于 健，查 萌，鄭夢(mèng)君，劉小俠

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,北京 100019)

0 引 言

【研究意義】轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因棉花種植后有所好轉(zhuǎn)，但是棉鈴蟲(chóng)在玉米、蔬菜等多種作物上依然常有發(fā)生。生物源農(nóng)藥以其較穩(wěn)定的效果及環(huán)境友好，為棉鈴蟲(chóng)防治提供了一個(gè)選擇?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】白僵菌 (Beauveriabassiana)是應(yīng)用最廣的蟲(chóng)生真菌之一[1]，目前,白僵菌已經(jīng)廣泛運(yùn)用于二斑葉螨Tetranychusurticae、煙粉虱Bemisiatabaci、薊馬Frankliniellaoccidentalis、亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis[2-5]等農(nóng)林害蟲(chóng)防治。在適宜的溫度濕度環(huán)境下，白僵菌分生孢子萌發(fā)后通過(guò)表皮進(jìn)入寄主體腔。菌絲在血腔內(nèi)生長(zhǎng)[6]，產(chǎn)生有毒代謝物導(dǎo)致寄主死亡最終侵入寄主的所有器官，穿出體壁重新產(chǎn)生孢子[7]。其分生孢子和寄主表皮的相互作用涉及到復(fù)雜的專(zhuān)一性和非專(zhuān)一性識(shí)別機(jī)理[8]。綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)和其它病原真菌侵染寄主的大部分過(guò)程一樣[9]，除此之外，綠僵菌中會(huì)形成特殊結(jié)構(gòu)，如附著孢等，同時(shí)分泌各種相應(yīng)的酶，如幾丁質(zhì)酶、蛋白質(zhì)降解酶等,破壞寄主體表侵入體內(nèi)[10, 11]。綠僵菌的菌株產(chǎn)孢能力強(qiáng)且生長(zhǎng)迅速，對(duì)鞘翅目、鱗翅目和雙翅目等 200余種農(nóng)林害蟲(chóng)表現(xiàn)出明顯的致死效果，對(duì)地下害蟲(chóng)尤為有效[12, 13]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前采用綠僵菌防治棉鈴蟲(chóng)研究較少，且2種真菌控制棉鈴蟲(chóng)效果的對(duì)比研究也較缺乏。設(shè)置不同濃度的2種真菌，并通過(guò)不同侵染途徑感染棉鈴蟲(chóng)后，死亡率和體重抑制率?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)不同感染方式，白僵菌和綠僵菌對(duì)棉鈴蟲(chóng)的毒性主要通過(guò)體壁接觸感染還是進(jìn)食感染，設(shè)置濃度梯度，研究最為經(jīng)濟(jì)有效的濃度，為田間應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試?yán)ハx(chóng)

棉鈴蟲(chóng)集于北京郊區(qū)采，在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)害蟲(chóng)綜合實(shí)驗(yàn)室用以麥麩和玉米粉為主的人工飼料飼養(yǎng)至少50代。溫度為(25±1)℃，相對(duì)濕度(75±10)%，光周期16 L∶8 D。

1.1.2 供試藥劑

白僵菌孢子粉(9×1010孢子/g)來(lái)源于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所。

綠僵菌孢子粉(2×1010孢子/g)購(gòu)于鹽城市神微微生物菌種科技有限公司。

1.1.3 其他材料

棉鈴蟲(chóng)人工飼料；非轉(zhuǎn)基因棉花中棉49號(hào)植株。

1.2 方 法

1.2.1 分生孢子懸浮液配制

使用萬(wàn)分之一電子天平分別稱(chēng)取白僵菌孢子粉(9×1010孢子/g)0.833 3、0.083 3和0.008 3 g于3支50 mL離心管中，綠僵菌孢子粉(2×1010孢子/ g)0.025，0.5和0.1 g于3支50 mL離心管中，各加入去離子水至50 mL，旋渦震蕩配制成1.5×108、1.5×107和1.5×106孢子/mL 的白僵菌分生孢子懸浮液和1×107、2×107和4×107孢子/mL 3個(gè)濃度的綠僵菌分生孢子懸浮液。

1.2.2 浸漬法和飼喂法侵染棉鈴蟲(chóng)

取健康生長(zhǎng)一致的棉鈴蟲(chóng)三齡第1 d幼蟲(chóng)分別浸于配制好的白僵菌和綠僵菌不同濃度的分生孢子懸浮液中，浸漬10 s后用無(wú)菌鑷子取出幼蟲(chóng)，置于吸水紙上晾干，再將幼蟲(chóng)放入已裝好飼料的養(yǎng)蟲(chóng)盒中。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)20頭試蟲(chóng)，浸漬無(wú)菌水溶液的棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)為對(duì)照組。

剪取新鮮中棉49號(hào)棉花棉葉消毒后浸于白僵菌和綠僵菌不同濃度的分生孢子懸浮液中，浸漬1 min后取出，置于吸水紙上自然晾干。將葉片剪成大小一致的邊長(zhǎng)為1 cm的正方形葉片，放入裝有健康的生長(zhǎng)一致的棉鈴蟲(chóng)三齡幼蟲(chóng)的養(yǎng)蟲(chóng)盒中，待葉片食盡后再放入人工飼料飼養(yǎng)。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)設(shè)20頭試蟲(chóng)，取食無(wú)菌棉葉的棉鈴蟲(chóng)為對(duì)照組。

將試蟲(chóng)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h觀察幼蟲(chóng)形態(tài)變化，記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)，并取對(duì)照組和處理組各20頭試蟲(chóng)編號(hào)，在對(duì)照組三齡、四齡、五齡、蛹期的第1 d記錄對(duì)照組和處理組編號(hào)試蟲(chóng)的體重。

1.3 數(shù)據(jù)處理

生物測(cè)定數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,運(yùn)用單因素方差分析和Turkey檢驗(yàn)方法，P<0.05即視為有顯著性，同時(shí)用GraphPad Prism軟件繪制圖形。

校正死亡率 (%)=(處理蟲(chóng)口死亡率 -對(duì)照蟲(chóng)口死亡率)/(1 -對(duì)照蟲(chóng)口死亡率 )×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度白僵菌對(duì)棉鈴蟲(chóng)室內(nèi)防控評(píng)價(jià)

2.1.1 感染白僵菌幼蟲(chóng)形態(tài)

研究表明，白僵菌懸浮液浸漬處理的第6 d，幼蟲(chóng)體型隨菌液處理濃度的增加而減小。對(duì)照組棉鈴蟲(chóng)已生長(zhǎng)到五齡初期，而白僵菌孢子濃度為1.5×106孢子/mL組棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)至四齡末期， 1.5×107孢子/mL組棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)至四齡初期，1.5×108孢子/mL組棉鈴蟲(chóng)僅生長(zhǎng)至三齡末期，生長(zhǎng)幾乎停滯，且出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、拒食等現(xiàn)象。

白僵菌分生孢子懸浮液處理第10 d，對(duì)照組棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)已化蛹，處理組白僵菌侵染死亡的幼蟲(chóng)呈現(xiàn)白色僵死狀，體表覆有大量白色菌絲，處理組菌液濃度越高，菌絲覆蓋率越大。圖1，圖2

圖1 白僵菌浸漬法處理第6 d棉鈴蟲(chóng)形態(tài)
Fig.1 Morphology of cuticular infection onH.armigerainfected byB.bassianain the sixth days

圖2 白僵菌浸漬法處理第10 d棉鈴蟲(chóng)形態(tài)
Fig.2 Morphology of cuticular infection onH.armigerainfected byB.bassianain the tenth days

2.1.2 體壁感染白僵菌后對(duì)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)死亡率和體重的影響

研究表明， 1.5×108孢子/mL白僵菌懸液經(jīng)體壁侵染棉鈴蟲(chóng)后校正死亡率為63%，在5 d達(dá)到了最大死亡率，致死效果顯著高于低濃度白僵菌。較低的2個(gè)濃度白僵菌處理間沒(méi)有顯著性差異。與對(duì)照組相比，1.5×108孢子/mL濃度處理后的棉鈴蟲(chóng)體重在四齡和五齡分別衰減了46%和57%，顯著低于對(duì)照組和其他濃度處理。圖3，圖4

圖3 白僵菌浸漬法侵染棉鈴蟲(chóng)的校正死亡率
Fig.3 Corrected mortality of cuticular infection onH.armigerainfectedbyB.bassiana

數(shù)據(jù)代表平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤, 同一齡期，不同濃度根據(jù)單因素方差分析( ANOVA )及Turkey檢驗(yàn)方法顯著性差異分析,柱上不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05);下同
圖4 白僵菌浸漬法侵染下棉鈴蟲(chóng)體重變化
Fig.4 Weight of cuticular infection onH.armigerainfected byB.bassiana

2.1.3 消化道感染白僵菌后對(duì)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)死亡率和體重的影響

研究表明，白僵菌分生孢子懸浮液濃度為1.5×108孢子/mL經(jīng)飼喂法侵染棉鈴蟲(chóng)后校正死亡率最高可以達(dá)到38%，濃度降低后對(duì)棉鈴蟲(chóng)致死率不足30%。不同齡期體重與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異。圖5，圖6

圖5 棉鈴蟲(chóng)飼喂法侵染白僵菌后校正死亡率
Fig.5 Corrected mortality of digestivetract infection onH.armigerainfected byB.bassiana

圖6 白僵菌飼喂法侵染下棉鈴蟲(chóng)體重變化
Fig.6 Weight of digestive tract infection onH.armigerainfected byB.bassiana

2.2 不同濃度綠僵菌對(duì)棉鈴蟲(chóng)的室內(nèi)防控效果

2.2.1 感染綠僵菌幼蟲(chóng)形態(tài)觀察

研究表明，3種不同濃度綠僵菌分生孢子懸浮液處理的6 d，對(duì)照組棉鈴蟲(chóng)為五齡初期，1×107孢子/mL組棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)至四齡末期，2×107孢子/mL組棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)至四齡初期，4×107孢子/mL組棉鈴蟲(chóng)生長(zhǎng)至三齡末期，且體型依次減小。綠僵菌侵染死亡的棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)，體型很小，呈黑色僵死狀，死亡數(shù)天后體壁見(jiàn)白色菌絲。圖7

圖7 不同濃度綠僵菌孢懸液處理第6 d棉鈴蟲(chóng)形態(tài)
Fig.7 Morphology of cuticular infection onH.armigerainfected byM.anisopliaein the sixth days

2.2.2 體壁感染綠僵菌后對(duì)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)死亡率和體重的影響

研究表明，在室內(nèi)條件下綠僵菌分生孢子懸浮液濃度為4×107和2×107孢子/mL經(jīng)體壁侵染棉鈴蟲(chóng)后校正死亡率均可達(dá)70%以上，顯著高于1×107孢子 /mL處理的棉鈴蟲(chóng)。感染綠僵菌后棉鈴蟲(chóng)體重與對(duì)照組相比在四齡、五齡、蛹期均顯著性降低。與對(duì)照相比，4×107孢子/mL濃度處理后的棉鈴蟲(chóng)體重在四齡、五齡、蛹期分別減少了85.56%、95.89%、57.7%，顯著低于其他處理和其他濃度處理。圖8，圖9

圖8 綠僵菌浸漬法侵染棉鈴蟲(chóng)的校正死亡率
Fig.8 Corrected mortality of cuticular infection onH.armigerainfected byM.anisopliae

圖9 綠僵菌浸漬法侵染下棉鈴蟲(chóng)體重變化
Fig.9 Weightof cuticular infection onH.armigerainfected byM.anisopliae

2.2.3 消化道感染綠僵菌后對(duì)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)死亡率和體重的影響

研究表明，4×107孢子/mL的綠僵菌經(jīng)消化道侵染的棉鈴蟲(chóng)校正死亡率為65%， 2×107孢子/mL處理的校正死亡率為50%，致死效果顯著高于1×107孢子/mL處理。感染綠僵菌后不同齡期體重與對(duì)照組相比在四齡和五齡均顯著性降低。蛹期體重降低但差異不顯著。4×107孢子/mL濃度處理后的棉鈴蟲(chóng)體重在四齡、五齡分別減少了66.7%、75.9%，對(duì)棉鈴蟲(chóng)體重抑制效果弱于經(jīng)體壁侵染處理。圖10，圖11

圖10 棉鈴蟲(chóng)飼喂法侵染綠僵菌后校正死亡率
Fig.10 Corrected mortality of digestive tract infection onH.armigerainfected byM.anisopliae

圖11 綠僵菌飼喂法侵染下棉鈴蟲(chóng)體重變化
Fig.11 Weight of digestive tract infection onH.armigerainfected byM.anisopliae

3 討 論

棉花種植業(yè)已經(jīng)成為新疆地區(qū)農(nóng)業(yè)的支柱性產(chǎn)業(yè)[14, 15]，在推動(dòng)我國(guó)經(jīng)濟(jì)高效快速發(fā)展的過(guò)程中起到了很重要的作用[16]。棉鈴蟲(chóng)在20世紀(jì)90年代發(fā)生棉鈴蟲(chóng)大猖獗[17]，轉(zhuǎn)基因棉花快速推廣種植讓棉花生產(chǎn)不再受到棉鈴蟲(chóng)的制約[18, 19]，但是棉鈴蟲(chóng)種群的繁殖潛能巨大，對(duì)新的環(huán)境適應(yīng)能力很強(qiáng)，還可以遠(yuǎn)距離遷飛，同時(shí)很多地區(qū)種植結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致棉鈴蟲(chóng)在玉米[20]、花生[21]、核桃[22]的作物上為害，常常在某地條件適宜時(shí)的時(shí)候快速地大面積暴發(fā)成災(zāi)[23]。

微生物源殺蟲(chóng)劑普遍包括真菌殺蟲(chóng)劑、細(xì)菌殺蟲(chóng)劑和病毒殺蟲(chóng)劑等[24]。其中，因?yàn)檎婢鷼⑾x(chóng)劑對(duì)昆蟲(chóng)的體壁有獨(dú)特的侵染方式，相比于細(xì)菌和病毒殺蟲(chóng)劑來(lái)說(shuō)，真菌殺蟲(chóng)劑的擴(kuò)散能力更強(qiáng)，防治譜更廣。在真菌殺蟲(chóng)劑中，因?yàn)榘捉┚途G僵菌有易培養(yǎng)、致病力強(qiáng)、對(duì)多種害蟲(chóng)防效好的特點(diǎn)。

在試驗(yàn)中，高濃度白僵菌和綠僵菌均表現(xiàn)為經(jīng)體壁侵染棉鈴蟲(chóng)的致死率顯著性高于經(jīng)消化道侵染棉鈴蟲(chóng)的致死率；1.5×108孢子/mL處理第10 d，體壁侵染校正死亡率為63%，消化道侵染校正死亡率僅有38%。其他鱗翅目幼蟲(chóng)也有類(lèi)似現(xiàn)象，1×108孢子/mL白僵菌懸液通過(guò)飼喂侵染小菜蛾(Plutellaxylostella)9 d時(shí)校正死亡率為80.5%[25]。2.3×108孢子/mL白僵菌懸液直接噴灑在小菜蛾體表8 d時(shí)校正死亡率為92.4%[26]；1×109孢子/mL的白僵菌浸漬法處理亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)老熟幼蟲(chóng)第10 d死亡率達(dá)到96.67%[27]。對(duì)白僵菌和綠僵菌侵染甜菜夜蛾(Laphygmaexigua)的組織切片研究中發(fā)現(xiàn)，2種真菌主要通過(guò)體壁侵染，經(jīng)取食進(jìn)入消化道的真菌孢子幾乎不能萌發(fā)[28]。根據(jù)前人研究，鱗翅目昆蟲(chóng)中腸液呈堿性(pH=8.0～10.5)，蛋白酶主要是絲氨酸蛋白酶[29, 30]，糖苷酶主要是淀粉酶和纖維素酶[31]。通過(guò)模擬鱗翅目昆蟲(chóng)中腸環(huán)境觀察白僵菌萌發(fā)情況實(shí)驗(yàn)中，白僵菌分生孢子在堿性中腸環(huán)境下，不僅不利于侵染，一部分會(huì)被消化液殺死[32]。同時(shí)昆蟲(chóng)腸道微生物對(duì)致病真菌侵染也有一定拮抗作用，中腸優(yōu)勢(shì)菌群綠膿桿菌、蠟狀芽孢桿菌等對(duì)綠僵菌有很強(qiáng)拮抗作用[33]。2種真菌通過(guò)體壁侵染棉鈴蟲(chóng)比通過(guò)消化道侵染的校正死亡率更高，體重抑制更好。實(shí)驗(yàn)僅在室內(nèi)條件下研究和評(píng)價(jià)了綠僵菌和白僵菌對(duì)棉鈴蟲(chóng)的控制效果，在服務(wù)田間應(yīng)用之前，還應(yīng)該設(shè)置一系列田間試驗(yàn)，評(píng)價(jià)實(shí)際控制效果，并且在施藥過(guò)程中優(yōu)化用藥體系，探究與其他農(nóng)藥復(fù)配可能性。

4 結(jié) 論

1.5×108孢子/mL的白僵菌和4×107孢子/mL綠僵菌均對(duì)棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)有較好的致死效果和體重抑制效果。1.5×108孢子/mL的白僵菌侵染棉鈴蟲(chóng)三齡幼蟲(chóng)后，到五齡時(shí)經(jīng)體壁侵染比消化道侵染校正死亡率高25%，體重抑制率高57%；4×107孢子/mL綠僵菌侵染棉鈴蟲(chóng)三齡幼蟲(chóng)后，到五齡時(shí)經(jīng)體壁侵染比消化道侵染校正死亡率高8%，體重抑制率高20%。