賈琰 張保榮

Regesi再生硅、Bio-Oss骨粉對(duì)成骨細(xì)胞增殖、

成骨分化作用的影響

賈? ?琰1? ? ? 張保榮2

1.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，山東濰坊? ?261053;2.航空總醫(yī)院口腔診療中心，北京? ?100012

[摘要] 目的 觀察小鼠成骨細(xì)胞（MC3T3-E1）分別在Regesi再生硅和Bio-Oss骨粉材料上的生長(zhǎng)情況，分析Regesi再生硅材料、Bio-Oss骨粉對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖、成骨分化的影響。 方法 將實(shí)驗(yàn)分為3組，分別為Regesi再生硅實(shí)驗(yàn)組、Bio-Oss骨粉實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，將兩種材料分別放置于24孔板中，對(duì)照組為空白，將細(xì)胞分別接種在各組24孔板上，培養(yǎng)1、4、7 d時(shí)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況;培養(yǎng)1、4、7 d時(shí)MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性;培養(yǎng)7 d時(shí)堿性磷酸酶（ALP）試劑盒測(cè)定成骨細(xì)胞的OD值來(lái)分析ALP活性;培養(yǎng)7 d時(shí)Rt-PCR方法測(cè)定3組細(xì)胞的Runx2和Osterix（OSX）基因表達(dá)情況。 結(jié)果 顯微鏡下觀察，各組細(xì)胞隨著時(shí)間增加而數(shù)量增加;培養(yǎng)7 d時(shí)與對(duì)照組比較，Regesi再生硅組細(xì)胞增殖水平升高（P < 0.05），ALP活性、Runx2、OSX mRNA表達(dá)水平升高（P < 0.05），培養(yǎng)7 d時(shí)Bio-Oss骨粉組細(xì)胞增殖水平降低（P < 0.05），ALP活性、Runx2、OSX mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論 Regesi再生硅能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、分化水平;Bio-Oss骨粉能減緩細(xì)胞增殖，但成骨分化能力與單純成骨細(xì)胞無(wú)明顯差異。

[關(guān)鍵詞] 增殖;成骨分化;Regesi再生硅;Bio-Oss骨粉;MC3T3-E1細(xì)胞

[中圖分類(lèi)號(hào)] R318? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）01（c）-0013-04

Effect of Regesi regeneration silicon and Bio-Oss bone meal on proliferation and osteogenic differentiation of osteoblasts

JIA Yan1? ?ZHANG Baorong2

1.Oral Medicine School， Weifang Medical College， Shandong Province， Weifang? ?261053， China;2.Oral Clinic， Aviation General Hospital， Beijing? ?100012， China

[Abstract] Objective To observe the growth of mouse osteoblast （MC3T3-E1） on Regesi regeneration silicon and Bio-Oss bone powder， and to analyze the effects of Regesi regeneration silicon materials and Bio-Oss bone powder on mouse osteoblast proliferation and osteogenic differentiation. Methods The experiment was divided into three groups， respectively Regesi regeneration silicon group， Bio-Oss bone powder group and control group. The two materials were placed in 24-well plates， while the control group was blank. Cells were inoculated on 24-well plates in each group， and the cell growth was observed by inverted microscope at 1， 4 days， and 7 days of culture; MTT was used to detect cell proliferation activity at 1， 4 days， and 7 days of culture; OD value of osteoblasts was determined by alkaline phosphatase （ALP） kit at 7 d culture to analyze ALP activity. Rt-PCR method was used to determine Runx2 and Osterix（OSX） gene expression in 3 groups of cells at 7 days of culture. Results Under the microscope， the number of cells in each group increased with time. The proliferation level of cells in Regesi group increased （P < 0.05）， and the ALP activity elevated，the expression levels of Runx2 and OSX mRNA increased at 7 days of culture（P < 0.05）. The proliferation level of cells in the bio-Oss bone meal group was decreased at 7 days of culture（P < 0.05）， and there was no significant difference in the ALP activity， and the expression levels of Runx2 and OSX mRNA （P > 0.05）. Conclusion Regesi regenerated silicon can promote the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells. Bio-Oss bone powder can decrease cell proliferation， while there is no significant difference between osteogenic differentiation ability and osteoblasts alone.

[Key words] Proliferation; Osteogenesis differentiation; Regesi regeneration silicon; Bio-Oss bone meal; MC3T3-E1 cells

口腔頜面部骨組織結(jié)構(gòu)是支撐面型的重要基礎(chǔ)，因各種原因造成的骨組織缺損[1]，極大地影響了患者的健康和生活。如何更好地修復(fù)骨缺損，是臨床醫(yī)生亟待解決的問(wèn)題和難題。硅已被證實(shí)能夠增加各種材料的生物活性，且不影響他們的機(jī)械性能或誘導(dǎo)細(xì)胞毒性[2]，本研究通過(guò)試驗(yàn)一種新材料-Regesi再生硅對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖、成骨分化作用的影響，分析Regesi再生硅的生物學(xué)性能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

MC3T3-E1細(xì)胞株;Regesi再生硅（幸福益生公司，中國(guó)，批號(hào)：2019041605）;Bio-Oss骨粉[蓋思特利商貿(mào)（北京）有限公司，批號(hào)：81700762];四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）;堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（南京建成，中國(guó)，批號(hào)：201907 13）;倒置顯微鏡（奧林巴斯IX51，日本）;酶標(biāo)儀（德國(guó)）;RNA提取試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司，批號(hào)：AJ31039A];One Step TB Green？誖PrimeScriptTM Rt-PCR Kit（Perfect Real Time）[寶生物工程（大連）有限公司，批號(hào)：AJ11126A];PCR引物（北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司）;熒光定量PCR儀（ABI7500，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)? 將MC3T3-E1細(xì)胞株培養(yǎng)于α-MEM培養(yǎng)基（含1%雙抗混合液、10%FBS）中，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)5%CO2、37℃常規(guī)培養(yǎng)，3～4 d傳代1次，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組? 將實(shí)驗(yàn)分為3組：Regesi再生硅實(shí)驗(yàn)組、Bio-Oss骨粉實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組。將各組材料滅菌后固定于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔約0.2 g，將成骨細(xì)胞接種到預(yù)濕后的材料上，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察各組材料的細(xì)胞生長(zhǎng)情況? 在細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)至第1、4、7天，在倒置顯微鏡下分別觀察3組細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.2.4 MTT試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況? 在細(xì)胞與材料接種培養(yǎng)至第1、4、7天時(shí)進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，取3組細(xì)胞各8孔，每孔加入配制5 mg/mL MTT溶液100 μL，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱4 h后取出培養(yǎng)板，吸棄孔中培養(yǎng)液，再每孔加入DMSO 750 μL后移入96孔板中。置于37℃搖床震蕩15 min以充分溶解結(jié)晶物。然后從每孔吸取200 μL放入酶標(biāo)儀中在490 nm單波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值（OD值）。

1.2.5 堿性磷酸酶測(cè)定盒測(cè)定ALP活性? 當(dāng)細(xì)胞在材料上培養(yǎng)至第7天，取3組細(xì)胞各8孔，吸棄培養(yǎng)孔中培養(yǎng)液，PBS緩沖液沖洗3遍后每孔加入1%TritonX-100細(xì)胞裂解液100 μL冰上裂解30～40 min。再按照ALP活性測(cè)定試劑盒操作說(shuō)明書(shū)測(cè)定在520 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.2.6 Rt-PCR測(cè)定3組中Runx2和OSX基因表達(dá)情況? 當(dāng)細(xì)胞在材料上培養(yǎng)至第4天時(shí)，加入礦化誘導(dǎo)液（含50 μg/mL維生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基），再培養(yǎng)7 d后，采用RT-PCR技術(shù)測(cè)定Runx2（Runt related transcription factor 2）和Osterix（OSX）基因表達(dá)量。反轉(zhuǎn)錄引物名稱(chēng)及序列如下。OSX上游引物序列：5′-GCTCGTCTGACTGCCTGCCTAGTGT-3′，下游引物序列5′-ACC-TGGTGAGATGCCTGCGTGGAT-3′;Runx2上游引物序列：5′-CCTTCCAGACCAGCAGCACTCCAT-3′，下游引物序列5′-TCCGTCAGCGTCAACACCATCATTCT-3′;β-actin上游引物序列5′-GAAGATCAAGATCAT-TGCTTCC-3′，下游引物序列5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′。Rt-PCR反應(yīng)：取3組細(xì)胞各4孔，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，-80℃保存待用。按照One Step TB Green？誖PrimeScriptTMRt-PCR Kit（perfect real time）說(shuō)明書(shū)加入反應(yīng)液，反轉(zhuǎn)錄總RNA合成cDNA及進(jìn)行PCR擴(kuò)增。程序設(shè)置按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。反應(yīng)條件：42℃ 5 min;95℃ 10 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán);95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后，用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多個(gè)樣本均數(shù)采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光倒置顯微鏡觀察各組材料的細(xì)胞生長(zhǎng)情況

隨著時(shí)間的增加，各組細(xì)胞數(shù)量增加。見(jiàn)圖1。

2.2 MTT法檢測(cè)Regesi再生硅、Bio-OSS骨粉分別對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

各組MC3T3-E1細(xì)胞的增殖活性隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而升高，在培養(yǎng)7 d時(shí)，與對(duì)照組比較，Bio-oss骨粉實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖水平降低（P < 0.05）;Regesi再生硅實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖水平升高（P < 0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 ALP活性

在培養(yǎng)7 d時(shí)，與對(duì)照組比較，Regesi再生硅組ALP活性升高（P < 0.05），Bio-oss骨粉實(shí)驗(yàn)組ALP活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 Rt-PCR檢測(cè)Runx2、OSX基因的表達(dá)

對(duì)照組比較，Regesi再生硅組成骨相關(guān)基因Runx2、OSX mRNA的表達(dá)升高（P < 0.05）;Bio-oss骨粉實(shí)驗(yàn)組成骨相關(guān)基因Runx2、OSX mRNA的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)圖4～5。

3 討論

尋找更好的骨組織再生修復(fù)材料，為患者再造健康，是生物醫(yī)用材料研究的前沿和熱點(diǎn)[3-5]。Regesi再生硅材料是由溶膠-凝膠法[6-8]制備而成的一種新型生物活性玻璃，目前還沒(méi)有在臨床得到應(yīng)用。

成骨細(xì)胞經(jīng)歷了增殖、細(xì)胞外基質(zhì)分化與成熟、細(xì)胞外基質(zhì)礦化等階段成骨[9-10]。本研究選用的MC3T3-E1細(xì)胞系具有極好的成骨分化潛能，是體外研究骨細(xì)胞增殖、分化與礦化的細(xì)胞模型。在細(xì)胞的生命活動(dòng)中，細(xì)胞增殖與細(xì)胞分化是兩個(gè)重要的方面[11]。本研究中，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示Regesi再生硅能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖活性，Bio-oss骨粉減弱成骨細(xì)胞的增殖活性。

在分化階段，ALP是成骨細(xì)胞分化時(shí)分泌的酶，是成骨分化早期的標(biāo)志性蛋白[12]能較客觀的反映成骨細(xì)胞的分化情況[13];Runx2和Osterix是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在骨發(fā)育的不同階段發(fā)揮重要作用。Runx2是骨形成過(guò)程中最早和最具特征性的標(biāo)志[14]，在成骨細(xì)胞成熟早期階段發(fā)揮作用[15]。OSX是另一個(gè)重要的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，影響成骨細(xì)胞的最終成熟，受Runx2的調(diào)控[16-17]，OSX只在發(fā)育中的骨組織中特異性表達(dá)，是成骨細(xì)胞分化和骨形成過(guò)程中所必需的轉(zhuǎn)錄因子[18]。Runx2和OSX在成骨細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并且參與許多骨組織相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展[19-20]。本研究中，ALP活性檢測(cè)及熒光定量PCR的結(jié)果顯示：Regesi再生硅組細(xì)胞比對(duì)照組細(xì)胞ALP活性增加，可以上調(diào)成骨相關(guān)基因Runx2、OSX mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組比較差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;Bio-oss組細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞分化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較Bio-oss骨粉會(huì)減弱成骨細(xì)胞的增殖，成骨分化能力與單純成骨細(xì)胞培養(yǎng)差異不明顯（P > 0.05），是目前臨床應(yīng)用中的較理想的支架材料;Regesi再生硅能促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞的增殖、成骨分化，但尚未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞水平無(wú)法準(zhǔn)確顯示Regesi再生硅對(duì)人體骨缺損的修復(fù)作用，還需要通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? He B，Yuan X，Wu J，et al. Self-Assembling peptide nanofiber scaffolds for bone tissue engineering [J]. S Advanced Mater，2015，7（7）：1221-1232.

[2]? 章篩林，成翔宇，紀(jì)斌.硅在生物材料領(lǐng)域的應(yīng)用：增加材料生物活性不影響其機(jī)械性能[J].中國(guó)組織工程研究，2017，21（2）：296-302.

[3]? 強(qiáng)巴單增，劉曉蘭.多孔納米羥基磷灰石/聚酰胺復(fù)合骨修復(fù)材料的制備[J].中國(guó)組織工程研究，2016，20（3）：392-396.

[4]? 廖建國(guó)，李艷群，段星澤，等.納米羥基磷灰石/聚合物復(fù)合骨修復(fù)材料[J].化學(xué)進(jìn)展，2015，27（2）：220-228.

[5]? 陳冬，白軼，李蓉，等.新型骨修復(fù)材料修復(fù)種植牙骨缺損的前瞻性臨床研究[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2015，31（11）：1129-1132.

[6]? Kaur G，Pickrell G，Sriranganathan N，et al. Review and the state of the art：Sol-gel and melt quenched bioactive glasses for tissue engineering [J]. J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2016，104（6）：1248-1275.

[7]? Chen XF，Lei B，Wang YJ，et al. Morphological control and in vitro bioactivity of nanoscale bioactive glasses [J]. J Non-Crystalline Solids，2009，355（13）791-796..

[8]? Chen XF，Guo CL，Zhao N. Preparation and characterization of the sol-gel nano-bioactive glasses modified by the coupling agent gamma-aminopropyltriethoxysilane [J]. Applied Surface Science，2008，255（2）：491-499.

[9]? Zheng MH，Wood DJ，Papadimitriou JM. What′s new in the role of cytokines on osteoblast proliferation and differentiation？ [J]. Pathol Res Pract，1992，188（8）：1104-1121.

[10]? Chung SL，Leung KS，Cheung WH. Low-magnitude high-frequency vibration enhances gene expression related to callus formation，mineralization and remodeling during osteoporotic fracture healing in rats [J]. J Orthop Res，2014，32（12）：1572-1579.

[11]? 戴永國(guó)，蔡立飛，楊洋，等.磷酸肌酸對(duì)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖、分化及礦化的影響[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，40（4）：296-300，306.

[12]? 唐林，林珠，李永明，等.不同大小機(jī)械牽張力對(duì)成骨細(xì)胞增殖及堿性磷酸酶的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2006， 31（6）：580-581.

[13]? 邵華英，張一弓，楊雪，等.抑菌濃度米諾環(huán)素對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2018， 36（2）：140-145.

[14]? Kumar Y，Kapoor I，Khan K，et al. E3 Ubiquitin Ligase Fbw7 Negatively Regulates Osteoblast Differentiation by Targeting Runx2 for Degradation [J]. J Biolo Chem，2015， 290（52）：471-474.

[15]? Bruderer M，Richards RG，Alini M，et al. Role and regulation of RUNX2 in osteogenesis [J]. Eur Cells Mater，2014，28（28）：269-286.

[16]? Nakashima K，Zhou X，Kunkel G，et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for ostcoblast differentiation and bone formation [J]. Cell，2002，108（1）：17-29.

[17]? Sinha KM，Zhou X. Genetic and molecular control of osterix in skeletal formation [J]. J Cell Biochem，2013（5）：975-984.

[18]? 楊丹，于燕妮.成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix研究進(jìn)展[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2013，29（1）：142-145.

[19]? Ste in GS，Lian JB，van Wijnen AJ，et al. Runx2 control of organization，assembly and activity of the regulatory machinery for skeletal gene expression [J]. Oncogene，2004，23（24）：4315-4329.

[20]? Zhang C. Transcriptional regulation of bone formation by the osteoblast-specific transcription factor Osx [J]. J Orthop Surg Res，2010，5（1）：37.

（收稿日期：2019-10.12? 本文編輯：劉永巧）

[基金項(xiàng)目] 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所研究項(xiàng)目（41426040204）。

[作者簡(jiǎn)介] 賈琰（1994.2-），女，濰坊醫(yī)學(xué)院2017級(jí)口腔臨床醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)在讀碩士研究生;研究方向：口腔種植學(xué)。

[通訊作者] 張保榮（1979.7-），男，博士，副主任醫(yī)師;研究方向：口腔種植學(xué)、牙周學(xué)。