秦 帥 ，吳麗麗 ，秦靈靈 ，張程斐 ，吳呦呦 ，孫伯菊 ，劉銅華 ，＊＊

（1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 成都 610036；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)教育部中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點實驗室 北京 100029；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 北京 100078）

由于環(huán)境污染、久坐缺乏運動、高熱卡飲食、人口老齡化等因素的影響使得2 型糖尿病（type 2 diabetic mellitus，T2DM）在全世界范圍流行。第9 版《全球糖尿病地圖（IDF Diabetes Atlas）》顯示全球現(xiàn)有糖尿病患者4.63 億人，預(yù)計到2030 年，該數(shù)字將達到5.78億[1，2]。而我國更成為糖尿病患者最多的國家。T2DM作為全球流行的主要慢性代謝性疾病之一，其發(fā)病核心病機是胰島素抵抗和胰島β細胞功能不足。T2DM的發(fā)生與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）密切相關(guān)，IR 貫穿T2DM 的整個過程。因此從天然植物中發(fā)現(xiàn)可改善胰島素抵抗的藥物成為研究熱點。

水飛薊賓是從植物水飛薊（Silybum marianum）中提取的水飛薊素的黃酮木脂素成分。臨床常用其抗氧化和保肝特性治療肝功能異常疾病[3]。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其具有抗肥胖、降脂、抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化，防治糖尿病并發(fā)癥等作用[4-7]。作為葡萄糖攝取和儲存的主要部位，骨骼肌攝取的葡萄糖約占全身葡萄糖攝取總量的75%[8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)肌肉組織胰島素抵抗與STAT3 的磷酸化水平及SOCS3 蛋白表達水平與呈正相關(guān)。由棕櫚酸鈉暴露導(dǎo)致L6 肌管中STAT3 的磷酸化，同時SOCS3 的蛋白豐度增加產(chǎn)生胰島素抵抗，而STAT3 基因沉默可降低SOCS3 蛋白水平，并改善胰島素抵抗[9]。研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓作為STAT3 的抑制劑應(yīng)用于癌癥、免疫性等疾病的治療[10，11]。但水飛薊賓能否可以通過抑制STAT3/SOCS3信號通路改善肌肉組織胰島素抵抗尚不明確。本研究應(yīng)用C2C12 成肌細胞為模型，研究水飛薊賓對C2C12胰島素抵抗的影響，并探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

R200D 型分析天平（德國賽多利斯），Sigma 臺式高速低溫冷凍離心機（Sigma-Aldrich 公司），HDL 型超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），HERA Cell 150i CO2 孵育箱（美國Thermo Scientific），酶標儀（美國 Promega 公司），IX71 倒置顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 實驗細胞

C2C12細胞株由北京中醫(yī)藥大學(xué)教育部中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點實驗室提供。

1.3 主要試劑及材料

水飛薊賓（上海源葉生物技術(shù)有限公司，純度＞98%），DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Gibco），青霉素-鏈霉素混合液（Biotopped），胎牛血清（foetal bovine serum，F(xiàn)BS，ORIGIN 公司），馬血清（天津康源生物技術(shù)有限公司），胰蛋白酶-EDTA 溶液（Biotopped），二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO，北京Solarbio），棕櫚酸（北京Solarbio），葡萄糖測試盒（南京建成生物工程研究所），細胞計數(shù)試劑盒CCK-8（日本同仁化學(xué)），全蛋白提取試劑盒（強）（北京Solarbio），BCA蛋白定量試劑盒（北京 Solarbio）；TNF-α，IL-β及 IL-10 ELISA 檢測試劑盒（上海優(yōu)維寧生物有限公司），抗體P-STAT3、SOCS3、β-actin（美國 CST），Blocking one 及 Blocking one-P（日本Nacalai Tesque），30%蛋白凝膠溶液（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司），Solution1（日本TOYOBO），Solution2（日本TOYOBO），96及6孔細胞培養(yǎng)板（美國Corning）。

2 方法

2.1 C2C12細胞培養(yǎng)

用含10%FBS 和1%青-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，放置于37℃，5%CO2 的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日更換1 次培養(yǎng)液，待細胞密度覆蓋培養(yǎng)皿80-90%時，用胰蛋白酶溶液消化2 min，1:3 傳代2-3 次后用于后續(xù)實驗。

2.2 水飛薊賓對C2C12細胞增殖能力的影響

實驗設(shè)空白組、正常組、對照組（含DMSO 100μg·mL-1）、不同濃度水飛薊賓藥物處理組（150μmol·L-1、100 μmol·L-1、50μmol·L-1、30 μmol·L-1、20 μmol·L-1、15μmol·L-1、10μmol·L-1、5μmol·L-1），其中空白組為不含藥物及細胞的培養(yǎng)基、正常組為含細胞的完全培養(yǎng)基。將生長至80-90%的C2C12 細胞以3 × 104/mL的密度接種于 96 孔板，200μL/孔，設(shè) 6 個復(fù)孔，放置細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，然后加10μL/孔CCK-8，置于細胞培養(yǎng)箱中反應(yīng)90 min，置酶標儀中測定吸光度（波長為450 nm），讀取數(shù)值。

細胞存活率：存活率=（給藥組/對照組- 空白組）/（正常組-空白組）×100%

2.3 建立C2C12細胞胰島素抵抗模型

將生長至 80-90% 的 C2C12 細胞以 5 × 104/mL 的細胞密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板，2 mL/孔，培養(yǎng)2 天，待細胞融合度達到85%以上時，換用含2%馬血清的DMEM 誘導(dǎo)培養(yǎng)4 天，隔日更換1 次培養(yǎng)液，直至85%以上的成肌細胞分化為肌管即成熟肌細胞。將分化的肌管細胞分為正常組（Normal）和造模組（Control），正常組用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，造模組用 0.5 mmol·L-1棕櫚酸造模液培養(yǎng) 16 h[12]。

2.4 水飛薊賓對胰島素抵抗C2C12 細胞葡萄糖攝取能力的影響

采用上述方法建立C2C12 胰島素抵抗模型，棄培養(yǎng)基，用PBS 洗2 次，設(shè)正常組、模型組及不同濃度的水飛薊賓組，其中正常組為不含胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，設(shè)6個復(fù)孔，放置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄舊培養(yǎng)基，用PBS洗2次，換不含胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，用葡萄糖測試盒測定各組C2C12 細胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量，進一步計算葡萄糖消耗量。

葡萄糖消耗量=總葡萄糖含量-不同處理組葡萄糖含量。

2.5 水飛薊賓對C2C12 細胞分泌 TNF-α、IL-β 及 IL-10的影響

收集2.4 中各組C2C12 細胞培養(yǎng)液，4℃，800 g，離心10 min，收集上清。用ELISA 試劑盒檢測TNF-α、IL-β及IL-10炎性因子水平。

2.6 水飛薊賓對C2C12 細胞P-STAT3、SOCS3 蛋白表達影響

收集2.4 中不同處理組的C2C12 細胞，用全蛋白提取試劑盒提取各組C2C12 細胞總蛋白。用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，加PBS 和2×蛋白上樣緩沖液調(diào)整各組蛋白至統(tǒng)一濃度，100℃煮沸5 min 后置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)蛋白濃度，確定蛋白上樣量為20μg/孔，先80 V 預(yù)電泳 10 min，再 100 V 電泳 90 min。將 PVDF 膜置于甲醇中活化1 min，用半干法凝膠轉(zhuǎn)膜法恒流200 mA 轉(zhuǎn)膜 30 min，用 1 × TBS 搖床室溫洗 3 次，每次 10 min，Blocking one 或 Blocking one-P 室溫封閉 1 h，分別加 P-STAT3、SOCS3 和β-actin（1∶1000 稀釋）4℃孵育過夜。次日回收一抗，用1×TBST搖床室溫清洗3次，每次10 min，加二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，回收二抗，用1×TBST 搖床室溫清洗3 次，每次10 min。加超敏發(fā)光液，避光反應(yīng)1 min，凝膠成像系統(tǒng)顯影。用Image J軟件對灰度值進行分析。

2.7 數(shù)據(jù)分析

采用Graphpad Prism 6 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用平均值±標準差（）來表示。多組間比較采用One-way ANOVA；兩組間比較，當滿足方差齊性時用LSD 檢驗，當不滿足方差齊性時用非參數(shù)檢驗；P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01表示有極顯著差異。

3 結(jié)果

3.1 水飛薊賓對C2C12細胞增殖能力的影響

CCK-8 檢測結(jié)果顯示（圖1）：當水飛薊賓濃度大于 20μmol·L-1時水飛薊賓影響 C2C12 細胞增殖能力，當濃度在30μmol·L-1時，細胞存活率僅為87.65%，當濃度高于 30μmol·L-1時，C2C12 細胞的生長增殖能力明顯降低，且濃度越高，存活率越低；而當濃度低于30μmol·L-1時，細胞存活率接近于100%，故選5μmol·L-1、10μmol·L-1和 20μmol·L-1濃 度 用 于 后 續(xù) 實 驗研究。

3.2 水飛薊賓對胰島素抵抗C2C12 細胞葡萄糖攝取能力的影響

由表 1 知，與 Normal 組比較，Control 組的葡萄糖消耗量明顯降低（P＜ 0.01），說明Control 組C2C12 細胞對葡萄糖的攝取能力下降，成功建立C2C12 細胞胰島 素 抵 抗 模 型 。 而 與 Control 組 比 較 ，5μmol·L-1、10μmol·L-1、20μmol·L-1水飛薊賓組均較 Control 組葡萄糖消耗量明顯增加（P＜0.01），且呈劑量依賴性，葡萄糖消耗量分別增加了33.5%、45.3%與67.1%。說明水飛薊賓可增加C2C12 細胞對葡萄糖的攝取能力，改善C2C12細胞胰島素抵抗。

圖1 水飛薊賓對C2C12細胞增殖能力的影響

表1 水飛薊賓對C2C12細胞葡萄糖消耗量的影響（）

表1 水飛薊賓對C2C12細胞葡萄糖消耗量的影響（）

注：與Control 組對比，*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；Control 組與 Normal 組對比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01（n=6）。

葡萄糖消耗量/（mmol·L-1）4.17±0.30 3.22±0.44##4.30±0.27**4.68±0.29**5.38±0.49**分組Normal組Control組5 μmol·L-1組10 μmol·L-1組20 μmol·L-1組

表2 水飛薊賓對TNF-α、IL-β、IL-10炎性因子的影響（）

表2 水飛薊賓對TNF-α、IL-β、IL-10炎性因子的影響（）

注：與Control 組對比，*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；Control 組與 Normal 組對比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01（n=6）。

IL-10(pg·mL-1)4.42±0.28 2.91±0.56##3.22±0.40 3.58±0.39*4.03±0.53**分組Normal組Control組5 μmol·L-1組10 μmol·L-1組20 μmol·L-1組TNF-а(pg·mL-1)2.67±0.34 3.48±0.41##3.12±0.33 3.03±0.50*2.97±0.37**IL-β (pg·mL-1)6.07±0.28 11.81±0.69##10.80±0.50 8.35±0.43*7.95±0.49**

3.3 水飛薊賓對C2C12 細胞分泌TNF-α、IL-β、IL-10炎性因子的影響

由表 2 知，與 Nromal 組比較，Control 組 TNF-α和IL-β水平明顯提高（P＜ 0.01），說明Control 組促炎因子水平明顯提高，而抗炎因子IL-10 水平明顯減低（P＜ 0.01）。與 Control 組比較，5μmol·L-1、10μmol·L-1及 20 μmol·L-1水飛薊賓組可降低 Control 組 TNF-α和IL-β水平，并提高IL-10水平，其中20μmol·L-1可顯著減低TNF-α和IL-β水平（P＜ 0.01），同時提高IL-10水平（P＜0.01）。說明水飛薊賓可抑制C2C12 胰島素抵抗模型炎癥因子分泌。

圖2 水飛薊賓對C2C12細胞P-STAT3、SOCS3蛋白的影響

表3 水飛薊賓對C2C12細胞P-STAT3、SOCS3蛋白表達影響（，n=6）

表3 水飛薊賓對C2C12細胞P-STAT3、SOCS3蛋白表達影響（，n=6）

注：與 Control 組對比，*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01；Control 組與 Normal 組對比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

SOCS3/β-actin 0.744±0.042 1.011±0.057##0.951±0.064 0.802±0.050*0.784±0.055**分組Normal組Control組5 μmol·L-1組10 μmol·L-1組20 μmol·L-1組P-STAT3/β-actin 0.445±0.051 0.699±0.062##0.607±0.047 0.588±0.050*0.532±0.046**

3.4 水飛薊賓對C2C12 細胞P-STAT3、SOCS3 蛋白表達的影響

由圖 2 和表 3 知，與 Normal 組比較，Control 組 PSTAT3 和 SOCS3 蛋白水平明顯提高（P＜ 0.01）。與Control 組比較，5μmol·L-1、10μmol·L-1及 20μmol·L-1水飛薊賓組可抑制STAT3 磷酸化水平，進而降低SOCS3蛋白表達水平。

4 討論

作為全世界最主要的慢性非傳染性疾病之一，糖尿病及其并發(fā)癥給患者帶來沉重的經(jīng)濟和心理負擔(dān)，嚴重影響患者的生活及生存質(zhì)量。自從Hotamisligil等[13]報道在肥胖和T2DM 嚙齒動物模型的脂肪組織中存在TNF-α，證明了肥胖、T2DM 和炎癥之間存在聯(lián)系。他們證明在肥胖的fa/fa 大鼠中敲除TNF-α可以改善了胰島素敏感性。此外，若敲除TNF-α或TNF 受體的糖尿病模型小鼠可提高胰島素敏感性，降低血糖[14，15]。研究表明多種促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β破壞了肥胖癥的胰島素作用并導(dǎo)致胰島素抵抗[16]。TNF-α通過增強脂肪細胞的脂解作用，調(diào)控IKKβ/NF-κB信號通路，同時激活STAT3，增加胰島素受體底物1（IRS1）的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化而引起胰島素抵抗[17]。

IL-10 作為一種重要的抑炎細胞因子，主要由巨噬細胞產(chǎn)生[18]。多項研究表明IL-10 小鼠骨骼肌和成肌細胞中表達，其通過抑制巨噬細胞的活化和阻斷抗原的遞呈以及炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β的釋放和活化來抑制炎癥反應(yīng)，從而減少全身及肌肉組織等局部炎癥，改善骨骼肌的胰島素信號通路和肌肉組織對葡萄糖攝取及利用，改善胰島素抵抗[19-21]。研究發(fā)現(xiàn)若過表達骨骼肌中IL-10可以改善飲食誘導(dǎo)的小鼠胰島素抵抗[22]。

已知STAT 是一個轉(zhuǎn)錄因子家族，與其他STAT 蛋白相比，STAT3 具有更高的保守性，是最原始、最普遍的STAT 類型[23]。STAT3 的激活可由多種不同類型的刺激引起，如細胞炎癥因子、生長因子、致癌物、氧化應(yīng)激、感染和輻射。其參與細胞因子和營養(yǎng)物質(zhì)誘導(dǎo)的胰島素抵抗[24]。研究發(fā)現(xiàn)T2DM 患者STAT3 磷酸化水平提高，而升高的P-STAT3 影響骨骼肌胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和外周組織如肌肉對葡萄糖攝取，從而引起胰島素抵抗[25]。

細胞因子信號傳遞的抑制因子家族（SOCS）最初在1997年被發(fā)現(xiàn)，它是一種參與負反饋回路以減弱細胞因子作用的分子[26，27]。在肥胖或者糖尿病患者種，各種組織中SOCS 蛋白的表達升高，這對調(diào)節(jié)新陳代謝和胰島素敏感性至關(guān)重要。其家族中的SOCS1 和SOCS3 在肌肉高表達，可通過競爭胰島素受體上的磷酸酪氨酸結(jié)合位點來阻止胰島素誘導(dǎo)的IRS蛋白的激活，從而誘發(fā)胰島素抵抗[28，29]。而STAT3 沉默可下調(diào)T2DM 患者 SOCS1 和 SOCS3 的蛋白豐度，從而增強IRS-1 和IRS-2 的酪氨酸磷酸化，從而增強Akt信號通路改善胰島素抵抗[30]。

水飛薊賓是一種傳統(tǒng)上用于治療膽囊和肝臟疾病的黃酮寡糖，近年來諸多研究發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可通過改善胰島β細胞的活性，增加肝臟和肌肉細胞的胰島素敏感性以及減少脂肪細胞中的脂質(zhì)沉積來改善血糖[31-33]。此外，水飛薊賓還能有效治療糖尿病并發(fā)癥，包括神經(jīng)病變[34]、視網(wǎng)膜病變、愈合障礙[35]、心肌病、腎病和骨質(zhì)疏松癥等[36-38]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)水飛薊賓可增加C2C12 胰島素抵抗模型葡萄糖消耗量，同時抑制促炎因子TNF-α、IL-1β的分泌，提高抑炎因子IL-10分泌，降低P-STAT3和SOCS3蛋白表達。

綜上所述水飛薊賓可能通過抑制TNF-α、IL-1β炎癥因子分泌，促進抑炎因子IL-10 分泌和調(diào)控STAT3/SOCS3信號通路來改善C2C12細胞胰島素抵抗。