張憶 蘇波 楊楨 胡若楠 寧良菊

理想的脫細(xì)胞肌腱材料需盡可能地保留肌腱天然的超微結(jié)構(gòu)與生化組分，以及近似完整肌腱的力學(xué)性能。脫細(xì)胞肌腱材料已被廣泛用于動(dòng)物跟腱、肩袖等組織缺損的修復(fù)與重建，并取得了較好的修復(fù)重建效果[1-7]。然而，由于肌腱組織過(guò)度致密，對(duì)完整肌腱直接進(jìn)行脫細(xì)胞處理效果不佳，因此對(duì)肌腱進(jìn)行冰凍切片處理已成為脫細(xì)胞肌腱支架材料常用的制備方法之一。肌腱結(jié)構(gòu)中的腱內(nèi)膜將膠原纖維束分為第一級(jí)(Primary fiber bundle)、第二級(jí)(Secondary fiber bundle)、第三級(jí)(Tertiary fiber bundle)3個(gè)不同等級(jí)的腱束。已有研究證實(shí)，切片厚度只要能保留完整的二級(jí)腱束結(jié)構(gòu)就能維持肌腱切片材料的基本力學(xué)特性[8-10]。在前期研究中，我們已經(jīng)摸索出一套染色方法來(lái)觀察肌腱膠原纖維束及周圍腱內(nèi)膜的組分分布情況[11]。但此方法在光學(xué)顯微鏡下對(duì)于腱內(nèi)膜較薄弱區(qū)域的二級(jí)纖維束仍難以辨別，所以我們?cè)O(shè)想通過(guò)掃描電鏡觀察來(lái)提高分辨率。然而，常規(guī)掃描電鏡的制樣方法往往會(huì)失去肌腱本身的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，無(wú)法觀察到二級(jí)纖維束及周圍腱內(nèi)膜分布情況[12-14]。結(jié)合前期制樣經(jīng)驗(yàn)，我們摸索出適用于肌腱二級(jí)纖維束及周圍腱內(nèi)膜形態(tài)觀察的掃描電鏡制樣方法，具體報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑、儀器

無(wú)水乙醇(成都科倫藥業(yè)有限公司)；Masson染色試劑盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；OCT冰凍切片包埋劑(Tissue-Tek公司，美國(guó))；冰凍切片機(jī)(Leica公司，德國(guó))；雙光子熒光顯微鏡(Nikon公司，日本)；熒光顯微鏡(ZEISS公司，德國(guó))；體視顯微鏡(ZEISS公司，德國(guó))；掃描電子顯微鏡(ZEISS公司，德國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1雙光子熒光顯微鏡觀察

由市售新鮮豬后蹄分離獲取豬趾淺屈肌腱，以1 cm長(zhǎng)度橫切，將肌腱段橫切面直接放置于雙光子熒光顯微鏡下，用1 000 nm波長(zhǎng)光源激發(fā)，二次諧波顯微成像觀察組織完整性。

1.2.2冰凍切片配合特殊Masson染色觀察

肌腱段經(jīng)OCT包埋，于-20 ℃下行6 μm厚冰凍切片，行特殊Masson染色。熒光顯微鏡下觀察肌腱二級(jí)纖維束與周圍腱內(nèi)膜組分分布情況。

1.2.3掃描電鏡制樣分組及觀察

根據(jù)制樣方法不同，將固定后的肌腱段隨機(jī)分為5組。A組，直接進(jìn)行單純梯度脫水；B組，行冰凍切片，再將肌腱切片梯度脫水；C組，梯度脫水至70%，行冰凍切片，再將肌腱切片繼續(xù)梯度脫水；D組，梯度脫水至80%，行冰凍切片，再將肌腱切片繼續(xù)梯度脫水；E組，梯度脫水至100%，行冰凍切片。各梯度脫水試劑為乙醇配制，梯度脫水終濃度為100%。冰凍切片厚度均為100 μm。經(jīng)臨界點(diǎn)干燥噴金后行體視顯微鏡觀察肌腱切片大體結(jié)構(gòu)，掃描電鏡觀察肌腱二級(jí)纖維束及周圍腱內(nèi)膜形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 雙光子熒光顯微鏡觀察

二次諧波顯微成像觀察示，肌腱段橫切面連續(xù)完整，二級(jí)纖維束在FITC通道呈現(xiàn)陽(yáng)性，周圍腱內(nèi)膜呈現(xiàn)陰性(圖1)。

2.2 冰凍切片配合特殊Masson染色觀察

熒光顯微鏡下觀察示，切片連續(xù)均勻，二級(jí)纖維束呈紅色，周圍腱內(nèi)膜呈藍(lán)色，但在周圍腱內(nèi)膜較薄弱區(qū)域的二級(jí)纖維束邊界難以區(qū)別(圖1)。

a：肌腱橫切；b：雙光子熒光顯微鏡二次諧波顯微成像觀察(200×)；c：Masson染色熒光顯微鏡觀察(200×)；d：肌腱切片噴金后體視顯微鏡觀察(25×)a: Crosscutting of the tendon; b: Two-photon fluorescence and second harmonic imaging microscopic observation (200×); c: Fluorescence microscopic observation after Masson staining (200×); d: Stereo microscopic observation of tendon slices after gold sputter coating (25×)

2.3 經(jīng)不同方法制樣后體視顯微鏡與掃描電鏡觀察

體視顯微鏡觀察示肌腱切片噴金后結(jié)構(gòu)完整連續(xù)，三級(jí)纖維束的周圍腱內(nèi)膜清晰可見(jiàn)(圖1)。掃描電鏡觀察顯示：A組，整體過(guò)度收縮，呈致密板塊狀，無(wú)法觀察到二級(jí)纖維束分布情況，高倍鏡下無(wú)法辨認(rèn)膠原纖維排列；B組，有較大冰晶空隙形成，二級(jí)纖維束結(jié)構(gòu)難以辨認(rèn)，高倍鏡下膠原纖維排列清晰可見(jiàn)；C組，二級(jí)纖維束及其周圍腱內(nèi)膜、膠原纖維排列均清晰可見(jiàn)；D組，整體明顯收縮，二級(jí)纖維束區(qū)別困難，高倍鏡下膠原纖維排列清晰可見(jiàn)；E組，整體過(guò)度收縮，由于過(guò)于致密，冰凍切片時(shí)造成肌腱出現(xiàn)規(guī)律性斷裂紋，無(wú)法觀察到二級(jí)纖維束分布形態(tài)，高倍鏡下也無(wú)法觀察到膠原纖維排列及形態(tài)(圖2、3)。

3 討論

對(duì)完整肌腱進(jìn)行冰凍切片處理在制備脫細(xì)胞肌腱支架材料時(shí)可有效促進(jìn)脫細(xì)胞效果。其中，切片厚度可決定是否保留肌腱切片的生物力學(xué)特性，然而在表征測(cè)量與肌腱力學(xué)結(jié)構(gòu)單元相關(guān)的二級(jí)纖維束形態(tài)數(shù)據(jù)時(shí)常采用常規(guī)的組織學(xué)制片方法配合光學(xué)顯微鏡采圖[10，15]。傳統(tǒng)表征方法由于對(duì)肌腱纖維束與周圍腱內(nèi)膜缺乏差異化的特異性染色，導(dǎo)致觀察效果較差。在前期工作中，我們摸索出了針對(duì)肌腱膠原纖維束與周圍腱內(nèi)膜的差異化特殊染色方法。該方法能觀察到大部分二級(jí)纖維束及周圍腱內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，但是周圍腱內(nèi)膜較薄弱區(qū)域在光學(xué)顯微鏡下還是難以區(qū)別，所以我們?cè)O(shè)想通過(guò)掃描電鏡來(lái)提高表征的分辨精度。在利用掃描電鏡觀察肌腱組織時(shí)，大多數(shù)研究側(cè)重于觀察平行于膠原纖維束的縱切面，但是縱切面無(wú)法觀察到完整的二級(jí)纖維束及周圍腱內(nèi)膜形態(tài)[16-19]。清晰地觀察到肌腱橫切面對(duì)于制備脫細(xì)胞肌腱切片材料的厚度選擇至關(guān)重要。然而，目前僅有少數(shù)研究報(bào)道了肌腱橫切面掃描電鏡結(jié)果，而且所利用的掃描電鏡制樣方法對(duì)組織本身結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重并導(dǎo)致肌腱本身的細(xì)微結(jié)構(gòu)消失[12]。

a：A組；b：B組；c：C組；d：D組；e：E組a: Group A; b: Group B; c: Group C; d: Group D; e: Group E

a：A組；b：B組；c：C組；d：D組；e：E組a: Group A; b: Group B; c: Group C; d: Group D; e: Group E

本研究的5組不同的掃描電鏡制樣方法中，A組是最常用的方法，但該方法會(huì)導(dǎo)致肌腱整體過(guò)度收縮，無(wú)法區(qū)分膠原纖維束及周圍腱內(nèi)膜。由于肌腱屬于致密結(jié)締組織，纖維束中的膠原纖維致密而有序地平行排列，腱外膜及腱內(nèi)膜連續(xù)且有規(guī)律地包裹纖維束[8，20]，因此我們推測(cè)當(dāng)肌腱段作為一個(gè)整體進(jìn)行梯度脫水至100%時(shí)，組織會(huì)呈現(xiàn)過(guò)度收縮。肌腱膠原纖維束與周圍腱內(nèi)膜均主要由Ⅰ型膠原構(gòu)成，但膠原纖維束因?yàn)橐峁┛估δ?，其絕大多數(shù)膠原纖維極其有序地緊密平行排列，而起支持和營(yíng)養(yǎng)作用的周圍腱內(nèi)膜的纖維則呈現(xiàn)明顯的疏松網(wǎng)狀分布[21]，我們猜測(cè)在整體過(guò)度收縮過(guò)程中疏松的周圍腱內(nèi)膜被二級(jí)纖維束擠壓至無(wú)法觀察。B組將固定后的肌腱段先冰凍切片再進(jìn)行梯度脫水，由于肌腱切片樣本失去了肌腱段作為整體的收縮能力，保留了二級(jí)纖維束及周圍腱內(nèi)膜的形態(tài)，且在高倍鏡下觀察也保留了膠原纖維排列形態(tài)。但由于肌腱組織含水量豐富，直接進(jìn)行冰凍切片非常容易形成大量冰晶[22-23]。冰晶的形成會(huì)嚴(yán)重干擾對(duì)二級(jí)纖維束完整形態(tài)的判斷。所以我們?cè)O(shè)置了不同梯度脫水時(shí)間節(jié)點(diǎn)，對(duì)肌腱段脫去不同程度的水分后再進(jìn)行冰凍切片制備。D組與E組都由于脫水過(guò)度，肌腱二級(jí)纖維束與周圍腱內(nèi)膜形態(tài)消失，高倍鏡下僅D組保留了膠原纖維的排列及形態(tài)，E組還由于過(guò)度脫水導(dǎo)致肌腱段硬度變高，在冰凍切片時(shí)極易發(fā)生脆裂。C組脫水程度適當(dāng)，肌腱段失去70%水分后在冰凍切片環(huán)境下無(wú)明顯冰晶形成，也未出現(xiàn)過(guò)度收縮情況，并且硬度適中，能輕松均勻連續(xù)地切出具有完整性的肌腱切片。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)10%甲醛固定豬趾淺屈肌腱，乙醇梯度脫水至70%，行冰凍切片橫切，厚100 μm，再將肌腱切片繼續(xù)梯度脫水至100%，按照常規(guī)掃描電鏡臨界點(diǎn)干燥與噴金后，能清晰地觀察到肌腱二級(jí)纖維束及周圍腱內(nèi)膜形態(tài)，同時(shí)能保留膠原纖維排列狀態(tài)。在制備脫細(xì)胞肌腱切片支架材料時(shí)，此方法對(duì)指導(dǎo)材料生物力學(xué)性能的保護(hù)具有重要的組織形態(tài)學(xué)意義。