)量（mw）20～70 kDa）可以用作血漿替代品[3]，用于治療休克；右旋糖酐T10（mw≈10 kDa）具有滲透性利尿作用[4]；微分子質(zhì)量的右旋糖酐（mw＝6～8 kDa）可以絡(luò)合鐵用于治療缺鐵性貧血[5]；mw不足5 kDa的右旋糖酐可以進(jìn)行硫酸化修飾，得到具有抗凝血特性的產(chǎn)物，用于抗血栓治療，其衍生物還具有抗病毒特性[4]。右旋糖酐在食品和輕工業(yè)方面也有重要的應(yīng)用[6-7]，高分子質(zhì)量的右旋糖酐（mw＞1 000 kDa）可用作色譜柱填充劑[8]；右旋糖酐 （100 kDa＜mw＜1 000 kDa）可以作為飲料和糕點(diǎn)制作中的乳化劑、穩(wěn)定劑、保濕劑和增稠劑[9]。中低分子質(zhì)量右旋糖酐衍生物可以用作藥物載體[10]，特小分子質(zhì)量的右旋糖酐可用于制備具有益生元功能的右旋糖酐 衍生物[11]。天然發(fā)酵的右旋糖酐因分子質(zhì)量和黏度太大不能直接進(jìn)行使用，所以要將其降解到特定分子質(zhì)量以滿足使用。右旋糖酐的降解方法有物理法、化學(xué)法和生物法，其中物理法主要是超聲法[12-13]，該法操作簡(jiǎn)單，有機(jī)溶劑使用較少，但耗能量大，不適合大規(guī)模生產(chǎn)[14]；化學(xué)法主要是酸解法，主要采用鹽酸進(jìn)行降解，這種方法反應(yīng)速率快，但得到的產(chǎn)物有大量氯化物殘留，而且能耗高、污染大、設(shè)備易受腐蝕[15-16]；生物降解法為右旋糖酐酶法，此反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速率快、能耗低、污染小[17]，可調(diào)控得到各種特定分子質(zhì)量右旋糖酐以及功能性低聚糖[18]，這為低能耗、高品質(zhì)右旋糖酐產(chǎn)品的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

對(duì)于右旋糖酐mw的測(cè)定，大多采用凝膠色譜法，通過示差檢測(cè)器分析[5,19]，這種方法依賴于流速控制和標(biāo)準(zhǔn)曲線，而標(biāo)準(zhǔn)曲線反映的是保留時(shí)間和峰位分子質(zhì)量（mp）之間的關(guān)系，mw測(cè)定只能依賴于對(duì)測(cè)得的mp推算；再者右旋糖酐在降解過程中分布不均一，得到mp不能反映mw，這就造成了mw測(cè)量過程中極大的誤差。近年來，多角度激光光散射儀與凝膠色譜聯(lián)用成為大分子聚合物分子質(zhì)量測(cè)定的熱點(diǎn)。王濤[20]和Pawcenis[21]等采用多角度激光光散射儀與凝膠色譜聯(lián)用分別測(cè)定聚硅氧烷和纖維素的mw，測(cè)定方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確。多角度激光光散射儀可從多個(gè)角度對(duì)散射光進(jìn)行檢測(cè)，收集散射光的強(qiáng)度，并直接得到絕對(duì)mw和其他分子質(zhì)量的數(shù)據(jù)。將凝膠色譜與光散射方法聯(lián)用，不依賴于泵速、標(biāo)準(zhǔn)曲線就可得到高分子聚合物的mw、mp、數(shù)均分子質(zhì)量（mn）、質(zhì)均分子質(zhì)量（mz）和分子質(zhì)量分布（mw/mn）[22]。

本實(shí)驗(yàn)以右旋糖酐mw和mw/mn為指標(biāo)，采用十八角度激光光散射儀與凝膠色譜法聯(lián)用進(jìn)行右旋糖酐的mw和mw/mn測(cè)定，比較不同條件下酸解法和酶解法調(diào)控降解右旋糖酐分子質(zhì)量的情況，對(duì)得到的右旋糖酐產(chǎn)物進(jìn)行比較，分析兩種方法的優(yōu)劣，為酶解法生產(chǎn)特定分子質(zhì)量的右旋糖酐產(chǎn)品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

右旋糖酐T5、T20、T50、T80、T500、T2000（mw≈5.52、19.2、48.6、80.9、472.6、1 901 kDa；mw/mn≈1.57、1.499、1.24、1.27、1.52、3.21） 美國(guó)Sigma試劑公司；鹽酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；圓弧青霉（Penicillium cyclopium，CICC-4022） 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 儀器與設(shè)備

DAWN HELEOS II型十八角度激光光散射儀（配有ASTRA 7.1.3軟件） 美國(guó)Wyatt公司；凝膠液相色譜儀（配有2414型示差折光檢測(cè)器、1525型泵） 美國(guó)Waters公司；高效液相色譜儀（配有RID-10A折射率檢測(cè)器、LC-20AD泵） 日本島津公司；傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo公司；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（配有OXFORD X-MaxN51-XMX1004能譜儀） 德國(guó)卡爾蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 純化酶液的制備

配制圓弧青霉產(chǎn)酶培養(yǎng)基[23]，裝液量6 0 m L（250 mL錐形瓶）、接種量3%、發(fā)酵溫度30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min培養(yǎng)72 h得到發(fā)酵液；于4 ℃、10 000 r/min離心20 min得到的上清液為粗酶液；粗酶液經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀和凝膠過濾層析得到純化酶液[24]，稀釋數(shù)倍備用。

1.3.2 右旋糖酐酶活力測(cè)定

右旋糖酐酶活力通過測(cè)定右旋糖酐酶降解右旋糖酐T70生成的還原糖量表示，還原糖含量通過3,5-二硝基水楊酸法進(jìn)行測(cè)定[25]。右旋糖酐酶活力（1 U）被定義為在50 ℃、pH 5條件下每小時(shí)水解右旋糖酐T70產(chǎn)生1 mg還原糖（葡萄糖當(dāng)量）所需要的酶量[26]。

1.3.3 右旋糖酐分子質(zhì)量的測(cè)定

1.3.3.1 色譜條件

凝膠色譜柱：UltraOhydroGelTM2000（7.8 m m×300 mm）、UltraOhydroGelTM250（7.8 mm×300 mm）、UltraOhydroGelTMDP120A（7.8 mm×300 mm）；流動(dòng)相：0.1 mol/L硝酸鈉和0.03%疊氮鈉；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：0.2 mL；柱溫：35 ℃；示差檢測(cè)器溫度：35 ℃；十八角度激光光散射儀折光指數(shù)增量（dn/dt）：0.138。

1.3.3.2 樣品處理

酸解樣品為反應(yīng)結(jié)束用氫氧化鈉中和至pH 6.0～7.0，流動(dòng)相稀釋10 倍，用0.22 μm的水系針頭過濾備用；酶解樣品為反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴3～5 min滅活酶液，流動(dòng)相稀釋10 倍，用0.22 μm的水系針頭過濾備用。

1.3.3.3 圖像處理

樣品出峰后，采用美國(guó)Wyatt公司的十八角度激光光散射儀配有的ASTRA 7.1.3軟件進(jìn)行圖像處理，出峰時(shí)以示差信號(hào)為準(zhǔn)，收峰時(shí)以激光信號(hào)為準(zhǔn)，得到右旋糖酐的mw和mw/mn。

1.3.4 酸解右旋糖酐mw和mw/mn的調(diào)控

1.3.4.1 溫度對(duì)右旋糖酐降解的影響

用1 mol/L的鹽酸水解底物質(zhì)量濃度為30 mg/mL的右旋糖酐T80，底物與酸按體積比1∶1加入，搖勻后分別于70、80、90、100 ℃水解。間隔數(shù)分鐘取樣，進(jìn)行右旋糖酐mw和mw/mn的測(cè)定。

1.3.4.2 底物分子質(zhì)量對(duì)右旋糖酐降解的影響

用1 mol/L的鹽酸分別水解底物質(zhì)量濃度為30 mg/mL的右旋糖酐T20、T80、T500、T2000，底物與酸按體積比1∶1加入，于90 ℃反應(yīng)。間隔數(shù)分鐘取樣，進(jìn)行右旋糖酐mw和mw/mn的測(cè)定。

1.3.4.3 鹽酸濃度對(duì)右旋糖酐降解的影響

分別用濃度為0.5、1、2、4 mol/L的鹽酸水解底物質(zhì)量濃度為30 mg/mL的右旋糖酐T2000，底物與酸按體積比1∶1加入，于90 ℃水解反應(yīng)。間隔數(shù)分鐘取樣，進(jìn)行右旋糖酐mw和mw/mn的測(cè)定。

1.3.4.4 底物質(zhì)量濃度對(duì)右旋糖酐降解的影響

用1 mol/L的鹽酸水解底物質(zhì)量濃度分別為10、30、50、70 mg/mL的右旋糖酐T2000，底物與酸按體積比1∶1加入，于90 ℃水解。間隔數(shù)分鐘取樣，進(jìn)行右旋糖酐mw和mw/mn的測(cè)定。

1.3.5 酶解右旋糖酐mw和mw/mn的調(diào)控

1.3.5.1 酶活力對(duì)右旋糖酐降解的影響

將純化過的右旋糖酐酶用pH 5的醋酸鹽緩沖液稀釋到酶活力分別為2、4、6、8 U/mL，分別水解底物質(zhì)量濃度為30 mg/mL的右旋糖酐T2000（pH 5的醋酸鹽緩沖液配制）。底物預(yù)熱10 min，酶液與底物按體積比1∶1加入，于50 ℃水解。間隔數(shù)分鐘取樣，進(jìn)行右旋糖酐mw和mw/mn的測(cè)定。

1.3.5.2 溫度對(duì)右旋糖酐降解的影響

用6 U/mL的右旋糖酐酶水解底物質(zhì)量濃度為30 mg/mL 的右旋糖酐T2000，右旋糖酐酶與右旋糖酐底物均用pH 5的醋酸鹽緩沖液配制。底物預(yù)熱10 min，酶液與底物按體積比1∶1加入，分別于40、45、50、55 ℃水解。間隔數(shù)分鐘取樣，進(jìn)行右旋糖酐mw和mw/mn的測(cè)定。

1.3.5.3 pH值對(duì)右旋糖酐降解的影響

用6 U/mL的右旋糖酐酶水解底物質(zhì)量濃度為30 mg/mL 的右旋糖酐T2000，右旋糖酐酶與右旋糖酐底物分別用pH值為4、5、6、7的醋酸鹽緩沖液配制。底物預(yù)熱10 min，酶液與底物按體積比1∶1加入，于50 ℃水解。間隔數(shù)分鐘取樣，進(jìn)行右旋糖酐mw和mw/mn的測(cè)定。

1.3.5.4 底物質(zhì)量濃度對(duì)右旋糖酐降解的影響

用6 U/mL的右旋糖酐酶分別水解底物質(zhì)量濃度為10、30、50、70 mg/mL的右旋糖酐T2000，右旋糖酐酶與右旋糖酐底物均用pH 5的醋酸鹽緩沖液配制。底物預(yù)熱10 min，酶液與底物按體積比1∶1加入，于50 ℃水解。間隔數(shù)分鐘取樣，進(jìn)行右旋糖酐mw和mw/mn的測(cè)定。

1.3.5.5 底物分子質(zhì)量對(duì)右旋糖酐降解的影響

用6 U/mL的右旋糖酐酶分別水解底物質(zhì)量濃度為30 mg/mL的右旋糖酐T20、T80、T500、T2000，右旋糖酐酶與右旋糖酐底物均用pH 5的醋酸鹽緩沖液配制。底物預(yù)熱10 min，酶液與底物按體積比1∶1加入，于50 ℃水解。間隔數(shù)分鐘取樣，進(jìn)行右旋糖酐mw和mw/mn的測(cè)定。

1.3.6 右旋糖酐水解產(chǎn)物分析

1.3.6.1 產(chǎn)物處理

采用酸解法和酶解法分別降解右旋糖酐T2000，都調(diào)控到mw為40 kDa左右。將得到的右旋糖酐溶液加入到數(shù)倍體積的無水乙醇中，得到乳白色的懸浮液，靜置24 h使其自然沉淀，將沉淀冷凍干燥得到右旋糖酐固體，將其于研缽中研成粉末以供進(jìn)行紅外光譜和氯離子殘留的分析。

1.3.6.2 最終水解產(chǎn)物分析

右旋糖酐最終水解產(chǎn)物用高效液相色譜進(jìn)行分析，80%乙腈作為流動(dòng)相。葡萄糖、異麥芽糖和異麥芽三糖被用作標(biāo)準(zhǔn)品。水解數(shù)小時(shí)至反應(yīng)不再進(jìn)行，水解產(chǎn)物用流動(dòng)相稀釋10 倍，11 000×g離心20 min。上清液用0.22 μm的針頭過濾器過濾，并通過高效液相色譜分析。其中使用Polaris NH2柱（4.6 mm×250 nm），柱溫35 ℃、流速1.0 mL/min，用RID-10A折射率檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.6.3 紅外光譜分析

采用傅里葉紅外光譜儀對(duì)1.3.6.1節(jié)得到的右旋糖酐產(chǎn)品主要官能團(tuán)進(jìn)行分析，確定降解之后右旋糖酐結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變，標(biāo)準(zhǔn)品采用右旋糖酐T40（mw≈40 kDa）。將溴化鉀研磨成粉末，將右旋糖酐與溴化鉀按照質(zhì)量比1∶200進(jìn)行混合壓片，以溴化鉀空白作為背景進(jìn)行校準(zhǔn)，儀器條件為：掃描波長(zhǎng)范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1。進(jìn)行右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的檢測(cè)。

1.3.6.4 氯化物殘留分析

采用能譜進(jìn)行右旋糖酐氯離子濃度檢測(cè)，樣品為1.3.6.1節(jié)制得，標(biāo)準(zhǔn)品為右旋糖酐T40。制樣方法52：將導(dǎo)電膠固定在鋁片上，取少量右旋糖酐于導(dǎo)電膠上，用洗耳球吹去未黏附的樣品，進(jìn)行噴鉑處理。采用掃描電鏡和能譜進(jìn)行氯離子殘留的測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

右旋糖酐的mw、mw/mn等數(shù)據(jù)都是通過十八角度激光光散射儀配有ASTRA 7.1.3軟件進(jìn)行圖像處理得到；除樣品色譜圖是儀器的峰圖外，其余圖像皆采用Origin 8.5制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 右旋糖酐譜圖與誤差分析

圖 1 樣品色譜圖Fig. 1 Chromatograms of samples

由圖1可知，樣品示差、激光譜圖都呈現(xiàn)對(duì)稱的正態(tài)分布峰，出峰狀態(tài)良好。采用十八角度激光光散射儀配有的ASTRA 7.1.3軟件進(jìn)行圖像處理，出峰時(shí)以示差信號(hào)為準(zhǔn)，收峰時(shí)以激光信號(hào)為準(zhǔn)，得到右旋糖酐的mw與mw/mn。

表 1 右旋糖酐的mw與mw/mn的誤差分析Table 1 Error analysis of mw and mw/mn of dextran

由表1可知，十八角度激光光散射儀與凝膠色譜聯(lián)用測(cè)出的右旋糖酐mw與mw/mn誤差較小，mw相對(duì)誤差低于3.281%，mw/mn相對(duì)誤差小于4.611%。由此可見，此法相對(duì)誤差較小，測(cè)量準(zhǔn)確，可以用于右旋糖酐mw與mw/mn的檢測(cè)。

2.2 酸解右旋糖酐mw和mw/mn的調(diào)控

2.2.1 溫度對(duì)右旋糖酐降解的影響

表 2 溫度對(duì)右旋糖酐T80降解的影響Table 2 Effect of acid hydrolysis temperature on degradation of dextran T80

右旋糖酐的降解速率可以用mw減小的程度表示，mw減小的越快，右旋糖酐的降解速率越大。由表2可知，溫度對(duì)鹽酸降解右旋糖酐的影響較大，溫度越高，降解速率越快。根據(jù)表2，將mw為80 kDa的右旋糖酐降解到10 kDa，100 ℃時(shí)需要5 min，90 ℃時(shí)需要12 min，80 ℃時(shí)需要45 min，70 ℃時(shí)降解到30 kDa需要60 min；溫度越高右旋糖酐降解越快，得到設(shè)定mw的時(shí)間越短，對(duì)反應(yīng)越有利，但是溫度太高，反應(yīng)過快，mw難以調(diào)控。為較快并且較好的調(diào)控得到設(shè)定mw的右旋糖酐，選擇90 ℃作為酸解反應(yīng)溫度較為合理。隨著右旋糖酐mw的降低，mw/mn逐漸減小，mw低于10 kDa時(shí)，mw/mn基本小于2。

2.2.2 底物分子質(zhì)量對(duì)右旋糖酐降解的影響

表 3 不同mw右旋糖酐的降解情況Table 3 Degradation efficiencies of dextran with different molecular masses

底物mw越大，鹽酸降解速率越快。根據(jù)表3可知，相同的時(shí)間間隔降解速率為：T2000＞T500＞T80＞T20。當(dāng)右旋糖酐的mw為100～1 000 kDa時(shí)，右旋糖酐的mw/mn值比較大，因?yàn)榻到獬跗谌芤褐泻懈鞣N分子質(zhì)量的右旋糖酐，此時(shí)右旋糖酐均一性較差；隨著反應(yīng)的進(jìn)行，右旋糖酐的均一性逐漸良好，mw/mn變小。如表3所示，酸解右旋糖酐T2000，mw為437.1 kDa時(shí)，mw/mn為4.414；當(dāng)mw降低為9.965 kDa時(shí)，mw/mn減小為1.668。

2.2.3 鹽酸濃度對(duì)右旋糖酐降解的影響

表 4 鹽酸濃度對(duì)右旋糖酐T2000降解的影響Table 4 Effect of hydrochloric acid concentration on degradation of dextran T2000

由表4可知，鹽酸濃度越大，降解速率越快。采用2 mol/L和4 mol/L的鹽酸降解右旋糖酐T2000，經(jīng)過8 min和2 min就可右旋糖酐mw降解到10 kDa以下；而采用鹽酸濃度為1 mol/L和0.5 mol/L的鹽酸，將右旋糖酐T2000降解到10 kDa需要16 min和30 min以上。鹽酸濃度越大，得到設(shè)定mw的右旋糖酐時(shí)間越短，但反應(yīng)速率太快，mw難以進(jìn)行調(diào)控。為較快并且較好調(diào)控得到設(shè)定mw的右旋糖酐，選擇1 mol/L的鹽酸較為合理。

2.2.4 底物質(zhì)量濃度對(duì)右旋糖酐降解的影響

表 5 底物質(zhì)量濃度對(duì)右旋糖酐T2000降解的影響Table 5 Effect of substrate concentration on degradation of dextran T2000

由表5可知，1 mol/L的鹽酸降解右旋糖酐T2000時(shí)，降解速率隨著底物質(zhì)量濃度的增大先增高后降低，底物質(zhì)量濃度為30 mg/mL時(shí)，降解速率最快。反應(yīng)溫度為90 ℃，溫度較高，在一定的底物質(zhì)量濃度范圍之內(nèi)，黏度并不影響底物與酸之間的接觸和反應(yīng)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)于酸來說底物處于不飽和狀態(tài)，反應(yīng)速率較慢，因此降解速率低于底物質(zhì)量濃度為30 mg/mL 的降解速率。底物質(zhì)量濃度達(dá)到30 mg/mL之后，隨著底物繼續(xù)提高，溶液的黏度增大，黏度開始影響底物與酸之間的接觸，底物與酸的接觸和作用不充分，反應(yīng)速率變慢；所以底物質(zhì)量濃度越大，溶液黏度越高，越不利于反應(yīng)的進(jìn)行，不同底物質(zhì)量濃度的右旋糖酐T2000反應(yīng)速率為30 mg/mL＞50 mg/mL＞70 mg/mL。

2.3 酶解右旋糖酐mw和mw/mn的調(diào)控

2.3.1 右旋糖酐酶活力對(duì)右旋糖酐降解的影響

由表6可知，隨著右旋糖酐酶活力的增加，右旋糖酐降解速率增大[27]。根據(jù)表6，當(dāng)酶活力分別為2、4、6、8 U/mL時(shí)，水解8 min得到的右旋糖酐的mw分別為720.6 、242.3,、83.69、24.38 kDa。當(dāng)酶活力為2、4 U/mL時(shí)，水解速率較慢，而酶活力為8 U/mL時(shí)，降解速率較快，mw難以調(diào)控，因此選擇6 U/mL的酶液進(jìn)行酶解反應(yīng)。當(dāng)右旋糖酐mw為100～1 000 kDa時(shí)，右旋糖酐的mw/mn值比較大，因?yàn)榻到獬跗诤懈鞣Nmw的右旋糖酐，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，右旋糖酐的mw逐漸均一，mw/mn變小。如表6所示，當(dāng)酶活力2 U/mL、右旋糖酐mw為720.6 kDa時(shí)，mw/mn為4.524，mw降低為51.16 kDa時(shí)，mw/mn減小為1.966。酶解過程中mw/mn隨mw的變化與酸解過程相似。

表 6 酶活力對(duì)右旋糖酐T2000降解的影響Table 6 Effect of dextranase activity on degradation of dextran T2000

2.3.2 溫度對(duì)右旋糖酐降解的影響

表 7 溫度對(duì)右旋糖酐T2000降解的影響Table 7 Effect of enzymatic hydrolyisis temperature on degradation of dextran T2000

由表7可知，在右旋糖酐酶可以耐受的溫度下，溫度越高，右旋糖酐的降解速率越快，可能是由于較高的反應(yīng)溫度降低了右旋糖酐的黏度，有利于底物與酶分子的有效接觸[28]。右旋糖酐酶具有溫度敏感性，溫度過高，酶易失活。根據(jù)表7，當(dāng)溫度為55 ℃時(shí)，50～60 min mw由6.816 kDa減小為6.32 kDa；而50 ℃時(shí)，50～60 min mw由7.156 kDa減小為6.262 kDa，由此可見高溫雖有利于反應(yīng)但卻易使酶失活。綜合考慮，50 ℃作為酶解較適反應(yīng)溫度。

2.3.3 pH值對(duì)右旋糖酐降解的影響

由表8可知，右旋糖酐的降解速率隨著pH值的升高先增大后減小，pH 5是反應(yīng)較適pH值。pH 4～6比較有利于降解反應(yīng)的進(jìn)行，pH 7不利于反應(yīng)進(jìn)行，將右旋糖酐T2000降解到20 kDa，pH 7時(shí)需要50 min以上，而pH 4～6時(shí)僅需要20 min左右。

表 8 pH值對(duì)右旋糖酐T2000降解的影響Table 8 Effect of pH on degradation of dextran T2000

2.3.4 底物質(zhì)量濃度對(duì)右旋糖酐降解的影響

表 9 底物質(zhì)量濃度對(duì)右旋糖酐T2000降解的影響Table 9 Effect of substrate concentration on degradation of dextran T2000

右旋糖酐的降解速率隨著右旋糖酐質(zhì)量濃度的增加而降低。底物質(zhì)量濃度越小，溶液黏度越小，越有利于反應(yīng)液之間的充分接觸，反應(yīng)越快。如表9所示，當(dāng)右旋糖酐質(zhì)量濃度分別為10、30、50、70 mg/mL 時(shí)，水解16 min后得到的右旋糖酐mw分別為7.196、24.13 、63.9、121.6 kDa。由表6～9可知，右旋糖酐酶降解右旋糖酐是有效的，通過控制右旋糖酐酶活力、溫度、pH值、底物質(zhì)量濃度以及反應(yīng)時(shí)間，可以獲得特定mw的右旋糖酐[29-30]。

2.3.5 底物mw對(duì)右旋糖酐降解的影響

表 10 不同mw右旋糖酐的降解情況Table 10 Degradation efficiencies of dextran with different molecular masses

由表10可知，右旋糖酐酶對(duì)不同mw右旋糖酐的降解速率不同，底物mw越大，反應(yīng)速率越快，說明右旋糖酐酶對(duì)mw大的右旋糖酐親和力更強(qiáng)，這與鹽酸相同。右旋糖酐酶對(duì)右旋糖酐的降解，最初4 min的mw下降速率比其后相同間隔更快，這也表明圓弧青霉右旋糖酐酶對(duì)更高mw的右旋糖酐具有更好的親和力[29]。

2.4 酸解與酶解產(chǎn)物的比較

2.4.1 最終水解產(chǎn)物分析

圖 2 標(biāo)準(zhǔn)品、酸解最終產(chǎn)物和酶解最終產(chǎn)物峰圖Fig. 2 Chromatographic peaks of standards and final products of acid hydrolysis and enzymatic hydrolysis

由圖2可知，葡萄糖、異麥芽糖和異麥芽三糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間分別為6.6、10.4 min和17.4 min。酸解最終產(chǎn)物只有葡萄糖；酶解最終產(chǎn)物為異麥芽糖、異麥芽三糖和少量葡萄糖，這與其他真菌來源的大多數(shù)內(nèi)切型的右旋糖酐酶水解的最終產(chǎn)物相同[3,31]。由此可知，鹽酸催化右旋糖酐中α-1,6糖苷鍵的任意位點(diǎn)，最終產(chǎn)物可降至單糖。圓弧青霉右旋糖酐酶為內(nèi)切型的右旋糖酐酶，可從非還原端的任意位點(diǎn)催化右旋糖酐的α-1,6糖苷鍵，所以最終產(chǎn)物主要為異麥芽糖和異麥芽三糖，不可能完全降至單糖。從最終產(chǎn)物也可以看出，酶解反應(yīng)是有選擇性的水解右旋糖酐[31]，而酸解反應(yīng)是完全隨機(jī)的。

2.4.2 紅外光譜分析

圖 3 酸解和酶解產(chǎn)物與右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖Fig. 3 Infrared spectra of acid hydrolysis and enzymatic hydrolysis products and dextran standard

對(duì)圖3標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，在3 420 cm-1處有較寬且強(qiáng)烈的峰是O—H伸縮振動(dòng)引起的；在2 930 cm-1和1 420 cm-1的弱峰是C—H伸縮振動(dòng)引起的；在1 650 cm-1處的峰可能與水分子有關(guān)；1 200～1 000 cm-1范圍的吸收峰是多糖的特征峰，可以根據(jù)該范圍具有的專一性的譜峰位置和強(qiáng)度判斷為某一特定多糖；在1 160 cm-1處的吸收峰是糖環(huán)的C—O—C的伸縮振動(dòng)；在912 cm-1處的吸收峰是因?yàn)檫拎h(huán)的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)，在849 cm-1的吸收峰是α-異頭碳伸縮振動(dòng)的結(jié)果[32]；在1 010 cm-1處的強(qiáng)烈吸收峰說明含有大量的α-1,6糖苷鍵。綜上所述，該多糖的構(gòu)型是含有α-吡喃糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵，此糖為右旋糖酐。如圖3所示，酸解產(chǎn)物和酶解產(chǎn)物紅外光譜譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品譜圖基本一致，說明降解過程中只是分子質(zhì)量變化，結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化。

2.4.3 氯化物殘留物分析

表 11 右旋糖酐中的各種元素含量的測(cè)定Table 11 Percentage contents of various elements in dextran

由表11可知，與標(biāo)準(zhǔn)品相比，酸解產(chǎn)物含有高達(dá)5.89%氯元素和3.90%鈉元素，《中國(guó)藥典》[33]對(duì)氯化物含量要求不超過0.25%，酸解產(chǎn)物氯離子含量遠(yuǎn)高于藥典要求，氯離子的殘留在臨床應(yīng)用中極易起過敏反應(yīng)，如果要進(jìn)行應(yīng)用需要再進(jìn)行復(fù)雜的復(fù)溶透析等處理；酶解產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)品相比只含有0.55%的鈉元素和0.82%硫元素，不含氯離子，無需再進(jìn)行進(jìn)一步除氯離子的處理。

3 結(jié) 論

酶解法和酸解法都可調(diào)控右旋糖酐的分子質(zhì)量，mw/mn都在合理的范圍，產(chǎn)物均一性均較好。酸解反應(yīng)最適溫度為90 ℃左右，酶解反應(yīng)最適溫度為50 ℃左右，酸解反應(yīng)比酶解反應(yīng)消耗更多的能量；酸解反應(yīng)最適鹽酸濃度為1 mol/L左右，酶解反應(yīng)最適pH值為5左右，酸解法與酶解法相比需要消耗大量的酸與堿；酸解反應(yīng)最適底物質(zhì)量濃度為30 mg/mL左右，而酶解反應(yīng)底物質(zhì)量濃度越低，降解速率越快，在降解過程中可根據(jù)具體情況選擇合適的底物質(zhì)量濃度；酸解反應(yīng)和酶解反應(yīng)都是對(duì)高mw的右旋糖酐親和力更強(qiáng)；酶解反應(yīng)右旋糖酐酶液酶活力越高，降解速率越快。酸解法最終產(chǎn)物為葡萄糖，酸解反應(yīng)是完全隨機(jī)的；酶解法最終產(chǎn)物為異麥芽糖、異麥芽三糖和少量葡萄糖，酶解反應(yīng)遵從一定的內(nèi)在規(guī)律。相比于酸解法，酶解法反應(yīng)條件溫和，無需耗費(fèi)酸堿，能耗低，污染小，無氯離子殘留，是一種低能耗、高品質(zhì)的中低mw右旋糖酐的生產(chǎn)方法。