李盛建，王 慧，呂 磊，李群英，須秋萍，周艷卿，張國慶，趙 亮

(1. 上海寶山區(qū)羅店醫(yī)院藥劑科，上海 201908；2. 上海東方肝膽外科醫(yī)院藥劑科，上海 200438)

表觀遺傳，是指在DNA堿基序列不發(fā)生變化，其表型或基因表達發(fā)生了可穩(wěn)定遺傳的變化，包括DNA甲基化修飾、RNA甲基化修飾及非編碼RNA等。目前研究中，DNA甲基化修飾為較清楚的表觀遺傳學(xué)修飾，其影響基因表達、蛋白功能等重要生命過程；同時，轉(zhuǎn)錄后多達100多種RNA修飾被認為豐富了RNA功能和遺傳多樣性，N6-甲基腺嘌呤核苷(N6-methyladenosine，m6A)和5-甲基胞嘧啶核苷是其中最具有代表性的甲基化修飾，而m6A更為普遍，在RNA甲基化修飾中超過80%[1]。近年來，m6A相關(guān)的研究涉及RNA翻譯效率[2]、DNA損傷修復(fù)[3]、生長發(fā)育[4]、腫瘤形成[5]等等，可見其重要性。

由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)具有快速、靈敏、準確性高、檢測限低等特點，其應(yīng)用在表觀遺傳領(lǐng)域中漸漸嶄露頭角，如基因組羥甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶修飾等研究[6-7]，但m6A甲基化修飾的LC-MS/MS分析方法國內(nèi)外鮮有報道。本研究通過建立一種穩(wěn)定可靠的LC-MS/MS法測定腺嘌呤核苷(adenosine，A)和m6A含量，分析肝癌細胞株HepG2的m6A甲基化水平，并與正常肝細胞株L02進行比較。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 本研究采用的細胞為人源肝癌細胞株HepG2和正常肝組織細胞株L02，均由上海東方肝膽外科醫(yī)院信號轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗室惠贈。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器：Agilent 1290 UPLC二元液相色譜系統(tǒng), Agilent 6470 Triple Quad質(zhì)譜儀(美國Agilent)；METTLER AE 240型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO)；低溫離心機(美國Thermo Fisher)；Millipore超純水儀(美國Millipore)。

1.2.2 試劑：對照品腺嘌呤核苷和對乙酰氨基酚(中國食品藥品檢定研究院)，N6-甲基腺嘌呤核苷(美國SELLECK CHEMICALS)，Trizol，Ambion?Dynabeads mRNA Purification Kit，mRNA RiboMinusTMHuman Transcriptome Isolation Kit(美國Thermo Fisher)，甲醇、乙腈為色譜純(美國Honeywell)，甲酸為色譜純(美國SIGMA)，水為超純?nèi)ルx子水，其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 mRNA的提取和酶解:取對數(shù)期生長的HepG2和L02細胞，細胞數(shù)量(1～5)×106個；按TRI Reagent?試劑說明書步驟，采用Trizol法提取總RNA；按照Ambion? Dynabeads mRNA Purification Kit和RiboMinusTMHuman Transcriptome Isolation Kit試劑盒說明書中的步驟從總RNA中分離純化mRNA及去除rRNA；用Nanodrop測定mRNA濃度。取200 ng mRNA，2.5 μl 緩沖鹽溶液(10×，20 mmol/L ZnCl2，100 mmol/L NaCl)和1 μl核酸酶至EP管，加雙蒸水補齊至25 μl，37°C下反應(yīng)2h；反應(yīng)體系中再加入2.5 μl酶緩沖溶液和1 μl堿性去磷酸酶，37°C下反應(yīng)2h；在反應(yīng)體系中加入去離子水稀釋至200 μl，-80℃冰箱保存待檢測。

1.3.2 溶液的配制：分別精密稱A，m6A及對乙酰氨基酚對照品10 mg，置于10 ml 容量瓶中，加甲醇溶解，配成1.00 mg/ml對照品儲備液；用甲醇按比例逐級稀釋配制不同濃度工作液，其中A，m6A混合對照品溶液濃度分別為30.00，100.00，200.00，400.00，2 000.00，10 000.00 ng/ml和3.00，10.00，20.00，40.00，200.00，1 000.00 ng/ml，質(zhì)控儲備液濃度分別為40.00，4 000.00，8 000.00 ng/ml和4.00，400.00，800.00 ng/ml，對乙酰氨基酚內(nèi)標溶液濃度為20.00 ng/ml。上述對照品儲備液置4℃冰箱保存。

分別取10 μl上述對照品工作液，加到190 μl含有酶及酶解緩沖液的空白水基質(zhì)中，配成m6A與A系列濃度工作液樣品。A的質(zhì)量濃度為1.50，5.00，10.00，20.00，100.00和500.00 ng/ml，隨行質(zhì)控樣品低、中、高質(zhì)量濃度分別為2.00，200.00和400.00 ng/ml；m6A的質(zhì)量濃度為0.15，0.50，1.00，2.00，10.00，和50.00 ng/ml；低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品分別為0.20，20.00和40.00 ng/ml。

1.3.3 色譜及質(zhì)譜條件：色譜條件：色譜柱為美國Agilent Proshell 120 EC-C18(3.0×100 mm，2.7 m)，預(yù)柱：Agilent UPLC Guard SB C18(3.0×5 mm，2.7μm)柱溫：30℃。流動相系統(tǒng)：水(0.1%FA)∶甲醇=82∶18(v/v)等度洗脫，分析時間3 min，進樣量2 μl。質(zhì)譜條件：采用AJS ESI正離子模式，ESI源參數(shù)設(shè)置：干燥氣溫350℃；干燥氣流速10 L/min；霧化器壓力40 psi；鞘氣溫度350℃；鞘氣流速11 L/min；毛細管電壓4 000 V；噴嘴電壓2 000 V。動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式參數(shù)設(shè)置：A檢測參數(shù)268.0→136.0，碎片電壓90V，碰撞能量15 eV；m6A檢測參數(shù)282.0→150.0，碎片電壓70V，碰撞能量15 eV；內(nèi)標檢測參數(shù)152.3→110.0，碎片電壓110V，碰撞能量17 eV。

1.3.4 待測樣品前處理：取待測細胞樣品30 μl于1.5 ml EP管中，加入60 μl對乙酰氨基酚內(nèi)標 (10 ng/ml )，渦旋30 s，4 ℃條件下12 000 g離心5 min；取上清液于進樣瓶中，用于LC-MS/MS檢測。

2 結(jié)果

2.1 LC-MS/MS 方法學(xué)驗證

2.1.1 方法專屬性： 分別取30 μl空白基質(zhì)、對照品溶液和待測細胞樣品，按“1.3.4”項步驟處理(處理空白基質(zhì)時，內(nèi)標用甲醇代替)，按“1.3.3”項條件下進樣分析(見圖1)，A保留時間為1.3min， m6A保留時間為1.4 min，內(nèi)標保留時間為2.4 min，對照品溶液和待測細胞樣品中待測分析物出峰時間一致，無雜質(zhì)干擾峰，峰形良好。結(jié)果表明，該方法具有良好的專屬性。

A.空白基質(zhì)，B.低濃度質(zhì)控樣品，C.待測樣品圖1 待測物與內(nèi)標多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖

2.1.2 標準曲線范圍與定量下限: 分別取“1.3.2”項中配制好的對照品溶液30 μl，按“1.3.4”項操作，分別配成6個濃度的標準樣品，每濃度點配制5份樣品，連續(xù)進樣分析，記錄色譜圖，以濃度 (X)為橫坐標，各待測物的峰面積與內(nèi)標的比值(Y)為縱坐標進行回歸計算，權(quán)重系數(shù)1/x2，求得回歸方程A:Y= 0.040 6X- 0.035 9,r=0.999 9，線性范圍為1.50 ～ 500.00 ng/ml；m6A:Y= 0.010 3X- 0.000 9,r= 0.9999，線性范圍為0.15 ～50.00 ng/ml。A和m6A分別在1.50 ～500.00 ng/ml和 0.15～50.00 ng/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，定量限分別為1.50 ng/ml和0.15 ng/ml。

2.1.3 精密度和準確度實驗: 按“1.3.2”和“1.3.4”項中的方法制備低、中、高三種濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度平行操作5份，進樣分析，連續(xù)3 天，將被測物和內(nèi)標的峰面積比值代入標準曲線方程計算實際樣品濃度，精密度用相對標準偏差(RSD)表示，結(jié)果見表1。m6A日內(nèi)精密度RSD<13.77 %，日間精密度RSD<11.50 %。A日內(nèi)精密度RSD<7.84%,日間精密度RSD<5.78%。準確度以相對回收率表示，實測濃度與理論加入濃度的比值即為相對回收率，結(jié)果m6A日內(nèi)、日間準確度范圍在93.67 %～101.07 %。A日間、日內(nèi)準確度范圍98.58%～101.10%。提示該方法的精密度和準確度均能達到檢測要求。

表1 待測物日間、日內(nèi)的精密度與準確度(n=5)

2.1.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率：按“1.3.2”和“1.3.4”項中的方法制備含待測物低、中、高濃度的質(zhì)控樣品；按“1.3.5”項方法處理空白基質(zhì)(內(nèi)標用甲醇代替)，取上清溶液，加入一定量質(zhì)控濃度對照品儲備溶液，使其最終濃度分別與質(zhì)控樣品的進樣濃度一致；配制待測物的甲醇溶液，其最終濃度分別與質(zhì)控樣品的進樣濃度一致。進樣得峰面積，計算含基質(zhì)與不含基質(zhì)樣品的峰面積之比，得到相應(yīng)物質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)；計算基質(zhì)存在下，前處理和后處理加標樣本的峰面積比值，得到待測物的提取回收率?？疾靸?nèi)標的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率與上述操作一致。結(jié)果低、中、高三種濃度待測物及內(nèi)標提取回收率均在91.46 %～97.60 %之間，基質(zhì)效應(yīng)均在90.26 %～99.27 %之間(見表2)。結(jié)果表明回收率滿足定量要求，基質(zhì)效應(yīng)對待測物的定量不產(chǎn)生明顯的影響。

2.1.5 穩(wěn)定性考查：按“1.3.2”和“1.3.4”項中的方法制備含待測物低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，考察按以下方式處理后樣品的穩(wěn)定性：室溫放置6 h后處理；處理后室溫放置24 h；三個凍融循環(huán)；-80℃保存30天。測定樣品實際濃度并計算RSD和相對偏差(RE)，計算公式：RE %=(實測值-真實值)/ 真實值×100 %。結(jié)果RSD%均小于15.0 %，RE的范圍為0.4 % ～ 6.9 %，表明樣品在上述處理狀態(tài)下穩(wěn)定性良好。

表2 待測物及內(nèi)標提取的回收率和基質(zhì)效應(yīng)

注：IS: Internal Standard

2.2 樣品分析 取“1.3.1”項的HepG2和L02待測樣品，按“1.3.4”項處理進樣分析。按內(nèi)標法計算樣品中m6A和A的濃度，并根據(jù)下列公式計算mRNA中m6A甲基化百分比：m6A %=(Cm6A/ Mm6A)/(CA/MA+Cm6A/Mm6A)，Mm6A和MA分別為m6A和A的摩爾質(zhì)量，Cm6A和CA分別為m6A和A的樣品實測濃度。對m6A甲基化水平進行統(tǒng)計分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明肝癌細胞株HepG2的m6A甲基化水平高于正常肝細胞株L02。

表3 細胞株HepG2和L02的m6A甲基化水平

3 討論

目前傳統(tǒng)的m6A甲基化分析技術(shù)主要有斑點雜交法[8]、酶聯(lián)免疫吸附法[9]和免疫共沉淀法[10]等，但這些分析方法存在半定量或定量效率不高等問題，LC-MS/MS法與之相比，分析方法穩(wěn)定、靈敏度高、選擇性好、操作簡便等優(yōu)點[11]。

本方法首先從細胞中提取mRNA,并使用酶解法將mRNA消化為核苷，最后通過LC-MS/MS法檢測樣品中m6A和A的相對濃度，從而計算m6A甲基化水平。該方法直接測定核苷的相對濃度，需要核酸酶和堿性去磷酸酶將RNA水解為單個核苷，但由于酶活性和消化時間等因素可能存在RNA酶解不完全導(dǎo)致測定誤差。為了消除這一問題，我們在預(yù)實驗中考察了核酸酶和堿性去磷酸酶的反應(yīng)濃度和反應(yīng)時間，最終確定“1.3.1”項下RNA消化條件最為合適。為提高目標化合物的響應(yīng)，對質(zhì)譜參數(shù)進行了優(yōu)化。ESI離子源中，在正、負離子模式下，m/z 50～400范圍內(nèi)進行全掃描，選取響應(yīng)較強、干擾較小的作為定量離子對，以確定合適的母離子和子離子。在多反應(yīng)離子監(jiān)測模式下，優(yōu)化了m6A，A和內(nèi)標的碰撞能量，提高其響應(yīng)度。最終采用m/z 282/180，m/z 268/136和m/z 152/110分別作為m6A，A和內(nèi)標的定量離子對。本研究中待測物為細胞中的內(nèi)源性化合物，難以獲取空白基質(zhì)，定量分析內(nèi)源性化合物主要有代替物分析法和代替基質(zhì)分析法。代替物分析法指選擇合適的待測物替代分析物(如同位素等)加入真實的生物基質(zhì)中配置標準曲線；代替基質(zhì)分析法指待測物在替代基質(zhì)(水、純有機溶劑等)中配置標準曲線[12]。在預(yù)實驗中，我們考察了同位素代替物與待測物響應(yīng)值的等效性，發(fā)現(xiàn)兩者之間有較大的差異，代替物分析法無法應(yīng)用于本研究；經(jīng)純化后的待測樣品基質(zhì)組成較簡單，主要由少量鹽與蛋白酶組成，因此本研究采用了含酶和酶緩沖液的水作為代替基質(zhì)測定m6A與A的濃度。在肝癌疾病中m6A是一種抑癌因子，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL-14的下調(diào)導(dǎo)致m6A甲基化水平降低，進而促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[8,13]。采用本方法測得的肝癌細胞株HepG2的m6A甲基化水平低于正常肝細胞L02，結(jié)果與上述研究相符，提示該方法測試結(jié)果的準確性。

總之，本研究建立的LC-MS/MS法，具有快速、靈敏、準確性高、檢測限低等特點，能進一步應(yīng)用于m6A甲基化的生物學(xué)功能研究中。