李浩 袁玉影 賈園園

[摘要]目的 探討?yīng)毣罴纳鷾珜δz原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠免疫功能的影響。方法 50只清潔級雄性Wistar大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)取6只作為正常組，其余大鼠均左足跖部皮內(nèi)注射膠原乳劑200 μl/只，制作CIA大鼠模型，以關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）≥4為造模成功。將模型大鼠隨機(jī)分為模型組、塞來昔布[0.05 g/（kg·d）]組、獨活寄生湯高濃度[44 g/（kg·d）]組、獨活寄生湯中濃度[22 g/（kg·d）]組和獨活寄生湯低濃度[11 g/（kg·d）]組，對照組和模型組采用等體積蒸餾水處理，1次/d，灌胃30 d。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ABC-ELISA）檢測并比較6組大鼠血清中的T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（T-bet）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）、GATA結(jié)合蛋白3（GATA-3）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-13（IL-13）水平。結(jié)果 模型組大鼠血清中的T-bet、IL-2和IFN-γ水平高于正常組，GATA-3、IL-6和IL-13水平低于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;塞來昔布組和獨活寄生湯低、中、高濃度組的T-bet水平低于模型組，塞來昔布組和獨活寄生湯中濃度組的IL-2水平低于模型組，塞來昔布組和獨活寄生湯低、中濃度組的IFN-γ水平低于模型組，塞來昔布組和獨活寄生湯低、中、高濃度組的GATA-3、IL-6和IL-13水平高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 獨活寄生湯對CIA大鼠可發(fā)揮理想的治療效果，其抗炎機(jī)制通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，使T-bet水平減弱，GATA-3水平增強(qiáng)，抑制免疫炎性因子水平。

[關(guān)鍵詞]類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎;獨活寄生湯;GATA結(jié)合蛋白3;T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子;免疫功能

[中圖分類號] R332? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）1（c）-0025-04

[Abstract] Objective To explore the effect of Duhuojisheng Decoction on the immune function of collagen induced arthritis （CIA） rats. Methods A total of 50 clean male Wistar rats were fed adaptively for 7 days， six rats were randomly selected as the normal group， the other rats were injected with 200 μl collagen emulsion into the skin of the left plantar part of their feet to make CIA rat model. Arthritis index （AI）≥4 was used as the model successfully. The model rats were randomly divided into model group， Celecoxib （0.05 g/[kg·d]） group， Duhuojisheng Decoction high concentration （44 g/[kg·d]） group， Duhuojisheng Decoction medium concentration （22 g/[kg·d]） group and Duhuojisheng Decoction low concentration （11 g/[kg·d]） group， The control group and model group were treated with distilled water of equal volume， once a day， and gavage for 30 days. The levels of T cell specific transcription factor （T-bet）， interleukin-2 （IL-2）， interferon-γ （IFN-γ）， GATA binding protein 3 （GATA-3）， interleukin-6 （IL-6） and interleukin-13 （IL-13） in serum of six groups of rats were detected and compared by double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay （ABC-ELISA）. Results The levels of T-bet， IL-2 and IFN-γ in serum of the model group were higher than those of the normal group， and the levels of GATA-3， IL-6 and IL-13 were lower than those of the normal group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The T-bet level of Celecoxib group and Duhuojisheng Decoction low， medium and high concentration group were lower than those of model group， the level of IL-2 in Celecoxib group and Duhuojisheng Decoction medium group were lower than those in model group， the IFN-γ levels of Celecoxib group， Duhuojisheng Decoction low and medium concentration group were lower than those of model group， the levels of GATA-3， IL-6 and IL-13 in Celecoxib group， Duhuojisheng Decoction low， medium and high concentration group were higher than those in model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Duhuojisheng Decoction can exert ideal therapeutic effect on CIA rats. Its anti-inflammatory mechanism is to reduce T-bet levels， increase GATA-3 levels， and suppress immune inflammatory factor levels by regulating the Th1 / Th2 cell balance.

[Key words] Rheumatoid arthritis; Duhuojisheng Decoction; GATA binding protein 3; T cell specific transcription factor; Immune function

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）屬于一類自身系統(tǒng)性慢性疾病，其典型癥狀為對稱性外周小關(guān)節(jié)炎，主要病理變化為滑膜炎癥，最終導(dǎo)致軟骨和骨的損傷，病因尚不明確。目前，西醫(yī)治療主要運用非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等，不良反應(yīng)較多。中醫(yī)藥治療毒副作用小，同時亦可有效緩解西藥的不良反應(yīng)，在治療RA中發(fā)揮著重要作用[1]。獨活寄生湯被廣泛應(yīng)用，現(xiàn)代藥理學(xué)顯示，此方劑可發(fā)揮一定功效，包括免疫機(jī)能的調(diào)控、抗炎、鎮(zhèn)痛等[2-4];其組方可對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）模型大鼠滑膜組織的病變情況予以有效抑制，相比模型組，病變出現(xiàn)明顯改善[5]。大鼠CIA屬于一類免疫性炎癥，是臨床研究RA疾病普遍應(yīng)用的一類動物模型。近年研究顯示，中藥治療具有整體調(diào)節(jié)、多層次、多靶點的作用[6]，因此，本研究選用獨活寄生湯治療CIA大鼠，以明確相關(guān)機(jī)制，為本方臨床用于治療RA提供參考。本研究旨在探討?yīng)毣罴纳鷾珜IA大鼠免疫功能的影響，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物、試劑和儀器

50只清潔級雄性Wistar大鼠，體重240～260 g，購自長生生物技術(shù)有限公司（遼寧），合格證號SCXK（遼）2015-0001。大鼠實驗操作完全符合醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會要求。獨活寄生湯配方顆粒劑（批號：8050861）、塞來昔布（批號：AN8170，X41713）均購自齊齊哈爾中醫(yī)醫(yī)院;弗氏完全佐劑（FCA）（批號：albr3877v）購自美國Sigma公司;雞Ⅱ型膠原（批號：181105KE16）、GATA結(jié)合蛋白3（GATA-3）（批號：181105KE3）、T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（T-bet）（批號：181105KE4）ELISA試劑盒與白細(xì)胞介素-2（IL-2）（批號：181105KE21）、γ干擾素（IFN-γ）、（批號：181105KE8）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）（批號：181105KE6）、白細(xì)胞介素-13（IL-13）（批號：181105KE13）ELISA試劑盒均購自江蘇晶美生物科技有限公司。MODEL 550型臺式冷凍離心機(jī)（德國Eppend-dorf公司），RT-6000 型酶標(biāo)儀（美國Rayto公司）。水合氯醛（成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號：DST190826-039）。

1.2造模及分組

1.2.1 CIA大鼠模型的建立? 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)取6只作為正常組，其余大鼠建立模型。稱取0.5 mg Ⅱ型膠原蛋白（CⅡ）放入0.25 ml醋酸（0.1 mol/L）內(nèi)，于4℃下攪拌至徹底溶解，終濃度為2 g/L，冰箱（4℃）內(nèi)經(jīng)夜放置;添加等體積的FCA，進(jìn)行乳化反應(yīng)，制成CⅡ乳劑，終濃度為1 g/L。初次免疫時，經(jīng)皮內(nèi)方式將CⅡ由大鼠左足跖部注入，用量為0.2 ml/只，9 d后采取強(qiáng)化免疫處理，注入的CⅡ用量調(diào)整為0.1 ml/只，正常組大鼠則將上述試劑調(diào)整為等體積生理鹽水，共注射15 d，1次/d[7-8]。

1.2.2模型的篩選? 由初次免疫起，每日對建模動物左后肢腫脹狀況進(jìn)行觀察（圖1）和評分（0～4級）[9]，關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）越高，表示其程度越嚴(yán)重。于首次免疫完成后第16 d評估AI值，若AI≥4為造模成功，合計30只。20只造模失敗，則棄去[10]。

1.2.3分組及干預(yù)? 將模型大鼠隨機(jī)分為模型組、塞來昔布[0.05 g/（kg·d）]組、獨活寄生湯高劑量[44 g/（kg·d）]組、獨活寄生湯中劑量[22 g/（kg·d）]組和獨活寄生湯低劑量[11 g/（kg·d）]組，對照組和模型組采用等體積蒸餾水處理，1次/d，灌胃30 d。

1.2.4觀察指標(biāo)的檢測? 給藥30 d時處死大鼠，水合氯醛10%麻醉，腹主動脈取血2 ml[11]，給予5 min離心處理，轉(zhuǎn)速為5000 r/min，將上清凍存于液氮內(nèi)，測定前將標(biāo)本室溫復(fù)融混勻，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ABC-ELISA）檢測大鼠血清中T-bet、IL-2、IFN-γ、GATA-3、IL-6、IL-13水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 20.0分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗，不符合正態(tài)分布的轉(zhuǎn)化為正態(tài)分布再行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠的一般情況

正常組大鼠的精神狀態(tài)良好，飲水量和進(jìn)食量均無異常，體重?zé)o改變，被毛有光澤，行動正常;模型組大鼠精神萎靡、倦怠，進(jìn)食量減少，體重減輕，毛發(fā)失去光澤，活躍度降低。經(jīng)藥物干預(yù)，相比模型組，獨活寄生湯組中劑量組的體重升高明顯，AI值下降，左后肢足墊厚度明顯減小。高劑量組和低劑量組有一定的變化，但變化不明顯。

2.2獨活寄生湯對CIA大鼠血清中T-bet、IL-2、IFN-γ、GATA-3、IL-6、IL-13水平的影響

模型組大鼠血清中的T-bet、IL-2和IFN-γ水平高于正常組，GATA-3、IL-6和IL-13水平低于正常組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;塞來昔布組和獨活寄生湯低、中、高濃度組的T-bet水平低于模型組，塞來昔布組和獨活寄生湯中濃度組的IL-2水平低于模型組，塞來昔布組和獨活寄生湯低、中濃度組的IFN-γ水平低于模型組，塞來昔布組和獨活寄生湯低、中、高濃度組的GATA-3、IL-6和IL-13水平高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。獨活寄生湯低、高濃度組的IL-2水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;獨活寄生湯高濃度組的IFN-γ水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

3討論

獨活寄生湯來源于《千金方》，包含獨活等15味中藥。該方是治療風(fēng)寒濕痹日久證的常用名方，具有祛風(fēng)濕、止痹痛、益肝腎、補(bǔ)氣血等功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要用其治療RA等疾病。能抑制白細(xì)胞介素的表達(dá)而抑制炎癥因子對關(guān)節(jié)軟骨的破壞，起到抗炎的作用。RA屬于一類自身免疫性疾病[12]，研究顯示，在正常免疫機(jī)能維持方面，Th1/Th2型細(xì)胞與此類細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子平衡態(tài)發(fā)揮著關(guān)鍵作用[13-15]。T-bet為Th1細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子[16-17]，Th細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞過程中受到T-bet的調(diào)控，主要介導(dǎo)免疫功能，生成如IL-2等促炎因子，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[18]。GATA-3在Th2細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)，為Th2細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子[19]，參與每個轉(zhuǎn)錄活動，Th2細(xì)胞主要介導(dǎo)體液免疫，分泌抑炎因子IL-13等，抑制炎癥的發(fā)生。

本研究結(jié)果提示在RA中，大鼠T細(xì)胞大多分化為Th1，總的趨勢向Th1漂移，破壞Th1/Th2平衡。獨活寄生湯干預(yù)后大鼠T細(xì)胞向Th2分化，同時抑制Th1細(xì)胞分化，Th1/Th2的平衡功能得到恢復(fù)，此結(jié)論與相關(guān)研究結(jié)果一致[20]。

綜上所述，獨活寄生湯對CIA大鼠可發(fā)揮理想的治療效果，其抗炎機(jī)制通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，使T-bet水平減弱，GATA-3水平增強(qiáng)，抑制免疫炎性因子水平。

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（收稿日期：2019-08-21? 本文編輯：劉克明）