徐祥文 鄺依敏 黃昕 高雅姍 李海洲 顧舒晨 昝濤

增生性瘢痕的形成機(jī)制尚不清楚，僅通過(guò)研究臨床增生性瘢痕標(biāo)本無(wú)法探究其發(fā)生發(fā)展中的病理改變。因此，建立可靠的動(dòng)物模型是探究增生性瘢痕形成機(jī)制的必要步驟。目前應(yīng)用較多的增生性瘢痕動(dòng)物模型主要以兔耳增生性瘢痕模型[1]、免疫缺陷移植小鼠[2]、豬增生性瘢痕模型[3]、小鼠皮膚傷口牽張[4]與藥物誘導(dǎo)模型[5]等為主，但由于創(chuàng)面結(jié)構(gòu)及免疫微環(huán)境的差異、增生性瘢痕外觀與模型建立的不穩(wěn)定等因素，限制了動(dòng)物模型的廣泛應(yīng)用及增生性瘢痕的研究進(jìn)展。

近期，Zhou等[6]提出通過(guò)在大鼠鼠尾建立矩形創(chuàng)面，并待其充分再上皮化后對(duì)鼠尾施加機(jī)械牽張力的方法來(lái)建立增生性瘢痕的動(dòng)物模型。由于鼠尾結(jié)構(gòu)中無(wú)肉膜結(jié)構(gòu)，該模型創(chuàng)面愈合及瘢痕形成過(guò)程與人增生性瘢痕高度相似，且瘢痕的大體形態(tài)與組織學(xué)變化表現(xiàn)為瘢痕厚度的增加、膠原排列的紊亂及增生性瘢痕相關(guān)蛋白的上調(diào)。然而，在鼠尾的不同節(jié)段其肌肉與肌腱分布不同，導(dǎo)致彎曲所需的牽張力不同。因此，本文通過(guò)比較距鼠尾根部3 cm處與5 cm處的創(chuàng)面牽張力，分析不同張力牽張下的增生性瘢痕大體外觀與組織學(xué)特征改變，并通過(guò)張力相關(guān)蛋白的檢測(cè)明確鼠尾增生性瘢痕的建立與張力環(huán)境的關(guān)系，為該模型在增生性瘢痕研究中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

6周齡雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量200～250 g(本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。根據(jù)創(chuàng)面距鼠尾根部的距離隨機(jī)分為A組(距尾端3 cm)和B組(距尾端5 cm)，每組10只。

Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，兔抗人α-SMA 單克隆一抗、兔抗人FAK單克隆一抗、P-FAK單克隆一抗、兔抗人YAP單克隆一抗(Abcam，USA)，DAB(Vector Laboratories，USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

大鼠腹腔麻醉后，使用亞甲藍(lán)在大鼠鼠尾相應(yīng)位置(3 cm、5 cm)處標(biāo)記6 mm的矩形創(chuàng)面，切開(kāi)標(biāo)記部位的全層皮膚。壓迫止血后采用無(wú)菌紗布包扎，2 d后拆除紗布(此時(shí)傷口無(wú)滲出)，16 d時(shí)待創(chuàng)面再上皮化后安裝鼠尾牽拉裝置。牽拉裝置為直徑2 cm的不銹鋼環(huán)，將鼠尾創(chuàng)面固定于不銹鋼環(huán)上進(jìn)行牽拉(圖1)，并于牽拉28 d后切取瘢痕組織。取材組織一份采用4%多聚甲醛固定包埋，石蠟切片(5 μm厚)；另一份凍存，用于組織蛋白提取。

圖1 大鼠鼠尾創(chuàng)面建立位置及牽拉外觀

1.3 牽張力幅度變化測(cè)量

術(shù)后16 d創(chuàng)面再上皮化后安裝鼠尾牽拉裝置，并進(jìn)行創(chuàng)面牽張前的縱向長(zhǎng)度(L1)與創(chuàng)面牽張后的縱向長(zhǎng)度(L2)的測(cè)量。牽張力幅度變化的計(jì)算公式如下：

1.4 大體觀察

于牽拉后7 d、14 d、21 d、28 d對(duì)大體瘢痕組織進(jìn)行拍照，并利用ImageJ軟件(National Institutes of Health，Bethesda，USA)進(jìn)行分析并測(cè)量瘢痕厚度。

1.5 組織學(xué)觀察與免疫組化

石蠟切片后行Masson染色，利用ImageJ軟件進(jìn)行膠原體積分?jǐn)?shù)(Collagen volume Fraction)測(cè)量。

按照免疫組化標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行脫蠟與水化，并加入兔抗人α-SMA 單克隆一抗(1∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜。加入山羊抗兔IgG-HRP室溫孵育1 h后，DAB顯色。

1.6 張力相關(guān)蛋白檢測(cè)

1.6.1Western blot

將凍存的一份瘢痕組織進(jìn)行研磨后冰上裂解30 min，離心取上清后進(jìn)行BCA法蛋白定量。等量蛋白經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉固定后加入兔抗人FAK單克隆一抗、P-FAK單克隆一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。二抗室溫孵育1 h后行ECL顯影。利用ImageJ分析灰度值，比較蛋白表達(dá)量。

1.6.2免疫熒光法

將石蠟切片按照免疫熒光染色流程進(jìn)行脫蠟、水化與破膜，并加入兔抗人YAP單克隆一抗(1∶200)，4 ℃孵育過(guò)夜。加入山羊抗兔IgG-HRP 室溫孵育1 h，DAPI染核后中性樹(shù)脂封片。熒光顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面所受牽張力變化

在大鼠鼠尾創(chuàng)面再上皮化后，使用外徑為2 cm的不銹鋼環(huán)進(jìn)行牽張。A組、B組創(chuàng)面所受牽拉力分別增加了(22.78%±2.452%)和(15.46%±2.193%)，兩組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖2)。

圖2 牽張力測(cè)量結(jié)果(*： P<0.05)

2.2 瘢痕大體外觀

牽拉7 d、14 d后，A組與B組大鼠鼠尾可見(jiàn)部分瘢痕色澤紅潤(rùn)，質(zhì)地較硬，然而兩組均未見(jiàn)明顯瘢痕厚度變化。牽拉28 d后，A組可見(jiàn)明顯的與人增生性瘢痕相似的組織外觀，且A組瘢痕隆起高度較B組增高了(51.97%±6.992%)，兩組瘢痕厚度差異顯著(P<0.05)(圖3)。

2.3 組織學(xué)Massoon染色、α-SMA蛋白表達(dá)比較

牽拉28 d后，兩組瘢痕組織均可見(jiàn)表皮網(wǎng)釘結(jié)構(gòu)減少，皮膚附件和毛發(fā)消失。Masson染色可見(jiàn)A組膠原束粗大，且呈漩渦樣紊亂排列；B組也可見(jiàn)部分粗大膠原束，且隨張力牽張方向呈平行排列。兩組膠原體積分?jǐn)?shù)分別為(37.34%±2.780%)和(25.18%±1.070%)，差異顯著(P<0.01)(圖4 A、4B)。

A：大體觀察；B：瘢痕厚度(*： P<0.05)A: General observation; B: Scar thickness (*: P<0.05)

免疫組化染色結(jié)果顯示，A組可見(jiàn)α-SMA蛋白在全層均高度表達(dá)，B組可見(jiàn)α-SMA蛋白主要在淺層真皮內(nèi)高度表達(dá)，在深層真皮區(qū)表達(dá)較低。A組α-SMA表達(dá)較B組高(24.06%±3.675%)，兩組蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4C、4D)。

2.4 張力相關(guān)蛋白表達(dá)差異

Western blot結(jié)果顯示， A組P-FAK/FAK表達(dá)較B組高(25.00%±2.447%)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示，大鼠鼠尾增生性瘢痕的YAP蛋白主要表達(dá)于真皮層中。B組YAP蛋白多數(shù)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)激活的YAP蛋白表達(dá)于細(xì)胞核中；A組、B組的YAP蛋白細(xì)胞核內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)率分別為(38.01%±2.101%)和(21.27%±2.684%)，A組激活的YAP蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)水平顯著高于B組(P<0.001)(圖5)。

3 討論

張力是形成增生性瘢痕的重要因素之一。在既往張力誘導(dǎo)的增生性瘢痕動(dòng)物模型中，缺乏對(duì)不同張力影響模型建立的探討。大鼠鼠尾解剖與功能學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，鼠尾肌肉與肌腱極大地影響了鼠尾的彎曲與活動(dòng)[7]，根據(jù)尾椎骨排序?qū)⑹笪布∈譃?組(Co5～10、Co11～16、Co17～22、Co23～28)，其中Co5～10的鼠尾肌肉長(zhǎng)度與重量均顯著高于其他組[8]，提示該段在鼠尾活動(dòng)中提供較大的支持力以維持自身穩(wěn)定不易彎曲。我們將A、B 兩組創(chuàng)面建立于不易彎曲的Co5～10，以保證兩組創(chuàng)面在位置、組織結(jié)構(gòu)基本相同的情況下，比較不同外在牽張力對(duì)大鼠鼠尾增生性瘢痕形成的影響。

A：Masson染色結(jié)果；B：膠原體積分?jǐn)?shù)；C：免疫組化α-SMA染色結(jié)果；D：α-SMA 陽(yáng)性染色比例A: Results of Masson staining; B: Collagen volume fraction; C: Expression of α-SMA by immunohistochemical staining; D: Positive staining ratio of α-SMA

A：FAK 蛋白磷酸化及定量分析；B：YAP蛋白表達(dá)及細(xì)胞核內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)比例A: Phosphorylation of FAK protein and the quantification of P-FAK/FAK; B: Expression of YAP protein and the quantification of nuclear localization of YAP

局部機(jī)械張力被認(rèn)為是病理性瘢痕形成最重要的因素[9]。增生性瘢痕的好發(fā)部位一般為張力較大的區(qū)域，如前胸區(qū)、肩部等，也說(shuō)明局部張力可能參與增生性瘢痕的形成[10]，通過(guò)減少創(chuàng)面張力可緩解增生性瘢痕的發(fā)展[11]。既往體內(nèi)研究證實(shí)，創(chuàng)面愈合過(guò)程中承受張力越大，其纖維化程度越高[12]。體外研究中使用不同牽張力可引起正常成纖維細(xì)胞向增生性瘢痕成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并且發(fā)現(xiàn)瘢痕相關(guān)蛋白的表達(dá)水平與牽張力大小呈反比[13]，提示合適的外在張力可能影響增生性瘢痕的形成。有關(guān)機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究證實(shí)，張力引起的局部黏著斑激酶(Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)的活化以及轉(zhuǎn)錄共激活因子相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)核異位，與纖維化密切相關(guān)[14]。FAK是一種位于細(xì)胞質(zhì)的酪氨酸激酶，接受外界張力信號(hào)的輸入與細(xì)胞內(nèi)張力信號(hào)的輸出，其下游介導(dǎo)細(xì)胞的增殖與遷移功能，既往在惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中廣泛報(bào)道[15]。而YAP是Hippo信號(hào)通路下游關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)張力信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)張力的調(diào)控可促使YAP蛋白的活化與核異位，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖與遷移[16]。

本研究通過(guò)計(jì)算牽張力，初步證實(shí)A組創(chuàng)面承受的牽張力幅度變化大于B 組，持續(xù)牽張28 d后發(fā)現(xiàn)A組瘢痕明顯高于B組，且A組膠原分泌較多、排列紊亂、α-SMA表達(dá)等均高于B組，提示A組增生性瘢痕更接近人增生性瘢痕。通過(guò)檢測(cè)兩組瘢痕中張力相關(guān)蛋白FAK磷酸化與YAP細(xì)胞核異位，推測(cè)A組增生性瘢痕形成與高張力環(huán)境密切相關(guān)。上述結(jié)果表明，在距鼠尾3 cm處的高牽張力可能更加適合大鼠鼠尾增生性瘢痕的形成。

綜上所述，我們初步證實(shí)了大鼠鼠尾距尾部3 cm處的張力較大，于該處建立創(chuàng)面進(jìn)行牽拉可獲得更接近于人增生性瘢痕的動(dòng)物模型，為增生性瘢痕的研究提供了良好的基礎(chǔ)。