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抗結核藥物體外藥代動力學/藥效學研究模型的建立及應用

2020-04-07 09:17趙皎潔付雷王彬張蕾胡明豪陸宇
中國防癆雜志 2020年4期
關鍵詞:異煙肼抗結核結核

趙皎潔 付雷 王彬 張蕾 胡明豪 陸宇

結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)引起的一種長期以來威脅人類健康的傳染性疾病。據WHO[1]估算,2018年我國結核病新發(fā)患者約87萬例,僅次于印度,高居全球第2位,其中耐多藥/利福平耐藥結核病患者6.6萬例。由于抗結核藥物的不合理使用造成的治療效果不佳、耐藥菌株的大量出現(xiàn)都對人類造成極大的生命威脅。在這樣的形勢下,我們迫切需要新的、更有效的藥物來縮短和簡化結核病尤其是耐藥結核病長期而復雜的治療過程,并且進一步提高療效。

藥代動力學/藥效學(pharmacokinetics/pharmacodynamics,PK/PD)是將藥物濃度與時間、抗菌作用結合起來,闡明抗菌藥物在特定劑量/濃度和特定給藥方案下抑菌或殺菌效果的時間過程,對有效劑量的選擇和給藥方案的制定有著十分重要的作用。近年來,抗結核藥物PK/PD研究受到高度重視,并取得了重大成就,已被廣泛應用于新藥研發(fā)的全過程,為各期臨床試驗給藥方案的制定、藥物群體量效關系的探索、特殊患者群體和特定患者個體給藥方案的調整等提供支持性數(shù)據,在藥品審評、審批和監(jiān)管決策等方面將發(fā)揮重要作用。

結核分枝桿菌中空纖維模型(hollow-fiber pharmacodynamic model of tuberculosis,HFM-TB)是一種可以模擬在體內的藥代動力學和藥效學過程的體外PK/PD模型。該模型可以承受更高的結核分枝桿菌負荷,模擬極端的給藥劑量,是一個可以動態(tài)觀察藥物對細菌作用的方法。但國內對該模型的研究較少[2]。2019 年筆者在國內首次建立HFM-TB,并對異煙肼的PK/PD參數(shù)及目標靶值進行研究,對模型進行驗證。

資料和方法

一、 實驗菌株

結核分枝桿菌標準菌株H37Rv(ATCC27294)為北京市結核病胸部腫瘤研究所藥物研究室保存的菌株。

二、 實驗藥物

異煙肼[Sigma公司(美國);批號:MKBW9046V;質量:5 g;純度:≥99%]。

三、 儀器與試劑

C3008中空纖維培養(yǎng)筒(美國Fibercell 公司)、Infinite 200多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)、IMH750-S SS恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)、Masterflex蠕動泵(美國Cole-Parmer公司)、雙向泵(美國Fibercell公司)、Micro 21R高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)、安捷倫高效液相色譜(美國安捷倫科技有限公司)、Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(填料粒徑:3.5 μm;色譜柱內徑:2.1 mm;色譜柱長度: 50 mm;美國安捷倫科技有限公司)。肉桂醛(北京伊諾凱科技有限公司;批號:KCDJ915)、7H9液體培養(yǎng)基干粉(美國BD公司;批號:6075662)、7H10培養(yǎng)基干粉(美國BD公司;批號:262710)、Middlebrook OADC增菌液(美國BD公司;批號:212351)、吐溫80(北京索萊寶科技有限公司;批號:301C052)、丙三醇(國藥集團化學試劑有限公司;批號:20180223)。

四、最低抑菌濃度(MIC)測定

Alamar blue法。異煙肼用蒸餾水溶解制成初溶液(儲備液),滅菌后,使其終濃度為10 μg/ml,并進行2倍稀釋11次。選取結核分枝桿菌H37Rv標準株將其培養(yǎng)2~3周的培養(yǎng)物制成菌懸液,接種到含0.05%吐溫80、10% OADC(氯化鈉、牛血清白蛋白、葡萄糖、過氧化氫酶、油酸混和物)營養(yǎng)添加劑的7H9培養(yǎng)基中,37 ℃靜止培養(yǎng)1~2周,生長至濁度為McFarland 1[相當于108菌落形成單位(CFU)/m1]時稀釋接種到含藥的7H9液體培養(yǎng)基(含10% OADC)中,菌液的終濃度為106CFU/ml。實驗設無藥對照,置37 ℃培養(yǎng)7 d后每孔加入20 μl Alamar blue、12.5 μl 20%吐溫80。將添加好指示劑的96孔板37 ℃培養(yǎng)過夜。觀察顏色,并用多功能酶標儀測定96孔板Alamar blue熒光值,計算MIC(MIC值定義為熒光值的抑制≥90%的最低藥物濃度)[3]。

五、HFM-TB的建立

圖1 HFM-TB示意圖

圖2 中空纖維培養(yǎng)筒橫截面示意圖

該模型由中央室、新鮮培養(yǎng)基儲液瓶及廢液瓶3個部分組成。其中中央室由中央儲液瓶、中空纖維培養(yǎng)筒和連接中央貯液瓶和中空纖維反應器的軟管通路構成 (圖1)。在人體中存在于血液中的藥物穿過毛細血管壁到達病灶,與結核分枝桿菌接觸并發(fā)揮作用,該系統(tǒng)正是模擬了這個過程。中空纖維是一種裝在塑料外殼里的毛細半透性管,可以模擬肺部毛細血管 (圖2)。中空纖維腔外的腔隙稱為中空纖維培養(yǎng)筒外腔,結核分枝桿菌即培養(yǎng)于此腔隙。結核分枝桿菌由于體積太大無法通過中空纖維上的孔隙因而無法進入中空纖維內腔。采用蠕動泵將新鮮的培養(yǎng)基從儲液瓶中泵入中央室,將廢液以相同的流率泵出至廢液瓶,保持中央室內培養(yǎng)基總體積不變,使藥物不斷稀釋,藥物濃度隨著時間的延長而逐漸降低,以模擬藥物在體內代謝的過程。培養(yǎng)基在中央室內循環(huán),營養(yǎng)物質(小分子)從中空纖維內腔擴散到外腔。藥物通過注射泵泵入中央室進行給藥,并通過中空纖維上的孔隙彌散進入和排出外腔。在實驗過程中中央室均置于37 ℃孵箱中,以模擬結核分枝桿菌在體內生長時的環(huán)境溫度。

將中央室的容積設置為250 ml,采用慢乙酰化型人群異煙肼的血漿半衰期(t1/2),約為2.2~4.4 h[4]。通過改變培養(yǎng)基進出HFM-TB的流率來控制異煙肼在體內的消除速率。為了模擬4.1 h的半衰期,使用流率公式(流率=中央室容積×ln2/t1/2)進行計算后,將蠕動泵泵入新鮮培養(yǎng)基的流率設置為42.3 ml/h。

六、異煙肼劑量范圍研究

將結核分枝桿菌標準株H37Rv接種到含0.05%吐溫80、10% OADC營養(yǎng)液的7H9培養(yǎng)基中,37 ℃靜止培養(yǎng)14 d至對數(shù)生長期。將菌液接種到不含藥7H10培養(yǎng)基上進行菌落計數(shù),在添加了0.2 mg/L異煙肼的7H10培養(yǎng)基上測定自發(fā)突變頻率。然后取部分菌液進行稀釋,向6個系統(tǒng)中每個中空纖維培養(yǎng)筒內接種15 ml終濃度為1×106CFU/ml的菌液。

接種后24 h開始給藥,實驗模擬了0、25、50、150、300和1200 mg/d的異煙肼劑量的血清濃度時間分布(表1)。

表1 異煙肼給藥劑量與模擬Cmax表

選擇這些劑量是為了能夠測試劑量范圍更充足,考慮到急性攝入1500 mg的異煙肼對患者是不安全的,所以本次實驗設定了1200 mg作為最高劑量。給藥每日1次,共給藥7次。

在異煙肼給藥后的48 h內對每個HFM-TB的中央隔室采樣14次,測定7H9液體培養(yǎng)基中異煙肼濃度,以驗證系統(tǒng)可以達到預期的血藥濃度時間分布。在次日給藥前采集中空纖維培養(yǎng)筒外腔的結核分枝桿菌培養(yǎng)液1 ml,以離心半徑8.6 cm,8000 r/min 離心10 min,棄800 μl上清,再加入800 μl 生理鹽水,以減少異煙肼殘留。將處理好的菌液接種在不含藥7H10培養(yǎng)基上進行菌落計數(shù),接種在含0.2 mg/L 異煙肼的7H10培養(yǎng)基上測定耐藥發(fā)生情況。

七、異煙肼濃度測定

1. 樣品前處理方法:取400 μl樣品,加入800 μl濃度為50 μg/ml的丙硫異煙胺-乙腈溶液,渦旋振蕩3 min,充分混勻后,以離心半徑8.6 cm,14 000 r/min離心10 min。取1 ml上清經氮吹濃縮后加入60 μl 0.5%肉桂醛甲醇溶液,超聲溶解。于60 ℃水浴鍋中衍生化反應30 min。以離心半徑8.6 cm,14 000 r/min 離心10 min,取上清置于高效液相色譜進樣瓶中。

2.高效液相色譜檢測方法: 設置進樣體積6 μl,流動相流率0.22 ml/min,流動相比例B(乙腈)∶C(10 mmol乙酸銨-水溶液,pH=5)=25∶75;檢測波長:335 nm;色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(填料粒徑:3.5 μm;色譜柱內徑:2.1 mm;色譜柱長度:50 mm)。

八、PK/PD參數(shù)計算方法

使用PKSolver[5]以及GraphPad軟件進行PK/PD 參數(shù)的計算,以及圖像繪制。

結 果

一、HFM-TB中PK參數(shù)

將取得的7H9培養(yǎng)基樣本中的異煙肼濃度進行測定,根據獲得的結果繪制HFM-TB中異煙肼給藥后達到的藥物濃度-時間曲線圖,如圖3所示。實驗中HFM-TB內異煙肼測定濃度與預測濃度的擬合直線公式為y=0.99x-0.07,斜率為0.99,r2>0.99。因此系統(tǒng)中達到的異煙肼濃度與預測值相同(圖4)。

圖3 HFM-TB中異煙肼藥物濃度-時間曲線

圖4 異煙肼藥物濃度預測值與實測值準確度關系

二、異煙肼對H37Rv結核分枝桿菌標準菌株MIC及自發(fā)突變頻率測定結果

異煙肼對H37Rv的MIC為0.038 mg/L。本實驗所用菌株對0.2 mg/L異煙肼耐藥的自發(fā)突變頻率為2.2×10-5。

三、不同異煙肼給藥劑量對結核分枝桿菌作用結果

圖6 第2天異煙肼劑量與殺菌作用關系圖

如圖5所示,在異煙肼給藥前每個HFM-TB中的初始菌量為(6.06±0.07) lg CFU/ml。在整個實驗過程中,對照組的菌量始終處于上升的階段。在給藥第3天后各劑量組總菌量幾乎不再降低,隨著治療時間的延長而菌量出現(xiàn)回升的現(xiàn)象。當異煙肼的早期殺菌作用停止時,25~1200 mg/d組的剩余菌量分別為5.63、4.57、4.03、3.76、3.60 lg CFU/ml,并沒有降至“0”。

四、 異煙肼早期殺菌活性(early bactericidal activity,EBA)及耐藥情況

圖5 不同給藥劑量下結核分枝桿菌菌量隨時間變化曲線圖

由于給藥3 d后早期殺菌作用幾乎停滯,故采用各組異煙肼給藥劑量和治療前2天的結核分枝桿菌總菌量進行計算。利用抑制效應的Sigmoid Emax模型對異煙肼的給藥劑量與早期殺菌作用效果關系進行模擬,本研究采用的是Hill模型:E=Econ-{Emax×(C)H/[(C)H+(C50)H]},其中E為某時間點結核分枝桿菌菌量,Econ為對照組菌量,C為異煙肼暴露濃度,C50為50%最大殺菌效應時的異煙肼暴露量,H為Hill常數(shù)。結果如圖6所示。

早期殺菌效應曲線下降最明顯的部分發(fā)生在25~150 mg/d的劑量范圍內,而在150~1200 mg/d的劑量范圍內殺菌作用基本停止,隨著劑量提高殺菌效果并沒有明顯提高。

圖7 第7天總菌量和0.2 mg/ml異煙肼耐藥菌量與給藥劑量作用關系圖

由于在實驗后期,菌量出現(xiàn)回升,所以對HFM-TB內的結核分枝桿菌耐藥性進行評估,以分析導致菌量增加可能的原因。經過7 d的給藥,HFM-TB內對照組的結核分枝桿菌耐藥率為1.92×10-5,與第0天相比沒有太大差異。而與對照組相比,所有異煙肼處理的HFM-TB的耐藥率均有較大升高,50~1200 mg/d劑量組結核分枝桿菌耐藥菌群在所有菌群中所占比例≥39%,尤其在異煙肼劑量為150、300 mg/d時分別為4.6×10-1和4.9×10-1(圖7)??偩康纳仙赡苁悄退幘旱木吭鲩L導致的。

五、異煙肼抗H37Rv的PK/PD參數(shù)計算結果

A:游離藥物峰濃度與MIC的比值(Cmax/MIC);B:游離藥物的血漿藥物濃度-時間(0~24 h)曲線下面積(AUC0~24)與MIC的比值(AUC0~24/MIC);C:游離的藥物濃度高于MIC的時間占給藥間期的百分比(% TMIC)圖8 給藥第2天各PK/PD參數(shù)與殺菌作用關系圖

同上根據Hill模型,對3個PK/PD參數(shù)與異煙肼殺菌作用效果的關系進行模擬。從圖8可以看出,在給藥第2天3條曲線中游離藥物的血漿藥物濃度-時間(0~24 h)(AUC0~24)/MIC與殺菌作用關系擬合效果最好,r2值最高為0.995。擬合曲線公式為lg CFU/ml=6.62-[3.02×(AUC0~24/MIC)1.213/[(AUC0~24/MIC)1.213+52.231.213]。其中Emax為3.02 CFU/ml,半最大效應濃度(EC50)為AUC0~24/MIC=52.23。除此之外,其赤池信息量準則(Akaike information criterion,AIC)值也最低(為-15.18)。所以認為AUC0~24/MIC是與異煙肼殺菌作用效果擬合最好的PK/PD參數(shù)。

討 論

抗結核藥物PK/PD研究貫穿于抗結核藥物研發(fā)的各個階段,PK/PD參數(shù)的確定已經成為新型抗結核藥物開發(fā)過程中的重要組成部分[6]。臨床前PK/PD模型是評價單獨使用不同劑量的抗結核藥物或與其他抗結核藥物聯(lián)合使用的療效的有力工具。主要的PK/PD參數(shù)有Cmax/MIC、AUC0~24/MIC、%TMIC,在新藥開發(fā)的臨床階段PK/PD研究的數(shù)據可用于蒙特卡羅模擬,以預測抗結核藥物的最佳劑量,防止耐藥性出現(xiàn),并建立敏感性斷點[7]。為最佳的給藥方案提供參考,并可以更好地預測藥物開發(fā)項目成功與否[8-9]。

PK/PD研究分為非臨床階段和臨床階段兩部分,而非臨床研究又包括體外PK/PD研究和實驗動物體內PK/PD研究。體外PK/PD模型主要包括擴散模型和稀釋模型,中空纖維系統(tǒng)模型是一種常用的擴散模型。體外PK/PD研究可以借助一些體外裝置來模擬藥物在體內的藥代動力學和藥效學過程,中空纖維系統(tǒng)就是其中一種模型。由于具有多種優(yōu)點,與動物模型相比,體外模型更適合于測試和鑒定藥物的時間或濃度依賴性。除此之外,與其他臨床前模型相比,HFM-TB模型的獨特之處是可以發(fā)現(xiàn)耐藥性的出現(xiàn),研究中得到的與耐藥性抑制相關的濃度可用于設計更有效的劑量方案[10]。HFM-TB作為藥物開發(fā)工具被歐洲藥品管理局認可,得到的實驗數(shù)據可以用于臨床申報[11]。

體外中空纖維模型PK/PD研究中需要依據不同給藥劑量在體內的血漿濃度進行PK參數(shù)的模擬,根據藥物半衰期計算并設置新鮮培養(yǎng)基及廢液的流出速度。于給藥后48 h內進行PK樣品的取樣,可根據藥物的代謝特點進行取樣時間的設置,在給藥前期由于藥物濃度變化較快,應該增大取樣密度。由于藥物是存在于7H9液體培養(yǎng)基中,所以在PK樣品取樣結束后應盡快進行藥物濃度測定,以防止藥物結構不穩(wěn)定而發(fā)生降解。目前的研究是以假設血漿濃度與藥物作用位點濃度相似為前提,然而在大多數(shù)情況下體內效應位點濃度很難確定,這可能是本模型的局限性之一。

異煙肼在抗結核藥物中具有最強的EBA[12],是抗結核治療中最常用的抗結核藥物,對其相關研究也較多。故本實驗采用異煙肼作為實驗藥物對構建的HFM-TB 模型進行驗證。臨床上患者行抗結核治療的前2~5 d內,聯(lián)合治療方案中的EBA主要來源于異煙肼對對數(shù)生長期結核分枝桿菌的殺菌作用[13-14]。在本研究中,異煙肼導致的結核分枝桿菌菌量的降低與在人體中EBA停止的時間點是相似的。但是即便在給藥第3天異煙肼EBA結束后,系統(tǒng)內仍然存在未被殺滅的結核分枝桿菌。在最初的3 d內,敏感菌群被迅速殺滅導致細菌總數(shù)的降低。隨著給藥時間的延長,藥物誘導產生的耐藥菌群不斷增殖,所以在給藥第4天之后,各劑量組的菌量先后產生了不同程度的回升。除此之外,從圖5看出,在給藥7 d后,50~1200 mg/d劑量組結核分枝桿菌耐藥率明顯上升,耐藥菌群在所有菌群中占比≥39%。因此,我們推斷,異煙肼殺菌作用的停止在很大程度上是由耐藥性的出現(xiàn)引起的,而這也與其他幾種體外藥敏試驗中發(fā)現(xiàn)的結果一致[15-16]。體外測定細菌對藥物的自發(fā)突變頻率,一般采用靜態(tài)系統(tǒng)。然而Srivastava等[17]的研究證明,由于適應性進化的一般原則,與暴露于靜態(tài)系統(tǒng)中相比,動態(tài)系統(tǒng)更有可能引發(fā)耐藥性的產生。這也解釋了本研究采用的HFM-TB在較短時間引起明顯耐藥的原因。有研究表明,抗結核藥物、氧化應激和其他環(huán)境應激導致的不穩(wěn)定的表型突變可能比穩(wěn)定的基因型突變更常見[18-19],治療早期在外排泵的作用下,結核分枝桿菌對異煙肼表現(xiàn)出了耐受性或表型抗性,為其復制贏得了時間,直到特定基因發(fā)生突變[20]。所以本研究后續(xù)還應對耐藥菌株進行基因測序,以確定耐藥頻率較高的根本原因。

EBA的臨床研究表明,劑量-效應曲線斜率最大的部分位于0~150 mg/d之間[21],這與我們在HFM-TB中觀察到的結果是相同的(圖4)。但當劑量>150 mg/d時,隨著給藥劑量的增加,早期殺菌效果并沒有大幅度提高。本研究中,在7 d給藥治療的早期階段與異煙肼對結核分枝桿菌的殺菌作用最相關的PK/PD參數(shù)是AUC0~24/MIC。這與Jayaram等[22]使用結核分枝桿菌小鼠氣溶膠感染模型的研究結果相似。對于結核病患者,異煙肼的AUC與EBA有很強的相關性[23],這也從另一個方面驗證了本實驗模型的構建成功。本次實驗給藥前2 d的Emax為3.02 CFU/ml,EC50為AUC0~24/MIC=52.23。而之前研究的參數(shù)估計為61.6[24],與本研究稍有差異,這種差異可能是由于測試菌對異煙肼(結核分枝桿菌減毒株H37Ra與結核分枝桿菌標準菌株H37Rv)敏感性的差異,或進行參數(shù)計算時采用的數(shù)據時間點不一致造成的。

本研究是在引進HFM-TB裝置的條件下,進行了異煙肼抗結核分枝桿菌標準菌株H37Rv的體外PK/PD研究,確定了PK/PD靶值,通過與國外實驗結果對比,驗證了HFM-TB的構建成功。本研究首次在國內建立該模型,可以為后續(xù)國內抗結核新藥早期的PK/PD研究奠定基礎并提供方法學參考。

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