秦 帥 ，秦靈靈 ，吳麗麗 ，張程斐 ，吳呦呦 ，孫伯菊 ，劉銅華 ，＊＊

（1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 成都 610036；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)教育部中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點實驗室 北京 100029；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 北京 100078）

2 型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus, T2DM）在全球的迅速流行使其成為最嚴重、最具挑戰(zhàn)性的健康問題之一。其中T2DM 占所有糖尿病的90%，其發(fā)病的核心病機是胰島素抵抗（Insulin resistance,IR）和胰島β細胞功能障礙[1]。IR是一種病理狀態(tài)，是由于外周組織（如：骨骼肌，肝臟和脂肪）無法有效響應(yīng)正常的胰島素循環(huán)濃度而引起的。作為全世界最主要的慢性非傳染性疾病之一，糖尿病給社會及家庭所帶來的疾病負擔(dān)越來越嚴重，糖尿病及其并發(fā)癥嚴重影響人類的生活及生存質(zhì)量，如何有效防治2 型糖尿病成為當前研究的熱點。

肝臟作為調(diào)節(jié)機體能量代謝平衡的重要器官之一，在調(diào)節(jié)機體糖脂代謝平衡中起重要作用，是胰島素作用的主要靶組織，其在IR 的發(fā)生、發(fā)展中扮演者重要角色。在生理情況下，胰島素可通過促進肝臟對葡萄糖的攝取以及調(diào)節(jié)肝糖原的分解來維持機體血糖的穩(wěn)定。在病理狀態(tài)下，特別是肝臟脂肪變性時導(dǎo)致胰島素抵抗[2，3]，胰島素抑制肝臟糖原分解能力下降，同時對外周葡萄糖的攝取利用減少，肝糖原合成能力減弱，從而導(dǎo)致機體血糖升高。因此，通過調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝，特別是抑制脂質(zhì)在肝臟的沉積可改善胰島素抵抗，進而防治糖尿病。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase, AMPK）是一種廣泛參與多種代謝活動的調(diào)節(jié)激酶，近年來成為研究糖尿病等代謝疾病的重要作用靶點。相關(guān)研究表明AMPK 的激活可抑制肝臟糖異生，減少肝糖原的分解，降低血糖，研究發(fā)現(xiàn)AMPK 有α、β、γ三種亞基，其中 AMPK 的β、γ亞基不參與糖脂代謝的調(diào)節(jié)，而α亞基Thr172 在發(fā)生磷酸化后被激活，參與機體能量代謝的調(diào)節(jié)[4]。過氧化物酶增殖體激 活 受 體γ共 激 蛋 白 1α（Peroxisome proliferatorsactivated receptor-γcoactivator-1α,PGC-1α）能夠激活大鼠肝臟和肝細胞糖異生相關(guān)基因的表達，觀察發(fā)現(xiàn)在T2DM 患者肝臟內(nèi)，PGC-1α蛋白表達增加，PGC-1α可激活肝臟糖異生相關(guān)基因的表達，從而增加肝糖原分解促使肝糖的輸出量增加，升高血糖[5，6]。

青錢柳作為我國民間廣泛飲用的中草藥藥茶，是核桃科菊屬植物。據(jù)《中國中藥資源志要》記載青錢柳葉具有清熱解毒、生津止渴的功效[7，8]，民間主要用于防治肥胖、高血脂、高血糖、脂肪肝等慢性代謝性疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn)青錢柳含多糖、黃酮類、皂苷、三萜等多種生物活性成分[9]，具有降血糖[10]、降血脂、降血壓等藥理作用[11-13]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)青錢柳水提物可通過激活胰島素信號通路抑制過多的能量攝入改善代謝小鼠的肥胖狀態(tài)[14]。但青錢柳對肝臟糖脂代謝的影響及其機制尚不明確。本研究應(yīng)用自發(fā)性2型糖尿病db/db 小鼠觀察青錢柳水提物對肝臟糖脂代謝的影響，并通過檢驗其對AMPK 及PGC-1α的影響來探討其作用機制，為青錢柳防治慢性代謝性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 青錢柳水提物制備

青錢柳干葉購自江西修水縣醉美農(nóng)業(yè)有限公司（批號：20190914）。由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院徐墩海教授鑒定為青錢柳原葉。提取步驟：1 kg 青錢柳干葉加10 倍水（質(zhì)量/體積），用沸水浸泡3 次，每次20 min，收集3次濃縮溶液并在真空冷凍器下干燥得干膏（提取率約為16.5%）。放入4℃冰箱備用，應(yīng)用時取適量粉末溶解于生理鹽水。

1.2 實驗動物

選雄性SPF級自發(fā)性2型糖尿病db/db小鼠30只，4 周齡，體質(zhì)量（30 ± 2）g，同周齡 C57BL/6J 雄性小鼠10 只，均購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司（動物批號：1908160016）。小鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實驗室。飼養(yǎng)環(huán)境及條件：溫度（24±2）℃，濕度（50± 10）%，12 h/12 h 光黑循環(huán)，自由攝食飲水，進食普通飼料。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始灌胃進行后續(xù)實驗。本實驗經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理審查通過。批準編號：BUCM-2019082801-3085。

1.3 試劑及儀器

鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：ABL9900），葡萄糖（Glucose）測定試劑盒（北京索萊寶公司，批號：BC2505），TG、TC 及FFA 試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所）；胰島素放免試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究，批號：HY-10069）；糖原PAS 染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）；蘇木素/伊紅（北京索萊寶公司，批號：G1140、G1100），一抗PAMPK 及 PGC-1α（美國 CST 公司，批號：8208、2178）；二抗（美國CST 公司，批號：0026），BCA 蛋白定量試劑盒（北京solarbio 公司，批號：PC0020）。3K15/10797/9001678型高速低溫離心機（美國Sigma公司），7160型全自動生化儀（日本日立公司），酶標儀（美國Promega公司，型號：E9032），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

準備30 只4 周齡SPF 級雄性自發(fā)性2 型糖尿病db/db 小鼠，以 10 只 C57/BLKS/Jdb/m 同窩雄性小鼠作為正常對照組（Normal 組）。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。當非同日連續(xù)2 次測隨機血糖≥11.1 mmol·L-1作為2 型糖尿病成模條件，并根據(jù)血糖、體質(zhì)量分層隨機法分為3 組，每組10 只，分別為模型組（Control 組）、鹽酸二甲雙胍組（Met 組，0.13 g·kg-1）、青錢柳水提物組（CPAE 組，2 g·kg-1）。其中Normal 組及Control 組給予同等體積的生理鹽水灌胃，固定灌胃時間，每日1次，連續(xù)6周。

2.2 取材及指標檢測

2.2.1 小鼠取材

藥物干預(yù)6 周后取材，小鼠禁食12 h，眼眶取血，室溫靜置30 min，4℃，3500 r·min-1，15 min，抽取上清，用于血清生化指標檢測及FINS 測定。迅速于冰上剖取小鼠肝臟，分置于4%多聚甲醛固定24 h（用于肝臟HE 染色及肝臟糖原含量測定）和凍存管（用于western blot檢測），其中凍存管放置-80℃待用。

2.2.2 一般指標

每周觀察并記錄小鼠一般指標：包括精神、活動情況，毛色、飲食量、體質(zhì)量等。

2.2.3 生化指標及空腹胰島素水平（FINS）檢測

采用比色法測定小鼠空腹血糖（FBG）、甘油三脂（TG）、總膽固醇（TC）、游離脂肪酸（FFA）。采用酶聯(lián)免疫法（Elisa）檢測空腹血清胰島素（FINS），并計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FBG×Fins·22.5-1。

在翻轉(zhuǎn)課堂的實踐中，教師的角色不僅僅是課程內(nèi)容的傳授者，更多則轉(zhuǎn)變?yōu)閷W(xué)習(xí)過程的引導(dǎo)者，學(xué)生則由原來被動的接受者，轉(zhuǎn)變?yōu)榉e極主動的參與者[3]。

2.2.4 肝臟HE染色

對固定的肝臟組織進行常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度5 um。對切片進行常規(guī)梯度脫蠟。脫蠟后，對切片進行復(fù)水。采用蘇木素-伊紅（HE）方法染色，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。染色順序：蘇木精染液染色5 s，1%鹽酸-乙醇分色30 s，純水返藍，伊紅染液5 s，再進行常規(guī)梯度脫水，樹膠封片，光鏡下觀察肝臟病理變化。

2.2.5 肝臟PAS染色

取肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟，雙蒸水沖洗后，浸入0.5%的過碘酸溶液中10 min，雙蒸水沖洗2 次。切片放入Schiff 試劑中顯色15 min，流水沖洗10 min，蘇木素染色液復(fù)染2 min，1%鹽酸-乙醇分化，流水沖洗10 min 返藍，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。光鏡下觀察并拍照，用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析肝糖原含量。

2.2.6 肝臟P-AMPKα及PGC-1α蛋白表達情況

測定肝臟相關(guān)蛋白表達，用全蛋白提取試劑盒提取各組小鼠肝臟蛋白，并用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，調(diào)整各組蛋白濃度至統(tǒng)一濃度。SDSPAGE 凝膠電泳，每孔15 ug，先80 V 預(yù)電泳10 min，再100 V 電泳60 min；半干法凝膠轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜，恒流200 mA 轉(zhuǎn)膜 40 min；用 1 × TBS 搖床室溫洗 3 次，每次 10 min，Blocking one 或 Blocking one-P 室溫封閉 1 h，分別加P-AMPKα、PGC-1α和β-actin（1∶1000 稀釋）4℃孵育過夜。次日回收一抗，用1 × TBST 搖床室溫清洗3次，每次10 min，加二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，回收二抗，用1×TBST 搖床室溫清洗3 次，每次10 min。加超敏發(fā)光液，避光反應(yīng)1 min，凝膠成像系統(tǒng)顯影。用Image J軟件對灰度值進行分析。

表1 青錢柳水提物對小鼠飲食量的影響（，單位：g，n=10）

表1 青錢柳水提物對小鼠飲食量的影響（，單位：g，n=10）

注：與Normal比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與Control組對比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

6周3.29±0.85 8.13±1.07**7.67±0.61 7.80±0.72分組Normal組Control組Met組CPAE組2周3.27±0.24 7.02±0.67**6.94±0.57 7.07±0.88 4周3.34±0.25 8.02±0.64**7.62±0.55 7.73±1.15

表2 青錢柳水提物對小鼠體質(zhì)量的影響（，單位：g，n=10）

表2 青錢柳水提物對小鼠體質(zhì)量的影響（，單位：g，n=10）

注：與Normal比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與Control組對比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

6周22.9±2.31 45.45±4.2**45.05±3.27 43.72±4.43分組Normal組Control組Met組CPAE組0周17.82±1.23 32.49±2.08**32.82±1.94 31.03±2.52 2周19.47±1.92 39.13±3.41**41.71±2.95 39.67±3.31 4周21.56±2.01 42.85±3.6**44.74±2.61 41.18±3.80

2.3 統(tǒng)計方法

3 結(jié)論

3.1 CPAE對小鼠一般情況的影響

對小鼠體質(zhì)量的影響：與Normal 組小鼠比較，隨著小鼠周齡的增加，Control 組小鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜ 0.01）；與Control組相比，Met及CPAE組可減輕小鼠的體質(zhì)量，但無明顯差異（P＞ 0.05）（表2）。

3.2 CPAE對小鼠FBG、TG、TC、FFA的影響

與Normal組小鼠比較，Control組小鼠FBG 明顯升高，且隨周數(shù)增加，F(xiàn)BG 增高愈明顯（P＜ 0.01）；與Control 組相比，Met 及 CPAE 組可降低小鼠 FBG 水平（P＜ 0.01），且隨周數(shù)增加，降糖效果愈明顯（表3）。

與Norma 組小鼠比較，Control 組小鼠TG、TC、FFA水平均明顯升高，且具有極顯著差異（P＜0.01）；與Control組相比，Met可一定程度上降低TG、TC水平，無顯著差異（P＞ 0.05），但可顯著降低 FFA 水平（P＜0.05），CPAE 組TG 水平稍升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），CPAE 組可一定程度降低 TC 水平，無顯著差異（P＞ 0.05），但 CPAE 組可顯著降低 FFA 水平（P＜0.05）（表4）。

3.3 CPAE對小鼠FINS及HOMA-IR的影響

與 Normal 組小鼠比較，Control 組小鼠 FINS 及HOMA-IR 水平均明顯升高（P＜ 0.01），提示Control 組小鼠胰島素抵抗增加；與Control 組相比，Met 及CPAE組可明顯降低FINS 及HOMA-IR 水平，具極顯著差異（P＜ 0.01）（表5），提示CPAE 可改善小鼠胰島素抵抗，提高胰島素敏感性。

3.4 小鼠肝臟HE染色結(jié)果

Normal 組小鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞形態(tài)正常，排列規(guī)則，內(nèi)未見脂質(zhì)沉積；與Normal 組比較，Control 組肝小葉結(jié)構(gòu)較紊亂，肝細胞腫大、變形，排列紊亂，且內(nèi)存在大量脂肪空泡和脂質(zhì)沉積；與Control組比較，Met 及CPAE 組肝小葉結(jié)構(gòu)排列較整齊，Met組肝細胞大小、形態(tài)基本正常，未見明顯脂肪空泡，脂質(zhì)沉積明顯減少，CPAE 組肝細胞大小、形態(tài)明顯改善，其內(nèi)脂肪空泡數(shù)量明顯減少（圖1）。

3.5 小鼠肝臟PAS染色結(jié)果

Normal 組小鼠肝臟PAS 染色糖原呈紫紅色，位于細胞質(zhì)，染色均勻，密度高；與Normal 組相比，Control組肝臟糖原表達密度較低，糖原染色明顯少，且分布不均勻，內(nèi)可見大量脂滴；與Control 組相比，Met 及CPAE 組糖原表達明顯增高，染色增多，分布較均勻，內(nèi)部脂滴量明顯少（圖2、表6）。

3.6 CPAE 對小鼠肝臟 P-AMPKα 及 PGC-1α 蛋白表達的影響

結(jié)果顯示，與Normal 比較，Control 組小鼠肝臟PAMPKα蛋白表達水平明顯下降（圖3），而PGC-1α的表達水平明顯增加（P均 ＜0.01）；與Control 組相比，Met 及 CPAE 組均可增加 P-AMPKα蛋白表達水平，同時降低PGC-1α蛋白表達水平（P均 ＜0.01）（表7）。提示 CPAE 對小鼠肝臟 P-AMPKα及 PGC-1α的蛋白表達具調(diào)節(jié)作用，其調(diào)節(jié)db/db 小鼠肝臟糖脂代謝和改善胰島素抵抗的作用可能是通過調(diào)節(jié)P-AMPKα及PGC-1α蛋白表達來實現(xiàn)。

表3 青錢柳水提物對小鼠FBG的影響（，單位：g，n=10）

表3 青錢柳水提物對小鼠FBG的影響（，單位：g，n=10）

注：與Normal比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與Control組對比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

6周3.14±0.45 18.4±5.70**9.84±3.93##10.50±2.51##分組Normal組Control組Met組CPAE組0周3.44±0.28 9.20±3.43**9.17±3.25 9.17±3.29 2周3.44±0.53 16.31±4.52**11.33±4.13##12.94±2.45##4周3.72±0.52 17.87±5.59**12.40±2.10##13.13±3.78##

表4 青錢柳水提物對小鼠脂代謝的影響（，單位：g，n=10）

表4 青錢柳水提物對小鼠脂代謝的影響（，單位：g，n=10）

注：與Normal比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與Control組對比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

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表5 青錢柳水提物對小鼠FINS及HOMA-IR的影響（，n=10）

表5 青錢柳水提物對小鼠FINS及HOMA-IR的影響（，n=10）

注：與Normal 比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與Control 組對比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

HOMA-IR 1.24±0.16 12.67±2.51**3.93±0.80##4.46±1.24##分組Normal組Control組Met組CPAE組FINS/（uIU·mL-1）8.77±0.60 17.16±1.17**12.05±1.38##13.33±1.28##

圖1 青錢柳水提物對db/db小鼠肝臟形態(tài)影響（n=10，×200）

圖2 青錢柳水提物對db/db小鼠肝糖原合成的影響（n=10，×200）

表6 青錢柳水提物對小鼠肝臟PAS染色面積的影響（，n = 10）

表6 青錢柳水提物對小鼠肝臟PAS染色面積的影響（，n = 10）

注：與Normal比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與Control組對比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

PAS染色面積0.395±0.005 0.184±0.007**0.337±0.006#0.276±0.010#分組Normal組Control組Met組CPAE組

圖3 青錢柳水提物對db/db肝臟P-AMPKα及PGC-1α蛋白表達的影響（n=10）

表7 青錢柳水提物對db/db小鼠肝臟P-AMPKα及PGC-1α蛋白的影響（，n=10）

表7 青錢柳水提物對db/db小鼠肝臟P-AMPKα及PGC-1α蛋白的影響（，n=10）

注：與Normal比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與Control組對比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

PGC-1α/β-actin 0.610±0.023 1.356±0.037**0.693±0.028##0.721±0.045##分組Normal組Control組Met組CPAE組P-AMPKα/β-actin 0.745±0.020 0.470±0.034**0.732±0.028##0.685±0.042##

4 討論

T2DM 是一種與家族遺傳、環(huán)境、生活方式等因素密切相關(guān)的代謝性疾病，以葡萄糖、蛋白質(zhì)、脂類代謝異常為主要特征的代謝綜合征。其核心病機是胰島素抵抗和胰島β細胞功能受損。其中胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）貫穿于T2DM 始終，在T2DM 的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色[15，16]。

肝臟作為機體重要的能量代謝器官，在調(diào)節(jié)機體能量代謝及胰島素抵抗方面起重要作用，其中肝臟糖異生作是葡萄糖代謝重要組成部分。肝臟糖原合成及糖異生在糖代謝的紊亂以及胰島素抵抗中起重要作用，所以抑制肝臟糖異生成為治療糖尿病的主要方法之一，如防治T2DM 常用藥物鹽酸二甲雙胍片、鹽酸吡格列酮片其主要作用機制即抑制肝臟糖異生，增加肝臟、肌肉等組織對葡萄糖的攝取利用，該作用與激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）密切相關(guān)[17]。

已知AMPK 是一種與代謝密切相關(guān)的應(yīng)激蛋白激酶，其廣泛分布于肝臟、脂肪、肌肉等胰島素靶組織中，參與調(diào)節(jié)機體葡萄糖、脂肪及蛋白質(zhì)代謝[18，19]。AMPK在機體高度保守的，其調(diào)控機制較為復(fù)雜，一般認為通過其α亞基Thr172 的磷酸化而激活，進而調(diào)節(jié)與肝臟糖異生相關(guān)因子（如：PGC-1α、FOXO1、HNF-4α相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等）來穩(wěn)定血糖。研究發(fā)現(xiàn)在肥胖2型糖尿病患者或胰島素抵抗動物模型中發(fā)現(xiàn)肝臟、脂肪和肌肉等組織中的AMPK 磷酸化水平下降，而使用AMPK 激活劑后可抑制肝臟糖異生從而降低血糖，同時改善胰島素抵抗[20，21]。在肝臟，AMPK激活后可調(diào)節(jié)下游作用靶點PGC-1α，增強線粒體的呼吸功能，調(diào)節(jié)能量代謝，改善胰島素抵抗[22-24]。說明AMPK 的磷酸化激活在調(diào)節(jié)肝臟糖異生及改善胰島素抵抗中發(fā)揮積極作用。在肥胖、胰島素抵抗或2 型糖尿病患者肝臟PGC-1α高表達，通過調(diào)控磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）等糖異生關(guān)鍵酶的水平增強肝臟糖異生能力，從而升高血糖，在肝臟胰島素抵抗以及脂肪肝的形成過程中起重要作用[25，26]。

本研究發(fā)現(xiàn)與Normal 組比較，Control 組小鼠的飲食量、體質(zhì)量、FBG、TG、TC、FFA 及FINS 水平明顯升高，F(xiàn)INS及HOMA-IR 亦明顯升高，且表現(xiàn)明顯的糖尿病癥狀，而肝臟HE 染色顯示肝臟內(nèi)大量脂質(zhì)沉積，肝細胞腫大、變形，同時PAS 結(jié)果顯示小鼠肝臟肝糖原含量明顯下降，提示小鼠肝臟脂肪變性，肝臟胰島素抵抗明顯，小鼠糖尿病模型造模成功；當給予Met 或CPAE 干預(yù)后，均可一定上程度減少小鼠的飲食量（無統(tǒng)計學(xué)意義），但對小鼠體質(zhì)量無明顯影響，考慮小鼠食物攝入量的減少可能與藥物改善小鼠葡萄糖代謝有關(guān)；無論是Met 還是CPAE 組均可降低小鼠FBG、FINS 及 HOMA-IR 水平，提示 CPAE 可增加小鼠胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗；在脂代謝方面，雖然CPAE 組輕度升高小鼠TG 水平，但可減低TC 和FFA水平；同時抑制脂質(zhì)在肝臟沉積，增加肝臟糖原含量，提高P-AMPKα蛋白表達水平，抑制PGC-1α蛋白表達水平。綜上提示青錢柳水提物可抑制脂質(zhì)在db/db 小鼠肝臟的堆積，抑制糖原分解，增加肝糖原的合成，其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)AMPK/PGC-1α信號通路來實現(xiàn)。