崔恒慶 孫濱 方霞 周晟博 楊皓然 戴心怡 韓剛 王斌

先天性指間關節(jié)黏連(Symphalangism，SYM1；MIM#185 800)是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，遺傳異質(zhì)性極小，外顯率高。該病最早在1960年由Vesell等[1]描述。SYM1最常見的癥狀是手指和腳趾近端指(趾)間關節(jié)(PIP)僵硬，手指指橫紋消失。一般尺側手指較橈側手指發(fā)病率高，拇指較少累及。部分患者還可伴有傳導性耳聾、先天性遠視、短指、掌骨縮短和手足遠端指(趾)骨發(fā)育不良等[2]。

該病目前主要的治療方法為手術松解，但術后黏連復發(fā)率高，多數(shù)患兒最終因手指關節(jié)骨性融合而部分喪失手部功能，嚴重影響患兒日?；顒?，少數(shù)患兒因自卑情緒伴發(fā)心理障礙。該病多為先天性，代系遺傳表型逐漸加重，且3歲以內(nèi)多發(fā)生關節(jié)完全融合而失去手術治療機會。因此，明確致病基因，結合胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)是阻斷致病基因代系遺傳，減少該病發(fā)生的有效方法。本研究針對一個中國先天性指間關節(jié)黏連家系進行了遺傳學研究，具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 家系信息

在這個三代患病家系中，具有先天性關節(jié)黏連表型的有2位。Ⅱ2母親雙手示、中、環(huán)、小指手指近節(jié)無法彎曲，指橫紋消失，手指遠節(jié)短小。先證者Ⅲ2 雙側中、環(huán)、小指手指近節(jié)屈曲受限，手指及足趾短指(趾)畸形(圖1)。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(編號：SH9H-2018-T50-2)，患者及親屬均已簽署知情同意書。

圖1 先天性指間關節(jié)黏連家系圖及其臨床表現(xiàn)

1.2 方法

1.2.1DNA提取

收集兩例患者Ⅱ2、Ⅲ2及兩例正常成員Ⅱ1、Ⅲ1外周靜脈血樣。按照凱杰DNA抽提試劑盒(Qiagen，德國)說明書，分離提取上述樣品基因組DNA，溶于40 μL水后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴增及Sanger測序

針對NOG基因(GenBank編號NM_005450.4)，設計了一對引物(F：5′-ccgcgggctcggcggtgctctctctctctctctctct-3′，R：5′-gatgggaatgccagagcg-3′)。擴增體積為30 μL，含100 ng gDNA、200 nm引物、0.2 mm dNTPs、1.5 mm MgCl2和1 U TaqDNA聚合酶。PCR步驟包括94 ℃保溫5 min，然后94 ℃保溫30 s，56 ℃保溫30 s，72 ℃保溫30 s，共35個循環(huán)。

1.2.3生物信息分析蛋白質(zhì)空間模擬

Clustal Omega工具用于比對來自不同物種的noggin的氨基酸序列[3]。根據(jù)PDB文件1M4U[4]，使用Swiss模型[3]對突變型noggin蛋白的結構進行建模。三維結構的圖像由加州大學舊金山分校嵌合體實驗室1.8版軟件繪制[5]。

1.2.4C2C12體外成骨誘導分化

小鼠成肌纖維細胞系C2C12(ATCC)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%抗生素的低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)。0.25%胰酶(Gibco，美國)消化后，以1×104個/孔鋪于96孔板過夜。換液后每孔加入100 μL含2%胎牛血清、200 ng/mL BMP-2的成骨誘導分化培養(yǎng)基。隨機分為3組：對照組不加noggin抑制成骨分化，實驗組分別加入野生型及R167G突變型noggin(50 ng/mL)重組蛋白，成骨誘導分化72 h，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，水洗3次，按堿性磷酸酶染色試劑盒說明書進行染色。

1.2.5定量PCR

成骨誘導分化72 h后，用Trizol(Thermo，美國)裂解細胞，按說明書分別提取對照組、野生型noggin抑制組、R167G突變型noggin抑制組總RNA。使用Taqman Kit(Applied Biosystems，美國)逆轉錄為cDNA。以SYBR green擴增ALP、RUNX2、COL1α1，并以GAPDH作為內(nèi)源對照，在Taqman 7 500(Applied Biosystems，美國)上檢測基因表達水平。

2 結果

2.1 Sanger測序結果

一代測序結果顯示，患者家系中存在先天性指間關節(jié)黏連的患者Ⅲ2、Ⅱ2，在NOG基因上均存在外顯子第455位堿基由胞嘧啶(C)突變?yōu)轼B嘌呤(G)，導致其編碼的第167位氨基酸由精氨酸(R)突變?yōu)楦拾彼?G)。在其他兩位無疾病表型的患者Ⅱ1、Ⅲ1中，未發(fā)現(xiàn)該位點的突變，在該遺傳家系中表現(xiàn)出與疾病共分離。突變致病性預測軟件一致預測此突變?yōu)橹虏⊥蛔?圖2)。

圖2 NOG基因Sanger測序結果

2.2 氨基酸序列比對及蛋白質(zhì)空間結構模擬

為了比較該位點在生物進化過程中的保守性，我們在不同種屬間對該位點的一致性進行對比后發(fā)現(xiàn)，該位點在智人至斑馬魚中都高度保守，顯示了R167位點在保持noggin蛋白正常功能中的重要作用，進一步提示該位點的氨基酸突變可導致疾病的發(fā)生。蛋白質(zhì)空間結構模擬顯示，R167位點位于noggin與gdf5結合處，提示該位點的突變可能引起noggin與gdf5結合能力下降，對gdf5抑制作用下降，關節(jié)處成骨能力增強，進而出現(xiàn)關節(jié)黏連的表型(圖3)。

A：種屬間氨基酸序列保守性；B：NOG-GDF5蛋白復合體三維空間結構模擬A: Conservation of intergeneric amino acid sequences; B: Three-dimensional spatial structure of noggin-gdf5 protein complex

2.3 C2C12體外成骨誘導分化

C2C12成骨誘導分化3 d后堿性磷酸酶染色結果顯示，p.R167G突變后的noggin蛋白對C2C12成骨的抑制作用明顯低于野生型noggin蛋白。逆轉錄定量PCR顯示，成骨標志性基因ALP、RUNX2、COL1α1的表達量低于加noggin抑制劑的對照組，但顯著高于野生型noggin組。這些結果都提示，R167G突變型noggin的成骨抑制作用減弱，進一步證明了該位點突變的致病性(圖4)。

A：堿性磷酸酶染色結果；B：成骨標志性基因定量PCR檢測結果A: Results of alkaline phosphatase staining; B: Quantitative PCR detection of osteogenic marker genes

3 討論

Noggin是最早被發(fā)現(xiàn)的BMP功能拮抗劑之一，通過結合和掩蔽位于BMP上的Ⅰ型和Ⅱ型受體位點，與BMP-7相互作用[6]，對軟骨形態(tài)形成、關節(jié)形成[7]以及神經(jīng)管形成都是必需的[8]。1999年，Gong等[7]通過Sanger測序的方法，首次報道了NOG基因點突變影響人類關節(jié)形成。隨后，Marcelinod等[9]通過體外表達noggin蛋白，證明了NOG基因突變可能會影響noggin蛋白的分泌、二聚體形成以及與BMP蛋白的結合能力。2005年，Seemann等[10]首次在體外證明了GDF5突變可改變GDF5與受體BMPR1B的結合，引起A2型短指，改變與noggin的結合，可引起關節(jié)黏連。

NOG基因突變通常造成近端指間關節(jié)屈曲受限和骨性融合。在該家系中，存在PIP關節(jié)融合和短指畸形，但沒有傳導性耳聾及先天性遠視等表現(xiàn)，表明了R167G的特異作用機制。

Marcelinod等[9]使用Cos7細胞表達noggin蛋白，證明了NOG基因突變可能會影響noggin蛋白的分泌、與BMP蛋白的結合能力以及二聚體形成。但未通過體外細胞實驗探究突變noggin對于成骨分化的影響。研究顯示，GDF5突變引起gdf5與noggin結合能力改變，進而產(chǎn)生關節(jié)黏連的表型[10-12]。

在該家系中，存在PIP關節(jié)融合和短指畸形，家系中患者的特征與SYM1一致。我們發(fā)現(xiàn)，該家系中具有關節(jié)黏連表現(xiàn)的患者都有p.R167G的點突變，蛋白質(zhì)空間結構模擬提示該位點位于noggin與gdf5的結合處，體外成骨誘導實驗顯示p.R167G突變蛋白體對C2C12的成骨抑制作用明顯降低。

已有的報道指出，p.R167G突變可導致B2型短指(BDB2)[13]，而尚未報道有先天性指間關節(jié)黏連(SYM1)的表現(xiàn)。Lehmann等[13]通過計算機建模noggin-gdf5復合物，并通過計算自由結合能，提出noggin與BMP和GDF的結合能力可能輕微降低。我們基于PDB文件1M4U[4]，使用相同的方法評估BMP7與野生型、R167G noggin之間的相互作用，與Lehmann等的報告一致。根據(jù)Fold-X(Beta3 3.0版本)的計算，我們發(fā)現(xiàn)突變形式的noggin相較于野生型noggin的結合能力輕度下降。該患者同時存在短指畸形的表現(xiàn)，但NOG基因突變引起短指的機制還未被闡明，有待于進一步的研究。

4 結論

綜上所述，我們在該先天性指間關節(jié)黏連家系中發(fā)現(xiàn)了一個NOG基因雜合性突變c.499C>G p.R167G。該突變與家族中的疾病共分離，在200名正常對照組中缺失。受影響的密碼子從智人到斑馬魚都是完全保守的。同一密碼子(R167G)的另一個突變將導致BDB2，其特征是手指遠端和中部指節(jié)發(fā)育不全或發(fā)育不良。這些結果表明，新的c.499C>T突變是致病的，并且是該家族中SYM1的致病原因。這將為受累家庭提供胚胎植入前診斷(PGD)提供依據(jù)。