陳航華 張宇 劉翠嫻 賀青蓉

佛山市高明區(qū)孕檢人群β-地中海貧血突變篩查及KLF1功能突變分析

陳航華 張宇 劉翠嫻 賀青蓉

1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬高明區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東佛山? ?528500;

2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬高明區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山? ?528500

[摘要] 目的 分析廣東省佛山市高明區(qū)β-地中海貧血（β地貧）的突變譜及攜帶者頻率，并分析其中KLF1基因功能突變攜帶者與個(gè)體胎兒血紅蛋白（HbF）水平升高之間的關(guān)系。 方法 收集2017年1月～2018年10月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬高明區(qū)人民醫(yī)院對(duì)孕婦外周血進(jìn)行地中海貧血產(chǎn)前篩查，對(duì)于表型陽性樣品進(jìn)行基因診斷及陽性者配偶的表型-基因型分析，并對(duì)所有β地貧攜帶者進(jìn)行KLF1突變篩查。 結(jié)果 共對(duì)5318名孕婦完成了地貧產(chǎn)前篩查，發(fā)現(xiàn)1387例為血液學(xué)表型陽性;后續(xù)分子診斷鑒定出649名地貧基因攜帶者，其中246名為β地貧攜帶者，4例攜帶KLF1突變，且該類突變的攜帶者HbF水平顯著高于非攜帶者（P < 0.01）;498名配偶被召回基因診斷，87例為地貧基因陽性，其中32例β地貧突變攜帶者;7對(duì)夫婦為出生中重型β地貧患兒高風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)7名孕婦的胎兒基因型產(chǎn)前診斷，3例被鑒定為β地貧中重型胎兒。 結(jié)論 本研究對(duì)該地區(qū)孕檢人群進(jìn)行了β地貧突變篩查和流行病學(xué)調(diào)查，在一定的樣本空間下對(duì)高明區(qū)的地貧攜帶率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，并驗(yàn)證了KLF1功能突變與HbF升高顯著相關(guān)的現(xiàn)象。

[關(guān)鍵詞] β-地中海貧血;產(chǎn)前診斷;KLF1功能突變;基因診斷;高明區(qū)

[中圖分類號(hào)] R725.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）01（c）-0017-05

Screening of population with β-thalassemia mutation and analysis of functional mutation of KLF1 in Gaoming District， Foshan City

CHEN Hanghua1? ?ZHANG Yu2? ?LIU Cuixian2? ?HE Qingrong1

1.Department of Obstetrics and Gynecology， Gaoming District People′s Hospital Affiliated to Guangdong Medical University， Guangdong Province， Foshan? ?528500， China; 2.Department of Clinical Laboratory， Gaoming District People′s Hospital of Affilated Guangdong Medical University， Guangdong Province， Foshan? ?528500， China

[Abstract] Objective To analyze the mutation spectrum and carrier frequency of β-thalassemia in Gaoming District， Foshan City， and the relationship between functional mutation carriers of KLF1 gene and increased fetal hemoglobin （HbF） level was also analyzed. Methods From January 2017 to October 2018， peripheral blood of pregnant women in Gaoming District People′s Hospital Affiliated to Guangdong Medical University was collected for prenatal screening of thalassemia. Gene diagnosis and phenotypic- genotype analysis were performed for phenotypic positive samples. All poor carriers were screened for KLF1 mutations. Results A total of 5318 pregnant women were screened and 1387 cases were found to be positive for hematological phenotype. Subsequent molecular diagnosis identified 649 cases of geodesic poor gene carriers， of which 246 cases were geodesic poor carriers， and 4 cases were carrying KLF1 mutations， with significantly higher HbF levels than non-carriers（P < 0.01）. 498 of the spouses were recalled for genetic diagnosis， of which 87 cases were positive for destitute gene， of which 32 cases were carriers of destitute mutation. Seven couples were at high risk for children born in moderate and heavy poverty areas. In the prenatal diagnosis of fetal genotype in 7 pregnant women， 3 cases were identified as medium and heavy fetuses. Conclusion In this study， the low-fertility mutation screening and epidemiological investigation were carried out on the pregnant screening population in this area， and the low-fertility carrying rate in Gaoming District counted under a certain sample space， and the phenomenon that KLF1 functional mutation was significantly correlated with the increase of HbF was verified.

[Key words] β-thalassemia; Prenatal diagnosis; KLF1 functional mutations; Genetic diagnosis; Gaoming District

β-地中海貧血（β地貧）是一種由于珠蛋白合成障礙而導(dǎo)致的遺傳性血液病[1]。該病廣泛分布于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)[2]。目前β地貧的致病分子機(jī)制已被闡明，該病是由于11號(hào)染色體上HBB基因突變而導(dǎo)致的β珠蛋白肽鏈合成不足[3]。我國南方廣東和廣西的β地貧攜帶率分別高達(dá)4.20%和6.66%[4]。目前針對(duì)縣市一級(jí)的地貧篩查尚缺少關(guān)于KLF1突變?nèi)巳汉Y查的相關(guān)報(bào)道。KLF1是一個(gè)參與到β-珠蛋白基因表達(dá)轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵紅系特異性轉(zhuǎn)錄因子[5-6]。發(fā)生在KLF1基因上的功能性突變，可提高胎兒血紅蛋白（fetal hemoglobin，HbF），從而顯著改善β地貧患者的表型[7-8]。因此，本研究擬通過對(duì)佛山市高明區(qū)孕檢人群中的β地貧基因陽性樣本進(jìn)行KLF1基因的突變篩查，同時(shí)探討含有KLF1基因突變的β地貧攜帶者在血液學(xué)表型上的差異。綜上，本研究通過血液學(xué)表型篩查、血紅蛋白電泳、基因檢測(cè)等手段、報(bào)道了廣東省佛山市高明區(qū)β地貧基因發(fā)生率，分布類型以及β地貧攜帶陽性個(gè)體中的KLF1基因攜帶率，為該地區(qū)的產(chǎn)前篩查、產(chǎn)前診斷、及地貧防控措施提供基礎(chǔ)資料。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2017年1月～2018年10月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬高明區(qū)人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）進(jìn)行產(chǎn)前地中海貧血篩查的孕婦共5318例;對(duì)于地貧基因診斷陽性的孕婦，召回配偶，合計(jì)498例。因此本研究的總樣本數(shù)為5816例，年齡18～43歲。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并征得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血液學(xué)表型篩查? 本研究的第一隊(duì)列，5318例孕婦，經(jīng)我院門診開具檢查，由我院檢驗(yàn)科對(duì)血液樣本進(jìn)行表型檢測(cè)。包括血常規(guī)（SysmexXN-1000）和血紅蛋白電泳（helenaV8），其中，判斷血液學(xué)篩查陽性的標(biāo)準(zhǔn)如下：①平均紅細(xì)胞體積（MCV）≤80 fL，平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（MCH）≤27 pg;②HbA2≤2.5%為疑似α地貧;③HbA2>3.5%為疑似β地貧，同時(shí)可伴有HbF值升高（HbF>2.0%）。滿足以上其中1項(xiàng)則判別為血液學(xué)表型篩查陽性。

1.2.2 地貧基因診斷? 為系統(tǒng)排查靜止型α地貧及β復(fù)合α地貧個(gè)體，本研究針對(duì)所有血液學(xué)篩查陽性的樣品，同時(shí)進(jìn)行α和β地貧基因突變的篩查。針對(duì)缺失型α地貧，采用單管多重Gap-PCR方法，檢測(cè)中國人常見的3種α地貧致病突變類型，即--SEA、-3.7和 -4.2。采用寡核苷酸探針反向斑點(diǎn)雜交法（reverse dot blotting，RDB）對(duì)PCR擴(kuò)增后的β珠蛋白基因片段進(jìn)行中國人群常見的17種β地貧突變檢測(cè)（廣州達(dá)安生物技術(shù)有限公司）。針對(duì)β地貧突變陽性個(gè)體的KLF1功能突變篩查，采用PCR及Sanger測(cè)序的方法，在KLF1基因的5′UTR區(qū)和一號(hào)外顯子共同設(shè)計(jì)1對(duì)引物;二號(hào)外顯子設(shè)計(jì)3對(duì)引物;鋅指結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)2對(duì)引物;3′UTR設(shè)計(jì)1對(duì)引物，合計(jì)引物共7對(duì)。使用Chromas（版本2.6.4）軟件完成Sanger測(cè)序結(jié)果判讀。

1.2.3 地貧遺傳咨詢? 出現(xiàn)以下任一基因型組合情況，均要求孕婦及其配偶到上一級(jí)醫(yī)院做地貧產(chǎn)前診斷：①夫婦雙方同時(shí)為β地貧攜帶者（中重型β地貧高風(fēng)險(xiǎn)）;②夫婦其中一方為標(biāo)準(zhǔn)型或中間型α地貧攜帶者，另一方為靜止型，標(biāo)準(zhǔn)型α地貧攜帶者或中間型α地貧患者（HbH病或HbBart′s水腫胎高風(fēng)險(xiǎn)）;③夫婦其中一方為標(biāo)準(zhǔn)型α地貧攜帶者，另一方α復(fù)合β地貧雜合子;或夫妻雙方同時(shí)為α復(fù)合β地貧雜合子（HbH病，HbBart′s水腫胎，或中重型β地貧高風(fēng)險(xiǎn)）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 13.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕婦及陽性案例配偶β地貧突變的頻率及類型分布特征

進(jìn)行篩查的5318名孕婦中，共鑒定出1387例血液學(xué)表型陽性。對(duì)其進(jìn)行α和β地貧基因診斷中發(fā)現(xiàn)，649例為地貧基因攜帶者，其中246例為β地貧攜帶者（其中28例為β復(fù)合α的攜帶者），在遺傳咨詢中，建議所有地貧基因檢測(cè)陽性孕婦的配偶前來醫(yī)院檢查，結(jié)果成功召回498名配偶。對(duì)這498名配偶同步進(jìn)行血液學(xué)表型和地貧基因型的檢測(cè)，共鑒定出87例為地貧突變陽性，其中β地貧攜帶者共32例;最終鑒定出7對(duì)β中重型地貧的高風(fēng)險(xiǎn)夫婦，經(jīng)過對(duì)7名孕婦的產(chǎn)前診斷，發(fā)現(xiàn)其中3例胎兒為重型地貧，并成功完成了出生干預(yù)。

在β地貧突變譜上，以高明區(qū)產(chǎn)齡孕婦為代表的采樣顯示，該區(qū)主要的地貧突變種類仍是CD41-42、CD17、-28、IVS-Ⅱ-654、CD71-72等，其中CD41-42、CD17、-28、IVS-Ⅱ-654這4種突變占了該區(qū)β地貧突變總數(shù)的95%以上。見表1。

2.2 β地貧陽性案例的KLF1篩查及血液學(xué)表型關(guān)聯(lián)分析

針對(duì)KLF1的編碼區(qū)，5′UTR及3′UTR區(qū)域功能性突變掃描發(fā)現(xiàn)，246例β地貧攜帶者（孕婦）中共鑒定出4例KLF1功能突變陽性案例，均為二號(hào)外顯子7個(gè)堿基插入所導(dǎo)致的移碼突變（c.519_525dupCG-GCGCC）。測(cè)序結(jié)果如圖1所示。經(jīng)過血液學(xué)表型和基因型的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，4例KLF1突變陽性的β地貧攜帶者具有顯著升高的HbA2和HbF。4例KLF1陽性樣本的平均HbF含量為9.52%，HbA2含量為7.48%，242例KLF1突變陰性樣本的HbF水平則為0.91%，HbA2為4.80%，結(jié)果顯示，KLF1陽性樣本與非陽性樣本之間HbF水平的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)P值為0.00158，而HbA2水平的P值則為0.00147。提示KLF1突變對(duì)β地貧攜帶者個(gè)體的HbF和HbA2水平均產(chǎn)生影響（圖2）。

2.3 針對(duì)β地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的產(chǎn)前診斷

本研究截至2018年10月共鑒定出7對(duì)β地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦。由于β地貧為常染色體隱性遺傳疾病，在夫妻雙方均為攜帶者的情況下，雙方各自將致病的等位基因傳遞給后代的概率均為1/2，因此，他們的后代有1/4的概率成為致病基因純合子個(gè)體，從而罹患中重型β地貧。因此在遺傳咨詢中，充分告知孕婦其后代罹患嚴(yán)重出生缺陷的概率、原因及預(yù)防措施。建議其到上一級(jí)醫(yī)院進(jìn)行產(chǎn)前診斷和出生干預(yù)。7名孕婦均具有較好的依從性，完成胎兒基因型產(chǎn)前診斷，共鑒定出3例重型β地貧胎兒，均進(jìn)行了有效的出生干預(yù)。7對(duì)夫婦的β基因型及胎兒的基因型。見表2。

3 討論

β地貧是我國南方地區(qū)高發(fā)的遺傳性血液病，對(duì)南方地區(qū)，特別是廣東、廣西、海南等省份造成了巨大的社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)[9-11]。我國β地貧的分子基礎(chǔ)是以β珠蛋白基因上的點(diǎn)突變?yōu)橹鳎凑胀蛔円院螃轮榈鞍谆虻墓δ芡耆笔Ш筒糠秩笔?，可分為?突變和β+突變兩類。基因型β0/β0，β0/β+，或β+/β+，均可導(dǎo)致β地貧的發(fā)生。目前對(duì)β地貧最有效的防控措施，就是通過人群普篩和分子診斷，確定高風(fēng)險(xiǎn)夫婦，實(shí)施準(zhǔn)確有效的產(chǎn)前診斷和出生干預(yù)。因此，了解本地區(qū)β地貧的突變譜，攜帶率，對(duì)地區(qū)醫(yī)院及婦幼系統(tǒng)對(duì)β地貧的防控具有重要的參考意義。過去的研究中，有學(xué)者已針對(duì)廣東省的部分地區(qū)，如東莞、梅州、珠海、中山等，進(jìn)行了β地貧基因的篩查，其攜帶率與全省范圍的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果大致吻合，對(duì)本地區(qū)開展孕檢人群的采樣和分析提供了參考[12-15]。本研究針對(duì)高明區(qū)5318名孕婦及其中498名配偶的地貧篩查和分子診斷中，共鑒定出246例孕婦為β地貧攜帶者，攜帶率為4.63%，略高于過去對(duì)廣東省的整體β地貧攜帶率的報(bào)道（4.20%）。并且，針對(duì)成功被召回的配偶，完成了系統(tǒng)的地貧分子診斷，檢出全部的高風(fēng)險(xiǎn)夫婦，合計(jì)7對(duì)，實(shí)現(xiàn)了在該研究人群內(nèi)的β中重型地貧患兒“零出生”。

β地貧患者臨床表型多樣性的遺傳學(xué)機(jī)制研究，逐漸成為國內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)的關(guān)注對(duì)象。發(fā)生在BCL11A、KLF1、MYB-HBS1L基因間區(qū)的功能性變異，先后被報(bào)道與HbF的升高顯著相關(guān)而緩解β地貧患者的臨床表現(xiàn)嚴(yán)重程度[5，16-17]。其中，KLF1基因區(qū)上的錯(cuò)義突變及鋅指結(jié)構(gòu)上的功能變異，被報(bào)道為對(duì)我國南方人群β地貧患者的表型緩解效應(yīng)最大的因素[18]。攜帶KLF1單等位基因功能突變的β0/β0患者，均顯現(xiàn)較高的HbF水平，從而表現(xiàn)出中間型地貧癥狀。該現(xiàn)象顯示，KLF1是β地貧精確診斷和基因治療的重要靶點(diǎn)[19-20]。

進(jìn)行高發(fā)遺傳病的人群普篩及有效的高風(fēng)險(xiǎn)夫婦跟蹤，是提高出生人口素質(zhì)，降低出生缺陷發(fā)生率的重要措施。佛山市統(tǒng)計(jì)年鑒顯示，2017年高明區(qū)出生人口數(shù)為7283人，假設(shè)在沒有人群篩查和優(yōu)生優(yōu)育措施的情況下，依據(jù)本研究得到該地區(qū)β地貧攜帶率約為4.63%計(jì)算，則新生兒中β地貧患兒的預(yù)計(jì)出生數(shù)為7283×0.0463×0.0463，約為15名。這些患兒的出生將對(duì)家庭造成沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，因此，針對(duì)新婚夫婦提供免費(fèi)的地貧防控相關(guān)知識(shí)，安全教育，及地貧篩查和臨床檢測(cè)，將極大地減少乃至完全杜絕重型地貧患兒地出生，該項(xiàng)研究有望為地方政府的市一級(jí)、區(qū)一級(jí)防控提供有效的數(shù)據(jù)參考。

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（收稿日期：2019-05-04? 本文編輯：封? ?華）

[基金項(xiàng)目] 廣東省佛山市衛(wèi)生和計(jì)劃生育局醫(yī)學(xué)科研立項(xiàng)課題（20180395）。