黃嘉蕊 鐘業(yè)宏 俞哲元 韋敏

聚醚醚酮(Polyetheretherketone，PEEK)是一種半結(jié)晶化合物，通過雙酚類化合物的逐步二烷基化反應(yīng)生成。PEEK是一種高耐熱的熱塑性材料，其抗拉強度及彈性模量幾乎接近人類骨骼，是優(yōu)良的骨植入物[1]。

顱面骨組織缺損的修補與形態(tài)重建，是顱頜面外科極具挑戰(zhàn)的難題。目前，臨床常使用鈦網(wǎng)對顱面骨缺損進行修補，但長期隨訪發(fā)現(xiàn)，存在鈦板外露、不明原因癲癇發(fā)生等并發(fā)癥；此外，鈦網(wǎng)與組織間產(chǎn)生較高的剪切力，以及影像學(xué)下產(chǎn)生金屬偽影等問題，均限制了鈦金屬移植物的應(yīng)用[2-3]。部分工程聚合物材料已被證明能夠很好地匹配人體骨骼的機械性能，具有降低應(yīng)力屏蔽和骨丟失的潛力，有助于改善患者預(yù)后。PEEK材料是目前較常使用的工程聚合物材料，與鈦合金相比，具有過敏性低、無離子泄露、可影像學(xué)透視、可行三維定制打印等優(yōu)點。雖然該材料的脆性較低，但因顱面部移植物對材料脆性要求不高，故PEEK材料仍有望成為顱面硬組織的替代物。

PEEK植入物的惰性疏水表面會導(dǎo)致纖維包裹并阻礙骨附著，導(dǎo)致在體內(nèi)的骨整合性能及骨誘導(dǎo)能力方面存在重大缺陷。為提高PEEK的組織相容性，可通過表面涂層、化學(xué)物質(zhì)混合、經(jīng)化學(xué)處理等方式豐富PEEK表微結(jié)構(gòu)。經(jīng)處理的PEEK雖然提高了組織相容性[4-6]，但往往會出現(xiàn)其他的潛在問題，如經(jīng)過磺化處理的PEEK留有腐蝕性、表面孔徑大小不一，HA-PEEK放置體內(nèi)一段時間后涂層剝落等[7-8]。

熔融沉積技術(shù)(FDM)是將加工成絲狀的熱熔性材料(PEEK、PLA、蠟等)經(jīng)過送絲結(jié)構(gòu)送進熱熔噴嘴，在噴嘴內(nèi)絲狀材料被加熱熔融，同時噴頭沿零件層片輪廓和填充軌跡運動，并將熔融的材料擠出，使其沉積在指定的位置后凝固成型，經(jīng)層層堆積后形成產(chǎn)品模型的打印技術(shù)。本研究不采用化學(xué)處理方法，僅用FDM技術(shù)3D打印，直接對材料表面進行微孔化處理，避免了化學(xué)處理導(dǎo)致的不良效果，并檢測3D打印不同孔隙率PEEK材料對成骨細(xì)胞成骨活性的影響，從而為PEEK材料3D打印增材制造方法在臨床上的進一步應(yīng)用提供基礎(chǔ)依據(jù)[9]。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

PEEK顆粒(Victrex，英國)，α-MEM培養(yǎng)基(Biological industries，以色列)，胎牛血清、胰蛋白酶、三抗(Gibco，美國)，AKP堿性磷酸酶定量檢測(Beyotime，中國)，0.2%茜素紅染色液(Solarbio，中國)，4%多聚甲醛(賽戈，中國)，10%氯化十六烷基吡啶(Sigma，美國)，10%磷酸緩沖液(HyClone，美國)，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(Cyagen，美國)，Triton-X100(Sigma-Aldrich，美國)。

FDM打印機(牛魔王3，三的部落科技股份有限公司，中國)，場發(fā)射掃描電子顯微鏡(Philips，荷蘭)；高溫消毒柜(ldzm-40kcs，上海茸研儀器有限公司)；倒置顯微鏡(Nikon，日本)。

1.2 多孔隙材料的制備

以三維CAD模型數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過FDM技術(shù)以35 mm/s的速度、420 ℃、直徑0.4 mm噴頭，以逐層疊加的方式打印出直徑13 mm、高度3 mm的圓柱形PEEK材料，孔隙率分別為40%、50%、60%，以實心PEEK材料為對照組(圖1)。

從左往右：40%、50%、60%孔隙率PEEK及實心PEEKFrom left to right: 40%, 50%, 60% porosity PEEK and solid PEEK

1.3 SEM電鏡檢測

以場發(fā)射掃描電子顯微鏡對所獲取的樣品進行掃描，獲取樣品表面微觀形貌，觀察樣品表面的多孔結(jié)構(gòu)。

1.4 PEEK材料表面多孔化處理對細(xì)胞成骨活性的影響

1.4.1PEEK材料預(yù)處理

將4組不同孔隙率(40%、50%、60%及實心)的PEEK材料放置于高溫消毒柜里消毒風(fēng)干，取出后置培養(yǎng)皿中，用10%PBS沖洗濕潤2～3遍。

1.4.2細(xì)胞的接種和生長

各組PEEK材料分別置于24孔板中，將培養(yǎng)于混有1%三抗、16.7%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液里的MC3T3-E1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為4×105cells/cm2，取1 mL接種于材料孔中及無材料的空白孔中，無材料空白孔為空白對照組。接種24 h后首次換液，37 ℃、5% CO2保溫箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，第4天更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。

1.4.3細(xì)胞黏附和增殖情況

成骨誘導(dǎo)期間，倒置相差顯微鏡連續(xù)觀察細(xì)胞黏附生長情況，觀察細(xì)胞在不同時間段的形態(tài)學(xué)變化。

1.4.4MC3T3-E1細(xì)胞的骨向誘導(dǎo)

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液每3天全量換液。分別在第7、14天進行堿性磷酸酶(AKP)活性檢測；第14、28天進行茜素紅定量檢測。

1.4.4.1AKP活性檢測

成骨誘導(dǎo)第7、14天抽棄培養(yǎng)液，用10% PBS清洗2遍，每孔加入500 μL裂解液(含0.05% Triton-X100的PBS)，置于37 ℃搖床30 min。按照AKP活性檢測盒說明書檢測裂解液中的AKP活性，波長405 nm下測定吸光度值。

1.4.4.2骨鈣素定量檢測

成骨誘導(dǎo)第14、28天時，各組樣本甲醛固定20 min，10% PBS溶液清洗2遍，茜素紅染色15 min， 10% PBS清洗2遍，各孔中加入10%氯化十六烷基吡啶(Cetylpyridinium chloride，Cpc)500 μL溶解鈣結(jié)節(jié)，置于37 ℃、5% CO2保溫箱15 min，所得溶液在波長570 nm下測定吸光度值。

1.4.5SEM電鏡檢測

成骨誘導(dǎo)第7、14、28天行SEM電鏡觀察，記錄細(xì)胞的黏附生長情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞黏附增殖情況

PEEK材料與MC3T3-E1細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，大部分細(xì)胞貼于PEEK材料上生長，亦有少量細(xì)胞零星散落于材料孔隙中。成骨誘導(dǎo)第7天，細(xì)胞體積開始增大，細(xì)胞生長情況良好，在材料孔隙中呈梭形或多角形；成骨誘導(dǎo)第14天，可見孔隙間成骨細(xì)胞更大程度地匯合，有的成簇生長，中心密集，外層逐漸稀疏，有的在孔隙間形成漩渦狀；成骨誘導(dǎo)第28天，可見細(xì)胞數(shù)量明顯增加，匯合堆疊成團，有的長滿材料孔隙。成骨細(xì)胞在不同孔隙率材料上沒有特定的生長形態(tài)(圖2)。

2.2 SEM電鏡檢測

a: 60%孔隙率PEEK/MC3T3-E1成骨誘導(dǎo)第7天(4×)；b：40%孔隙率PEEK/MC3T3-E1成骨誘導(dǎo)第10天(20×)；c：40%孔隙率PEEK/MC3T3-E1成骨誘導(dǎo)第14天(4×)；d：60%孔隙率PEEK/MC3T3-E1成骨誘導(dǎo)第28天(10×)a: 60% porosity PEEK/MC3T3-E1 on the 7th day of osteogenesis (4×); b: 40% porosity PEEK/MC3T3-E1 on the 10th day of osteogenesis (20×);c: 40% porosity PEEK/MC3T3-E1 on the 14th day of osteogenesis (4×);d: 60% porosity PEEK/MC3T3-E1 on the 28th day of osteogenesis (10×)

SEM電鏡檢測可見PEEK材料上噴頭(直徑400 μm)擠壓堆疊出的條索紋路，PEEK材料基本光滑，偶見多余拉絲結(jié)構(gòu)、孔徑堵塞現(xiàn)象，應(yīng)為生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定所致。盡管使用同一個噴頭打印材料，但由于打印過程中漿料黏度、供料壓力及出絲速度等工藝參數(shù)的綜合影響，使不同孔隙率的整體多孔材料橫梁寬度會有誤差。SEM電鏡下測量40%、50%、60%孔隙率及實心PEEK材料的橫梁寬度分別為：(397±33)μm、(370±16)μm、(330±0)μm和(347±5)μm；孔隙寬度分別為：(273±40)μm、(357±21)μm、(573±21)μm。40%孔隙率PEEK材料最容易出現(xiàn)孔徑堵塞現(xiàn)象；50%孔隙率PEEK材料的孔隙寬度與實驗理想值(350 μm)最接近；60%孔隙率PEEK材料的橫梁寬度及孔隙寬度相對比較穩(wěn)定，有較清晰的微孔結(jié)構(gòu)(圖3)。

a：40%孔隙率；b：50%孔隙率；c：60%孔隙率；d：實心材料a: 40% porosity; b: 50% porosity; c: 60% porosity; d: solid PEEK

2.3 AKP活性檢測

分別于成骨誘導(dǎo)第7天、14天，對在不同孔隙率PEEK材料上培養(yǎng)的MC3T3細(xì)胞的AKP活性進行檢測，結(jié)果顯示：①成骨誘導(dǎo)第7天，4種不同孔隙率的PEEK材料對MC3T3細(xì)胞成骨活性有影響(P<0.05)，其中在40%、50%、60%孔隙率PEEK材料上培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞的成骨活性相比空白對照組均明顯升高(P<0.05)，其中40%孔隙率PEEK材料上的成骨活性最高(P<0.05)。②成骨誘導(dǎo)第14天，4種不同孔隙率PEEK材料對MC3T3細(xì)胞成骨活性有影響(P<0.05)，在4種不同孔隙率PEEK材料上培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞的成骨活性均明顯高于空白對照組(P<0.05)，其中60%孔隙率PEEK材料上的成骨活性最高(P<0.05)。③在4種不同孔隙率PEEK材料上培養(yǎng)的MC3T3細(xì)胞的成骨活性均隨培養(yǎng)時間延長而升高(P<0.05)(圖4)。

圖4 AKP活性檢測。

2.4 骨鈣素定量檢測

分別于成骨誘導(dǎo)第14、28天對在不同孔隙率PEEK材料上培養(yǎng)的MC3T3細(xì)胞的骨鈣素定量檢測，結(jié)果顯示：①成骨誘導(dǎo)第14天，在4種不同孔隙率的PEEK材料上培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞的骨鈣素含量不同(P<0.05)，其中在實心PEEK材料上培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞的骨鈣素含量最高(P<0.05)。②成骨誘導(dǎo)第28天時，在40%孔隙率PEEK材料上培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞的骨鈣素含量最高(P<0.05)。③在40%、50%、60%孔隙率PEEK材料上培養(yǎng)的MC3T3細(xì)胞的骨含量均隨培養(yǎng)時間延長而升高(P<0.05)(圖5)。

圖5 骨鈣素定量檢測

3 討論

理想狀態(tài)下，植入物的設(shè)計是為了更好地模擬其替換的生物組織，以提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性并支持骨生長。PEEK材料具有耐高溫性、耐腐蝕性、機械特性、耐水解性等，但其生物惰性和疏水性嚴(yán)重，在人體內(nèi)會被周圍的纖維組織包裹，形成纖維包囊，從而延緩、抑制植入材料與周圍骨組織的融合[10-11]。通過不同方法可豐富PEEK材料的表面微結(jié)構(gòu)，能夠有效地增加材料與周圍骨組織間的融合，但仍存在缺陷和不足[12]。隨著制造工藝的進步，目前已突破了處理材料移植物的限制，提供了更大的選擇范圍。

目前，臨床使用的PEEK植入物都是通過注塑成型(減材)制造的方式，通過將粉末狀PEEK聚合物填入注塑機內(nèi)，加熱使之變成黏流態(tài)，在一定壓力和速度下使熔體注入模型后冷卻而成。這種方法制造出來的PEEK材料，其表面光滑，具有足夠的強度、剛度，但無益于PEEK與骨組織的結(jié)合。本實驗通過熔融沉積(FDM)3D打印技術(shù)直接在制造材料的過程中進行微孔結(jié)構(gòu)的處理(包括控制孔隙率、孔徑大小等)，既節(jié)約了制造成本且不改變材料的化學(xué)生物特性，同時又提高了PEEK材料與骨的整合。

骨生成在不同階段有不同活躍的代謝指標(biāo)，透過檢測不同時期的骨生成指標(biāo)可以檢測成骨細(xì)胞在該時期的成骨活性。骨性堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)由成骨細(xì)胞分泌，在成骨過程中水解成磷酸酯和焦磷酸鹽，有利于成骨過程，因其具有高特異性和靈敏性，在體外實驗中常作為成骨早期的指標(biāo)；骨鈣素(Osteocalcin，OC)是由成熟成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞合成和分泌的，是成骨分化晚期成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志物，OC對骨礦化過程起正向作用[13]。一般而言，ALP值的高峰在成骨細(xì)胞成骨第14天，而OC值隨著成骨時間推移而增高，ALP及OC的表達可以反映骨形成的過程。本實驗中，成骨細(xì)胞成骨早期(第7天)的ALP活性隨著孔隙率的增高而下降，實心材料最低；但到成骨中期(第14天)，AKP活性卻隨著孔隙率的增高而上升，其中40%孔隙率PEEK材料中細(xì)胞的AKP活性最低，其次是實心材料中細(xì)胞的AKP活性。另外，成骨早期、中期空白對照組(純MC3T3-E1細(xì)胞)的AKP活性均為最低，雖然各孔中種植的細(xì)胞密度相同，但由于純MC3T3-E1細(xì)胞中沒有放置材料，導(dǎo)致可供細(xì)胞黏附的表面積減少，使得細(xì)胞數(shù)減少，最終導(dǎo)致AKP分泌量減少[14-15]。各組不同樣本成骨第14天的AKP活性均比第7天高。在成骨中后期MC3T3-E1礦化過程中OC含量隨著孔隙率的增高而下降，以實心材料中細(xì)胞的OC含量最低；而成骨誘導(dǎo)第28天各組樣本的OC值均比第14天的高。4組樣本(40%、50%、60%孔隙率PEEK和實心PEEK)間比較，材料孔隙率越低，MC3T3-E1細(xì)胞礦化時間越早，這可能是由于孔隙率越低所創(chuàng)造的缺氧條件誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表達VEGF，加快成骨細(xì)胞分化過程所致[16-17]，到成骨中后期仍然以40%孔隙率樣本中細(xì)胞的OC含量最高，因此我們認(rèn)為40%孔隙率PEEK材料的成骨細(xì)胞相容性最佳。隨著培養(yǎng)時間延長，各組AKP活性及OC含量均有上升，說明改變PEEK材料表面結(jié)構(gòu)對MC3T3-E1細(xì)胞沒有明顯的毒性反應(yīng)。

本實驗采用FDM增材制造(3D打印)PEEK材料表面的微孔結(jié)構(gòu)，在不改變PEEK的化學(xué)結(jié)構(gòu)及不添加化學(xué)物質(zhì)的前提下進行表面微孔化處理，證實增加表面微孔的PEEK材料比實心PEEK材料有更好的生物相容性[18]。成骨細(xì)胞在4組不同樣本的PEEK表面黏附、鋪展，生長良好，表明微孔處理PEEK材料具有良好的體外成骨細(xì)胞相容性。

4 小結(jié)

本研究證實通過生產(chǎn)工藝改變PEEK微結(jié)構(gòu)，包括孔隙率、孔隙直徑等可達到提高生物相容性的效果。通過增加PEEK材料的表面微孔結(jié)構(gòu)，可達到提高體內(nèi)材料-骨整合能力，有利于增加植入物的彈性、穩(wěn)定性及使用壽命，PEEK有望成為更理想、應(yīng)用更廣泛的新型骨替代材料。