樊長征 苗青 洪巧瑜

[摘要] 目的 探討祛風解痙方調(diào)節(jié)γδT細胞抑制哮喘小鼠氣道高反應性的分子機制。 方法 以卵清蛋白滴鼻的方法建立哮喘Balb/c小鼠模型，以祛風解痙方藥進行干預，比較祛風解痙方對γδT細胞活化過程中信號通路分子磷酸化水平的干預效果。30只實驗小鼠按照隨機數(shù)字表法分為6組，每組5只，分別為空白對照組、哮喘模型組、醋酸潑尼松組（0.27 mg/d）、祛風解痙方低劑量組（0.59 g/d）、祛風解痙方中劑量組（1.18 g/d）、祛風解痙方高劑量組（2.36 g/d）。各組分別進行干預，1次/d，共給藥7 d。給藥結束后麻醉處死小鼠，分離純化及擴增肺氣道組織γδT細胞，CCK-8檢測γδT細胞的增殖活性，Western blot檢測不同信號通路分子的磷酸化水平。 結果 與空白對照組比較，哮喘模型組γδT細胞活性明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與哮喘模型組比較，祛風解痙方低劑量組的γδT細胞活性差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），而祛風解痙方中、高劑量組以及醋酸潑尼松組的γδT細胞活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與空白對照組比較，哮喘模型組p-ERK1/2、p-P38、β-catenin的蛋白表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），ERK1/2、P38蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。與哮喘模型組比較，祛風解痙方低、中、高劑量組以及醋酸潑尼松組p-ERK1/2、p-P38、β-catenin的蛋白表達量減少，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），而祛風解痙方中、高劑量組以及醋酸潑尼松組ERK1/2蛋白表達水平增加，祛風解痙方低劑量組以及醋酸潑尼松組P38蛋白表達水平增加，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結論 祛風解痙方調(diào)節(jié)γδT細胞抑制哮喘小鼠氣道高反應性的可能分子信號通路機制為抑制p-ERK1/2、p-P38、β-catenin的蛋白表達量，減輕哮喘小鼠氣道高反應性，達到治療哮喘的目的。

[關鍵詞] 祛風解痙方;哮喘;γδT淋巴細胞;信號通路分子

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）02（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the molecular mechanism of Qufeng Jiejing Prescription in regulating γδT cells to inhibit airway hyperresponsiveness in asthmatic mice. Methods The Balb/c mouse model of asthma was established with the method of ovalbumin nasal drip， and the intervention was conducted with the drugs of Qufeng Jiejing Prescription. The intervention effect of Qufeng Jiejing Prescription on the molecular phosphorylation level of signaling pathway during activation of γδT cells was compared. Thirty experimental mice method was divided into 6 groups according to random number table， each group of 5 mice， respectively for the blank control group， asthma model group， Prednisone Acetate group （0.27 mg/d）， Qufeng Jiejing Prescription low dose group （0.59 g/d）， Qufeng Jiejing Prescription medium dose group （1.18 g/d）， Qufeng Jiejing Prescription high dose group （2.36 g/d）. Each group was treated 1 time/d and intervention for 7 days. After administration， the mice were anesthetized and sacrificed， and the γδT cells in the lung airway tissues were isolated， purified and amplified. The proliferation activity of the γδT cells was detected by CCK-8， and the phosphorylation levels of molecules in different signaling pathways were detected by Western blot. Results Compared with the blank control group， the activity of γδT cells in the asthma model group was significantly increased， with statistically significant difference （P < 0.05）. Compared with the asthma model group， there was no significant difference in the activity of γδT cells in the Qufeng Jiejing Prescription low dose group （P > 0.05）， while the activity of γδT cells in the medium， high dose groups of Qufeng Jiejing Prescription and the Prednisone Acetate group were significantly decreased （P < 0.05）. Compared with the blank control group， the protein expression levels of p-ERK1/2， p-P38 and β-catenin in the asthma model group increased， with statistically significant difference （P < 0.05）， while the protein expression levels of ERK1/2 and P38 showed no statistically significant difference （P > 0.05）. Compared with the asthma model group， the protein expression levels of p-ERK1/2， p-P38 and β-catenin in the low， medium and high dose groups of Qufeng Jiejing Prescription and the Prednisone Acetate group were decreased， with statistically significant differences （P < 0.05）. However， ERK1/2 protein expression level increased in the middle and high dose groups of Qufeng Jiejing Prescription and Prednisone Acetate group， and P38 protein expression level increased in the Qufeng Jiejing Prescription low dose group and Prednisone Acetate group， the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Conclusion The possible molecular signaling pathway mechanism of the regulation of T cells to inhibit airway hyperresponsiveness in asthmatic mice is to inhibit the protein expression levels of p-ERK1/2， p-P38 and β-catenin， so as to reduce airway hyperresponsiveness in asthmatic mice and achieve the treatment of asthma.

[Key words] Qufeng Jiejing Prescription; Asthma; γδT lymphocyte; Signaling pathway molecules

支氣管哮喘（以下簡稱“哮喘”）是由多種細胞，包括嗜酸粒細胞、中性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、氣道上皮細胞等細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。哮喘主要的免疫學改變是Th1/Th2失衡[2]，也是其發(fā)生發(fā)展的關鍵。γδT細胞通過影響Th1/Th2應答平衡而左右哮喘氣道高反應性的發(fā)生發(fā)展，并參與了哮喘的炎癥及損傷修復過程，使其與哮喘相關性的研究越來越受到重視[3-6]。

本課題組臨床研究證明祛風解痙方可控制哮喘發(fā)作，改善氣道阻塞，明顯改善哮喘患者臨床癥狀，減少急性發(fā)作[7-8]。同時課題組前期以卵清蛋白滴鼻的方法建立哮喘小鼠模型，以祛風解痙方藥進行干預，比較祛風解痙方藥對哮喘模型小鼠肺臟組織病理學、氣道高反應、γδT細胞的Vγ1 mRNA、Vγ4 mRNA表達量及γδT細胞分泌的細胞因子白細胞介素-5（IL-5）、IL-13、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、IL-10、γ-干擾素（IFN-γ）表達水平的干預效果，發(fā)現(xiàn)祛風解痙方藥可降低γδT細胞的Vγ1 mRNA表達量、增加Vγ4 mRNA表達量，同時降低γδT細胞分泌的細胞因子IL-5、IL-13、TGF-β表達水平，調(diào)高IL-10、IFN-γ的表達水平，抑制氣道炎性反應，改善哮喘模型小鼠的氣道高反應性，初步闡明了祛風解痙中藥調(diào)節(jié)γδT細胞抑制哮喘小鼠氣道高反應性的機制。本研究進一步探討了祛風解痙中藥調(diào)節(jié)γδT細胞抑制哮喘小鼠氣道高反應性的可能的分子機制，為臨床應用祛風解痙方藥治療哮喘提供有力的支持及實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物? 6～8周雄性Balb/c小鼠，動物體重35 g，清潔級，溫度18～22℃，濕度50%～60%，光照/陰暗12 h/12 h。小鼠購自湖北省動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：31162040001417，動物合格證號SYXK（鄂）2013-0069。動物飼養(yǎng)及取材符合中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院（以下簡稱“我院”）倫理委員會要求。

1.1.2 試劑及藥物? 卵清蛋白（OVA）（美國Sigma，貨號：A5503-1G）;氫氧化鋁[AL（OH）3]（美國Sigma，貨號：V900163-500G）;p-ERK1/2（美國Affinity公司，貨號：AF1015）;ERK1/2（美國Affinity公司，貨號：AF0155）;p-P38（美國Affinity公司，貨號：AF4001）;P38（美國Affinity公司，貨號：AF6456）;β-catenin（美國Affinity公司，貨號：AF6266）;甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）（美國Affinity公司，貨號：AF7021）;祛風解痙方：炙麻黃9 g、杏仁10 g、防風10 g、地龍12 g、蟬蛻10 g、柴胡9 g、蒼耳子6 g、烏梅6 g、陳皮10 g、半夏9 g、茯苓12 g、甘草6 g（我院中藥房）;醋酸潑尼松片（天津力生制藥股份有限公司，批號：1709111，5 mg/片）。

1.1.3 主要儀器? 臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司，H1650R）;恒溫震蕩培養(yǎng)箱（太倉華美生化儀器有限公司，QHZ-12A）;電泳儀電泳槽（天能科技有限公司，VE-186）;轉(zhuǎn)印槽（Biorad，Trans-Blot SD）;脫色搖床（常州澳華儀器有限公司，TS-1）;二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋SANYO，MCO-20AIC）;超凈工作臺（上海博訊，SC-CL-2FD）;凝膠成像儀（Biaorad公司，ChemiDoc XRS+System）。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制作? 在無菌環(huán)境中飼養(yǎng)適應1周后，進行第1次致敏，腹腔內(nèi)注射20 μg OVA和2 mg Al（OH）3;第2、3周后進行第2、3次致敏，腹腔內(nèi)注射10 μg OVA和1 mg Al（OH）3;第5周開始每天用0.5×磷酸緩沖鹽溶液（PBS）配制的5%OVA 40～50 min滴鼻處理。空白對照組致敏用生理鹽水，滴鼻處理用0.5×PBS，連續(xù)7 d，7 d后評估模型是否成功。

1.2.2 模型成功標準? 造模后對各組小鼠的氣道反應性進行檢測。空白對照組小鼠的呼吸波形圖規(guī)律且均勻，符合正常動物的生理狀態(tài)。模型組呼吸波形圖的上升支和下降支的斜度減小并伴有頓挫，且呼吸周期之間伴有一段時間的基線段。從氣道反應性的結果看，在同一濃度的乙酰膽堿下，哮喘模型鼠的氣道反應性值高于空白對照組。表明小鼠哮喘模型成功建立，作為后續(xù)研究的實驗對象。

1.2.3 分組? 將30只小鼠按照隨機數(shù)字表法將其分為6組，每組5只;空白對照組（不造模，給予等體積生理鹽水，灌服）;模型組對照組（造模后，給予等體積生理鹽水，灌服）;祛風解痙方低劑量組（造模后，給予1倍量中藥，0.59 g/d，灌服）;祛風解痙方中劑量組（造模后，給予2倍量中藥，1.18 g/d，灌服）;祛風解痙方高劑量組（造模后，給予4倍量中藥，2.36 g/d，灌服）;陽性對照組（造模后，給予1倍量醋酸潑尼松片，0.27 mg/d，灌服）。祛風解痙方按人體每日用藥量的1、2、4倍量給藥。醋酸潑尼松片（5 mg/片），成年患者口服10片/d;根據(jù)人與小鼠體表面積換算方法計算小鼠給藥量，按成年患者用藥量的1倍量給藥。模型成立后的第2天開始給藥，飼料正常給。連續(xù)灌胃給藥14 d。

1.2.4 肺氣道組織γδT細胞的分離純化及擴增? 小鼠麻醉處死后，用無菌手術刀取出各組小鼠肺組織，切碎并用collgenase消化得到的細胞，使用抗TCRγδ磁珠分選，并檢測γδT細胞的濃度。將分離純化的γδT細胞加入50 mL培養(yǎng)瓶中，加入3 mL含10%血清、100 U/mL雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，再加唑來膦酸（終濃度為300 pg/mL）、IL-2（終濃度為200 U/mL），置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換1次液，培養(yǎng)9～12 d，調(diào)整細胞濃度為106/mL。

1.2.5 CCK-8檢測γδT細胞的增殖活性? 取擴增10 d的小鼠肺組織γδT細胞，CCK-8檢測分選純化后γδT細胞的增殖活性。接種培養(yǎng)10 d的各組肺氣道組織γδT細胞，向每孔加入10 μL CCK-8反應液，然而將培養(yǎng)板置于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。最后用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.2.6 Western blot檢測不同信號通路分子的磷酸化水平? 收集適量的γδT細胞用含有蛋白酶抑制劑（Complete，Roche）的裂解液進行裂解（50 mmol/L Tris-Cl pH 7.4，1 mmol/L EDTA pH 8.0，250 mmol/L NaCl，1% Triton-X）。蛋白裂解液濃度利用Bradford法進行測量（Bio-Rad No. 5000006）。10 μg細胞裂解液與5×樣品緩沖液（15 g SDS， 15.6 mL 2 mol/L Tris pH 6.8，57.5 g glycerol，16.6 mL b-Mercaptoethanol）混合后，將樣品上樣至10%的聚丙烯酰胺凝膠中，SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（Bio-Rad. NO. 162-0177）。用含0.1% Tween的4%牛奶進行封閉后，加入以下抗體，4 ℃孵育過夜：p-ERK1/2一抗稀釋比1∶500。ERK1/2一抗稀釋比1∶1000。p-P38一抗稀釋比1∶500。P38一抗稀釋比1∶500。β-catenin一抗稀釋比1∶500。GAPDH一抗稀釋比1∶1000。用含0.1% Tween的PBS溶液將膜洗3遍后，加入含0.1% Tween的4%牛奶以及HRP二抗（Dianova，Hamburg，Germany）在室溫條件下孵育2 h。取出膜，在膜上滴加ECL顯影液（Bio-Rad. NO. 170-5060）并放入GelDoc成像系統(tǒng)（Bio-Rad）進行拍照。蛋白表達水平用內(nèi)參蛋白GAPDH進行歸一化處理。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用ANOVA檢驗，組間比較采用LSD檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8檢測γδT細胞的增殖活性

與空白對照組比較，哮喘模型組γδT細胞活性明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與哮喘模型組比較，祛風解痙方低劑量組的γδT細胞活性差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），而祛風解痙方中劑量組、祛風解痙方高劑量組以及醋酸潑尼松組的γδT細胞活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 Western blot檢測不同信號通路分子的磷酸化水平

與空白對照組比較，哮喘模型組p-ERK1/2、p-P38、β-catenin的蛋白表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），ERK1/2、P38蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。與哮喘模型組比較，祛風解痙方低、中、高劑量組以及醋酸潑尼松組的p-ERK1/2、p-P38、β-catenin的蛋白表達量減少，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），而祛風解痙方中、高劑量組以及醋酸潑尼松組ERK1/2蛋白表達水平增加（P < 0.05），祛風解痙方低劑量組以及醋酸潑尼松組P38蛋白表達水平增加，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖1、表2。

3 討論

哮喘的發(fā)病機制主要與氣道炎癥、氣道高反應性、神經(jīng)因素和變態(tài)反應等有關[9]。氣道高反應性在哮喘診斷、病情評估及預后評價中具有重有意義[10]。哮喘發(fā)病迅速，時發(fā)時止，反復發(fā)作，發(fā)時痰鳴氣喘，與風邪善行數(shù)變的性質(zhì)相符，本課題組提出“風盛痰阻，氣道攣急”是哮喘發(fā)作的主要病機之一，并特別指出此風不僅指外風侵襲可致哮病，而且內(nèi)生肝風，夾瘀犯肺，風搖金鳴，亦可致哮喘即發(fā)[11]。“風盛痰阻，氣道攣急”既是哮喘發(fā)作的病因，又是哮喘發(fā)病之結果，“風盛痰阻，氣道攣急”的狀態(tài)貫穿于哮喘的發(fā)作期、緩解期、穩(wěn)定期整個病程中，這與哮喘重要特征氣道高反應性存在高度一致。祛風解痙方藥依據(jù)哮喘氣道高反應性的關鍵病因病機“風盛痰阻，氣道攣急”而組成，在臨床觀察中取得較好的療效[11]。

細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）是90年代初期分離鑒定的一種蛋白激酶[12]。ERK是MAPKs家族一個重要亞族（ERK又稱為MAPK），ERK1和ERK2統(tǒng)稱為ERK1/2，是其中的兩個重要成員。MAPK信號轉(zhuǎn)導通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，MAPK的組成是一種保守的三級激酶模式，包括MAPK激酶激酶、MAPK激酶、MAPK[13]，這3種激酶能依次激活，共同調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、遷移、侵襲、凋亡、應激和炎性反應等重要的細胞生理和病理過程[14]。p38促分裂原活化的蛋白激酶（p38 MAPK）在激素抵抗型哮喘的發(fā)病過程中起著重要作用[15]。p38通路被促炎因子、細菌病原體及其代謝產(chǎn)物磷酸化激活，激活后的p38 MAPK由胞質(zhì)進入細胞核內(nèi)，活化轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)特定的基因表達參與應激條件下細胞的免疫炎性反應及細胞生長、細胞分化、細胞周期和細胞調(diào)死過程[16-17]。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）最早作為一種黏附因子被發(fā)現(xiàn)，主要位于細胞膜，而在胞漿中游離量較少[18]。β-catenin是鈣黏蛋白復合體的亞基，并且在Wnt信號途徑中起細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的作用[19-20]。T細胞較其他免疫細胞表達更高水平的Wnt分子，預示這一通路在T細胞的應答過程中扮演著更為重要的角色[21]。

本研究結果顯示，與空白對照組比較，哮喘模型組γδT細胞的細胞活性顯著增強，提示哮喘模型鼠肺組織的炎性反應加重。祛風解痙方中劑量組、祛風解痙方高劑量組及醋酸潑尼松組的γδT細胞的細胞活性顯著減弱，提示中藥治療和陽性藥物治療可以顯著緩解哮喘模型小鼠肺組織的炎性反應，具有一定的治療效果。同時本研究也深入研究了該反應途徑的信號通路的具體分子機制，其中祛風解痙方藥干預后的細胞p-ERK1/2、p-P38、β-catenin的蛋白表達量降低，提示哮喘模型小鼠γδT細胞中的MAPK及Wnt信號通路被激活，通過中藥治療或陽性藥物治療后，MAPK及Wnt信號通路一定程度上被抑制。

綜上，祛風解痙方調(diào)節(jié)γδT細胞抑制哮喘小鼠氣道高反應性的可能分子信號通路機制為抑制p-ERK1/2、p-P38、β-catenin的蛋白表達量，降低哮喘小鼠氣道高反應性，達到治療哮喘、改善癥狀的目的。

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（收稿日期：2019-09-23? 本文編輯：顧家毓）